СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЕЩЕСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО АНТИОКСИДАНТНЫМ ДЕЙСТВИЕМ Российский патент 2003 года по МПК A61K31/357 A61K35/78 A61P39/06 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, в частности к производству лекарственных средств в виде субстанций и индивидуальных биологически активных соединений (БАС), и касается способа получения 2,3-дегидросилибина из плодов расторопши пятнистой [Silybum marianum (L.) Gaertn.].

В фармацевтической технологии известны способы получения лекарственных средств и субстанций на основе суммы БАС (карсил, силибор, силимар, силимарин и др. ), а также индивидуальных веществ из плодов расторопши пятнистой [7, 16-21, 24, 27, 34, 47, 49], однако недостатком известных способов является сложность технологического процесса и низкий выход целевого продукта. Кроме того, до настоящего времени как в отечественной, так и зарубежной литературе [5-7, 20, 26, 42, 46, 50] подчеркивалась прежде всего значимость трех основных компонентов плодов расторопши пятнистой - силибина, силидианина и силикристина, которые определяют гепатопроекторные, антиоксидантные, мембраностабилизирующие свойства препаратов на основе сырья данного растения до настоящего времени как в отечественной, так и зарубежной литературе [5-7, 22-24, 26, 29-33, 44-50]. Именно это стало основанием для разработки целой серий очищенных препаратов на основе суммы вышеперечисленных флаволигнанов, получившей название "Силимарин". Для целей стандартизации плодов расторопши пятнистой и отечественных препаратов на основе этого сырья нами предложено использовать силибин в качестве государственного стандартного образца [8-11, 14, 15].

За прототип изобретения нами взят способ получения 2,3-дегидросилибина из плодов расторопши пятнистой [28], однако выделение этого вещества осуществляется с использованием громоздкой технологии, заключающейся в последовательной экстракции сырья (2,0 кг) петролейным эфиром, бензолом, этиловым спиртом, упаривании спиртового извлечения, хроматографировании полученного остатка на силикагеле (элюент - бензол-этилацетат, 1:1), последующем рехроматографировании полученной смеси веществ на силикагеле (элюент - бензол-этилацетат, 3: 1) и очисткой сырого дегидросилибина (0,3 г) методом кристаллизации из метанола с выходом целевого вещества 0,2 г или 0,01% от воздушно-сухого сырья. Данный способ является не только громоздким, но и дает низкий выход целевого вещества 2,3-дегидросилибина. Кроме того, на стадии экстракции сырья используются такие опасные растворители, как петролейный эфир и бензол.

Целью изобретения является увеличение выхода целевого продукта, обладающего антиоксидантным действием.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве экстрагента используют 80% этиловый спирт, позволяющий исчерпывающе извлекать целевой продукт 2,3-дегидросилибин (1) из плодов расторопши пятнистой с последующим хроматографическим разделением экстрактивных веществ на полиамиде и силикагеле

Проведенный заявителем поиск по научно-техническим и патентным источникам информации и выбранный из перечня аналогов прототип [28] позволили выявить отличительные признаки в заявленном техническом решении. Следовательно, заявляемый способ получения удовлетворяет критерию изобретения "новизна".

Проведенный заявителем дополнительный поиск известных технических решений [1-4, 7, 13-25, 27, 35-41, 43, 47, 49] с целью обнаружения в них признаков, сходных с признаками заявляемого способа получения, показал, что эти признаки отсутствуют, следовательно, заявляемое техническое решение удовлетворяет критерию "изобретательский уровень".

