СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СМЕСИ D-ПАНТОТЕНОВОЙ КИСЛОТЫ И ЕЕ СОЛЕЙ И СОСТАВ, ПОЛУЧЕННЫЙ ДАННЫМ СПОСОБОМ, В КАЧЕСТВЕ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2007 года по МПК C12P13/00 A23K1/00 

Представленное изобретение касается усовершенствованного способа получения D-пантотеновой кислоты и/или ее солей и их использования в качестве добавок при производстве кормов для животных.

В качестве исходного продукта при биосинтезе коэнзима А в организме растений и животных широко используется D-пантотенат. В отличие от людей, которые в достаточном количестве получают пантотеновую кислоту с пищей, как у растений, так и у животных часто наблюдается нехватка в организме D-пантотената. Возможность получения D-пантотената представляет, таким образом, значительный экономический интерес, в особенности при производстве корма для животных.

Традиционным способом получения D-пантотената является химический синтез из D-пантолактона и β-аланината кальция (Ulimann′s Encyctopedia of Industrial Chemistry, 6^th edition, 1999, electronic release, Kapitel "Vitamins"). Для получения D-пантолактона требуется дорогостоящее, классическое разделение рацемата соли на диастереомеры. Продуктом, получаемым в результате такого химического синтеза, является главным образом кальциевая соль D-пантотеновой кислоты - D-пантотенат кальция.

По сравнению с химическим синтезом преимущество биотехнологического способа получения D-пантотената с использованием микроорганизмов заключается в селективности (энантиомерной чистоте) получаемой D-формы пантотеновой кислоты, пригодной для употребления высшими организмами. При этом из технологического процесса исключается дорогостоящая операция по разделению рацемата, которая требуется при химическом синтезе продукта.

Известно множество способов ферментационного получения D-пантотеновой кислоты с использованием микроорганизмов, описанных, в частности, в патенте США US 6,013,492, международных заявках на патент WO 96/33283, WO 97/10340, немецкой заявке на патент DE 19846499, европейских заявках на патент ЕР 0590857, ЕР 001027, ЕР 1006189, ЕР 1006192 и ЕР 1006193.

Так, в европейских заявках на патент ЕР 1 006 189 и ЕР 1001027 описывается способ получения пантотената, при котором содержание D-пантотеновой кислоты в ферментационном растворе составляет не более 1 г/л. Столь низкое содержание D-пантотеновой кислоты в ферментационном растворе, что составляет менее 10% мас. относительно содержания твердого вещества, непригодно для промышленного производства добавок к корму для животных, содержащих D-пантотеновую кислоту. Другим недостатком существующих в настоящее время способов является то, что выделение продукта из ферментационной среды требует проведение множества дорогостоящих технологических процессов. Способ получения данного продукта в промышленном масштабе пока неизвестен.

В немецкой заявке на патент DE 10016321 описывается способ ферментационного получения добавок к корму для животных, содержащих D-пантотеновую кислоту. Существенный недостаток этого способа заключается в том, что как и в вышеупомянутых способах ферментационного получения D-пантотеновой кислоты, для промышленного производства требуемого продукта микроорганизму требуется добавление в ферментационную среду предшественника пантотеновой кислоты β-аланина.

Кроме того, в патенте США US 6,013,492 и международной заявке на патент WO 96/332839 описывается выделение D-пантотеновой кислоты из ферментационного раствора путем отфильтровывания нерастворимых компонентов (например клеточного материала) из культуральной среды, адсорбирования фильтрата на активированном угле, последующего элюиования D-пантотеновой кислоты органическим растворителем, предпочтительно метанолом, нейтрализации гидроксидом кальция и затем кристаллизации D-пантотената кальция. Существенными недостатками этого способа являются потери ценного продукта, имеющие место при кристаллизации, а также использование органических растворителей, которые трудно отделяются от продукта и требуют дорогостоящей регенерации.

В европейской заявке на патент ЕР 0590857 описывается способ ферментационного получения D-пантотеновой кислоты, при котором культивирование микроорганизма требует добавления в ферментационную среду β-аланина. Ферментационный раствор сначала фильтруют для отделения клеточной массы, затем пропускают через колонку с катионообменной смолой и в завершение через колонку с анионообменной смолой, сразу же после чего нейтрализуется гидроксидом кальция, выпаривается, смешивается с активированным углем, еще раз фильтруется и после добавления, метанола и хлорида кальция кристаллизируется. Полученный продукт, содержащий пантотенат кальция имеет в своем составе помимо D-пантотеновой кислоты в виде солей кальция также хлорид кальция в молярном соотношении 1:1. Для снижения содержания хлорида кальция требуется электродиализ с последующей распылительной сушкой. Недостатком этого способа является необходимость проведения множества дорогостоящих технологических процессов и использования органических растворителей, что снижает ценность данного метода как с экономической, так и с экологической точки зрения.

Задача представленного изобретения заключается в производстве добавок к корму для животных, содержащих D-пантотеновую кислоту и/или ее соли, с использованием усовершенствованного способа получения D-пантотеновой кислоты и/или ее солей, лишенного недостатков вышеупомянутых способов. При этом из экономических соображений наиболее желательным является способ, при котором добавление β-аланина значительно снижается или вообще не требуется. Кроме того, желательно получение D-пантотеновой кислоты в виде ее двухвалентных солей, прежде всего, в виде солей щелочноземельных металлов, поскольку двухвалентные соли пантотеновой кислоты обладают меньшей гигроскопичностью, чем одновалентные соли, и при дальнейшем использовании, например, в качестве добавок при производстве кормов для животных, в меньшей степени подвержены агглютинации.

Эта задача предпочтительным образом решается в рамках представленного изобретения.

Объектом представленного изобретения является способ получения D-пантотеновой кислоты и/или ее солей, характеризующийся тем, что

а) используют, по меньшей мере, один организм, продуцирующий D-пантотеновую кислоту, в котором нарушена регуляция биосинтеза пантотеновой кислоты-(pan) и/или изолейцина/валина-(ilv), и который в процессе ферментации в культуральной среде производит, по меньшей мере, 2 г/л соли D-пантотеновой кислоты, причем в культуральную среду добавляют 0-20 г/л свободного β-аланина и/или солей β-аланина,

b) ферментационный раствор, содержащий D-пантотенат, под воздействием электрического поля пропускают через одну или несколько ионоселективных мембран, в результате чего низкомолекулярные ионы удаляются из содержащего D-пантотенат

c) раствора, содержащего свободную D-пантотеновою кислоту, добавлением кальциевых и/или магниевых оснований доводят до значений 5-10, при этом получают раствор, содержащий пантотенат кальция и/или магния, и

d) раствор, содержащий пантотенат кальция и/или магния, подвергают сушке и/или формовке.

В одном из вариантов заявленного в данном изобретении способа на стадии с) или d) получают или добавляют суспензию, содержащую пантотенат кальция и/или магния.

Ферментация на стадии а) заявленного в данном изобретении способа осуществляется по известной технологии в замкнутой культуре без подпитки, с однократной или многократной подпиткой либо в культуре с непрерывной подпиткой. При этом для нейтрализации полученной пантотеновой кислоты используется обычная буферная система, такая как, например, фосфатный буфер с растворами гидроксида натрия, гидроксида калия или аммиака.

В других вариантах заявленного в данном изобретении способа на стадии а) в результате ферментации в культуральной среде образуется, по меньшей мере, 10 г/л, предпочтительно, по меньшей мере, 20 г/л, особенно предпочтительно, по меньшей мере, 40 г/л, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 60 г/л и в особенности, по меньшей мере, 70 г/л соли D-пантотеновой кислоты.

В рамках данного изобретения под термином "продуцировать" следует понимать, что организм может синтезировать большие количества D-пантотеновой кислоты и/или ее солей, чем требуются для собственного метаболизма. В предпочтительном варианте реализации данного изобретения синтезируемая D-пантотеновая кислота и/или ее соли не накапливаются внутри клеток, но в идеале полностью поступают из организма в культуральную среду. Это выведение может осуществляться активно или пассивно по известным механизмам.