Исследование антиоксидантного действия флаволигнанов плодов расторопши пятнистой (2,3-дегидросилибин, силибин) и экстракта расторопши жидкого проведено на крысах, у которых под наркозом удалялась печень и из нее готовили гомогенат в стеклянном гомогенизаторе при температуре +1^oС на 0,05 М фосфатном буфере. Во всех сериях опытов гомогенат был взят от одной крысы, разведен на пять порций, которые и были использованы в пяти сериях опытов по девять проб в каждой, что позволяло сравнивать результаты всех серий опытов с достаточно высокой степенью достоверности. Во всех пробах определялась концентрация малонового диальдегида (МДА) по реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) по методике О.Н. Коробейникова [12]. К 0,5 мл печеночного гомогената добавлялось 5 мл 20% раствора фосфорновольфрамовой кислоты. Смесь оставляли на холоде до образования крупных хлопьев, затем центрифугировали. Надосадочную жидкость сливали, к осадку добавляли 2 мл дистиллированной воды и 1 мл раствора ТБК, который готовили путем растворения 80 мг ТБК в 5 мл ледяной уксусной кислоты. Пробы инкубировали в кипящей водяной бане в пробирках при температуре 99-100^oС. Пробирки охлаждали, центрифугировали 10 мин при 8000 об/мин, затем фотометрировали на спектрофотометре при длине волны 535 нм и при длине 580 нм.

Расчет производили по формуле, предложенной автором статьи [12]
C = 0,21+26,5ΔД,
где С - концентрация МДА в нмоль/мл гомогената печени;
ΔД - оптическая плотность при длине волны 535 нм за вычетом плотности при длине волны 580 нм.

Проведены пять серий опытов. В первой серии опытов определялось перекисное окисление липидов в гомогенате печени без добавления каких-либо веществ. Оно составило 2,80±0,064 нмоль/мл гомогената. Перекисное окисление в гомогенате печени во второй серии опытов было повышено добавлением FeSO₄ в конечной концентрации 0,076 мг/мл (0,5 мМ). Таким образом нами был создан исходный фон повышенного перекисного окисления липидов с добавлением признанного стимулятора этого процесса - сульфата железа (II). Этот фон и служил контролем для последующих опытов. В следующей третьей серии опытов в пробирки добавляли силибин в конечной концентрации 2 мМ/л, в четвертой серии опытов к гомогенату печени добавляли дегидросилибин также в конечной концентрации 2 мМ, в пятой серии опытов к гомогенату печени, также как и в предыдущих сериях опытов, добавляли сульфат железа, а кроме того, и экстракт расторопши в таком количестве, чтобы суммарное содержание в среде силибина и дегидросилибина, содержащихся в экстракте, было 2 мМ/л. Результаты исследований приведены в таблице.

Таким образом, силибин, дегидросилибин и экстракт расторопши, содержащий в своем составе оба вещества (протокол исследования антиоксидантного действия веществ и препарата прилагается), обладают выраженным антиоксидантным действием. Антиоксидантная активность дегидросилибина выявлена впервые и на 14,0% выше таковой силибина, относящегося к основным биологически активным соединениям силимарина и других препаратов плодов расторопши пятнистой.

Заявляемый способ иллюстрируется следующим примером.

Пример 1. 200,0 г измельченных плодов расторопши пятнистой [Silybum marianum (L. ) Gaertn.] заливают 80% этиловым спиртом в соотношении 1:10 и настаивают в течение 24 ч, затем экстракцию сырья осуществляют 80% этиловым спиртом при нагревании в течение 30 мин 2 раза. Объединенное водно-спиртовое извлечение упаривают под вакуумом до водного остатка, который затем наносят на слой полиамида и элюируют водой и затем смесью растворителей вода - этиловый спирт с возрастанием концентрации последнего. Целевой продукт элюируют 40% этиловым спиртом. Последующее хроматографическое разделение экстрактивных веществ осуществляют на силикагеле L 40/100 с использованием градиентной элюентной смеси хлороформ - этиловый спирт в различных соотношениях (100:0,98:2,97:3,95:5,93:7), что приводит к получению сырого целевого продукта (0,5 г). Окончательную очистку целевого продукта осуществляют кристаллизацией из водного спирта. Выход целевого продукта - индивидуального 2,3-дегидросилибина составляет 0,2 г или 0,1% от массы воздушно-сухого сырья.

Спектральные и физико-химические свойства 2,3-дегидросилибина (1):
Кристаллы желтого цвета состава С₂₅Н₂₀О₁₀ (M⁺ 480) с т. пл. 253-255^oС. УФ-спектр: λ_max 267,365 нм. ¹Н-ЯМР-спектр в дейтероацетоне (200 МГц): 12,15 (с, 5-ОН), 9,74 (уш. с, 7-ОН), 7,87 (д.2,1 Гц, Н-2¹), 7,17 (дд, 8,3 и 2,1 Гц, Н-6¹), 7,8-6,9 (м, 4Н-Аr), 6,60 (д, 2,1 Гц, Н-8), 6,28 (д, 2,1 Гц, Н-6), 5,06 (д, 8,06 Гц, Н_A), 4,24 (м, Н_В), 3,88 (с, 3Н, СН₃О), 3,80 (дд, 12,5 и 3,5 Гц, Н_C), 3,55 (дд, 12,5 и 4,3 и Гц, Н_D).