В рамках данного изобретения в качестве организмов, продуцирующих D-пантотеновую кислоту, используются микроорганизмы. К ним согласно изобретению относятся грибы, дрожжи и/или бактерии. Предпочтительным согласно данному изобретению является использование грибов или дрожжей, таких как, например, Saccharomyces или Debaromyces, предпочтительно Saccharaomyces cerevisiae. Предпочтительным согласно данному изобретению является использование бактерий coryneforme или Bacillaceae. В рамках данного изобретения предпочтительными являются такие бактерии, как Gattungen Corynebacterium, Escherichia, Bacillus, Arthrobacter, Bevibacterium, Pseudomonas, Salmonella, Klebsiella, Proteus, Acinetobacter или Rhizobium. Особенно предпочтительными являются Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium breve или Bacillus subtilis, B.licheniformis, B.amyloliquefaciens, B.cereus, B.lentimorbus, B.lentus, B.firmus, B.pantothenticus, B.circulans, B.coagulans, B.megaterium, B.pumilus, B.thuringiensis, B.brevis, B.stearothermophilus и другие виды Bacillus группы 1, характеризующиеся 16s РНК или Actinum mycetalis. Данное перечисление служит для целей пояснения и ни в коей мере не является ограничением представленного изобретения.

Кроме того, объектом представленного изобретения являются также генетически видоизмененные организмы, используемые для получения согласно данному изобретению добавок к корму для животных, содержащих свободную D-пантотеновою кислоту и/или ее соли. Такие генетически видоизмененные организмы могут быть получены, например, путем химического мутагенеза с последующей селекцией подходящим методом "скрининга". Объектом представленного изобретения также являются так называемые "продуцирующие штаммы", пригодные для получения продукта в рамках представленного изобретения и имеющие генетические изменения метаболизма D-пантотеновой кислоты, в том числе изменения, затрагивающие процесс выведения D-пантотеновой кислоты и/или ее солей через клеточную мембрану. Это может достигаться, например, путем внесения изменений в ключевых точках соответствующих метаболических путей используемого организма.

Возможно также использование трансгенных организмов, полученных с помощью гомологичных и/или гетерологичных нуклеотидных последовательностей, необходимых для синтеза нужного продукта. При этом изменения, обуславливающие избыточную экспрессию и/или нарушение регуляции одного или нескольких генов по отдельности и/или в комбинации, могут находиться в геноме и/или в используемом векторе.

Подобные трансгенные организмы предпочтительным образом могут содержать дополнительные копии и/или видоизмененные гены, из группы panB, panC, panD, paneE, и/или их комбинации, и/или даже целые экспрессионные блоки, такие как оперон panBCD. Кроме того, могут затрагиваться и другие метаболические пути используемых организмов, например, путь биосинтеза изолейцина-валина, как это описано, в частности в европейских заявках на патент ЕР 1006189, ЕР 1006192, ЕР 1006193 или ЕР 1001027. В результате этого достигается увеличение концентрации соответствующих предшественников с разветвленной цепью, требуемых для биосинтеза пантотеновой кислоты. Преимущественно это достигается посредством избыточной экспрессии генов, ответственных за этот метаболический путь т.е. ilvB, ilvN, ilvC и/или HvD.

Кроме того, в рамках данного изобретения предусматривается возможность генетических изменений, затрагивающих аспартат-α-декарбоксилазу (panD), например, посредством индуцирования избыточной экспрессии и/или нарушения регуляции соответствующего гена в организме, используемом для производства D-пантотеновой кислоты.

Под термином "нарушение регуляции" в рамках данного изобретения следует понимать следующее: изменение или модификация, по меньшей мере, одного гена, кодирующего один из ферментов биосинтетического метаболического пути, таким образом, что активность фермента внутри микроорганизма изменяется или модифицируется. Предпочтительно, что бы по меньшей мере один ген, кодирующий один из ферментов биосинтетического метаболического пути, был изменен таким образом, чтобы генный продукт образовывался более интенсивно или проявлял повышенную активность. Термин "метаболический путь с нарушенной регуляцией" включает в себя также биосинтетический метаболический путь, в котором несколько генов, кодирующих несколько ферментов, изменены или модифицированы таким образом, что активности нескольких ферментов изменяются или модифицируются.

Возможные изменения или модификации включают в себя, не ограничиваясь этим, следующее: удаление эндогенного промотора или регуляторных элементов; введение более сильных промоторов, индуцируемых промоторов или нескольких промоторов одновременно; удаление регуляторных последовательностей, влияющих на экспрессию генного продукта; изменение расположения гена внутри хромосомы; изменение последовательности ДНК вблизи гена или внутри него, например, участков связывания рибосом (RBS); увеличение количества копий гена в геноме или введение плазмид, содержащих различное количество копий данного гена; модификация белков (например, регуляторных белков, супрессоров, энхансеров, активаторов транскрипции, и тому подобных), участвующих в процессах транскрипции гена и/или транскляции с образованием соответствующего генного продукта. Сюда относятся также любые другие возможности нарушения регуляции экспрессии гена, доступные современной технологии, таки, например, как использование антисмысловых олигонуклеотидов, или блокирование репрессорных белков.