Пример 2. 200,0 г измельченных плодов расторопши пятнистой заливают 80% этиловым спиртом в соотношении 1:9 и настаивают в течение 24 ч, затем экстракцию сырья осуществляют 80% этиловым спиртом при нагревании в течение 30 мин 2 раза, Далее технологический процесс осуществляют в соответствии с примером 1.

Выход целевого продукта - индивидуального 2,3-дегидросилибина составляет 0,2 г или 0,09% от массы воздушно-сухого сырья.

Пример 3. 200,0 г измельченных плодов расторопши пятнистой заливают 80% этиловым спиртом в соотношении 1:11 и настаивают в течение 24 ч, затем экстракцию сырья осуществляют 80% этиловым спиртом при нагревании в течение 30 мин 2 раза. Далее технологический процесс осуществляют в соответствии с примером 1.

Выход целевого продукта индивидуального 2,3-дегидросилибина составляет 0,2 г или 0,1% от массы воздушно-сухого сырья.

Изучение запредельных параметров, а именно использование хроматографии и рeхроматографии на одном и том же сорбенте - на полиамиде или силикагеле - не приводит к получению целевого продукта, а осуществление экстракции 75 и 85% этиловым спиртом, а также в соотношении сырье-экстрагент (1:8) приводит к снижению выхода 2,3-дегидросилибина до 0,6, 0,7 и 0,75% соответственно.

Следовательно, оптимальными параметрами способа получения являются экстракция 80% этиловым спиртом в соотношении сырье-экстрагент в интервале 1: 8-1:10 с последующим хроматографическим разделением экстрактивных веществ на полиамиде и силикагеле и кристаллизацией целевого продукта из водного спирта.

Таким образом, использование заявляемого способа получения 2,3-дегидросилибина дает следующие преимущества:
1. Использование в заявляемом способе 80% этилового спирта позволяет исчерпывающе извлекать целевой продукт (2,3-дегидросилибин) из плодов расторопши пятнистой.

2. Заявляемый способ позволяет в 9-10 раз увеличить выход целевого продукта из плодов расторопши пятнистой по сравнению с прототипом.

3. Заявляемый способ позволяет по-новому трактовать вклад БАС препаратов на основе плодов расторопши пятнистой, что, в свою очередь, создает предпосылки для формирования новой концепции создания лекарственных средств на основе сырья данного растения, заключающейся в учете антиоксидантных свойств 2,3-дегидросилибина и, следовательно, в необходимости коррекции традиционных технологий, предполагающих получение очищенной силимариновой суммы.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности. Для экстракции плодов расторопши пятнистой используют 80% этиловый спирт при отношении сырье:экстрагент 1:9-1:10. При последовательном хроматографическом разделении экстрактивных веществ на полиамиде и силикагеле с использованием градуентной элюентной смеси вода - этиловый спирт и хлороформ - этиловый спирт - соответственно в отношениях 100:0; 98:2; 97:3; 95:5; 93:7 получают целевой продукт после кристаллизации. Изобретение позволяет увеличить выход целевого продукта. 1 табл.

Способ получения 2,3-дегидросилибина из плодов расторопши пятнистой (Silybum marianum (L.) Gaertn.), включающий экстракцию органическими растворителями, в том числе этиловым спиртом, хроматографическое разделение и кристаллизацию, отличающийся тем, что способ осуществляют с использованием 80% этилового спирта при отношении сырье - экстрагент 1:9-1:10 и последовательного хроматографического разделения сначала на полиамиде с использованием элюентной смеси вода - этиловый спирт и затем на силикагеле с использованием смеси хлороформ - этиловый спирт соответственно в отношениях 100:0,98,:2,97: 3,95:5,93:7.