Нарушение регуляции предусматривает также изменения в кодирующей области гена, приводящие, например, к устранению обратной связи в системе регуляции синтеза генного продукта или к повышению или снижению специфической активности генного продукта.

Кроме того, в рамках данного изобретения преимущественными являются такие генноинженерные изменения ферментов, которые влияют на превращение предшественников пантотеновой кислоты в соответствующий продукт и/или пантотеновой кислоты в коэнзим А. Примером генов, кодирующих таких ферменты, являются: alsD, avtA, ilvE, ansB, coaA, coaX и многие другие. Данное перечисление служит для целей пояснения и ни в коей мере не является ограничением представленного изобретения.

Кроме того, преимущественными являются такие генноинженерные изменения, которые обеспечивают накопление в клетках кофакторов (таких как метилентетрагидрофолат, редокс эквиваленты и другие), в оптимальной для производства пантотеновой кислоты концентрации.

В предпочтительном варианте исполнения β-аланин должен присутствовать в клетках в более высокой концентрации, чем у генетически не видоизмененных организмов, что позволило бы избежать добавления его в культуральную среду, как это требуется, например, в европейской заявке на патент ЕР-А-0 590857. Предпочтительными являются микроорганизмы с нарушенной регуляцией биосинтеза пантотеновой кислоты-(pan) и/или изолейцина/валина-(ilv) и/или аспартат-α-декарбоксилазы (panD). Кроме того, предпочтительным является также дополнительная избыточная экспрессия в микроорганизмах кетопантоат-редуктазы (panE).

Кроме того, в рамках данного изобретения может быть предпочтительным, снижение активности или (например, в различных видах Bacillus) полное выключение гена соаА, необходимого для синтеза коэнзима А. Для этой ферментационной функции Bacillus содержит помимо гена соаА другой ген (=соаХ). Активность этого гена соаХ или соответствующего фермента также может быть изменена, предпочтительно снижена, или даже полностью подавлена, поскольку соаА сам по себе проявляет еще достаточную, хотя и сниженную ферментативную активность, т.е. ферментативная активность соаА теряется неполностью. Помимо избыточной экспрессии различных генов предпочтительными являются также генетические манипуляции с промоторными областями этих генов, которые приводят к избыточной экспрессии генного продукта.

В одном из вариантов осуществления представленного изобретения используются бактериальные штаммы, описанные в заявке PCT/US00/25993, например, Bacillus subtilis PA 824 и/или их производные. В другом варианте осуществления изобретения в соответствии с заявленным в данном изобретении способом используется микроорганизм Bacillus subtilis PA 668, описанный в заявке США серийный номер 60/262, 995. Эти штаммы Bacillus subtilis PA 824 и PA 668 могут быть получены следующим образом:

Исходя из штамма Bacillus subtilis 168 (штамм Marburg ATCC 6051), обладающего генотипом trpC2 (Trp^-), путем трансдукции маркера Trp⁺ (из Bacillus subtilis дикого типа W23) был получен штамм PY79. В штамм PY79 классическими генноинженерными методами (например, описанными в литературе Harwood, C.R. и Cutting, S.M. (редакторы), Molecular Biological Methods for Bacillus (1990) John Wiley & Sons, Ltd., Chichester, England) вносились мутации ΔpanB и ΔpanE1.

Полученный штамм трансформировался геномной ДНК штамма РА221 Bacillus subtilis (генотип P₂₆panBCD, trpC2 (Trp^-)) и геномной ДНК штамма РА303 Bacillus subtilis (генотип P₂₆panE1). Полученный штамм РА327 имеет генотип P₂₆panBCD, P₂₆panE1 и является ауксотрофным по триптофану (Trp^-). При использовании штамма РА327 Bacillus subtilis в 10 мл культуры в среде SVY (смесь 25 г/л телячьего инфузионного бульона Difco, 5 г/л дрожжевого экстракта Difco, 5 г/л глутамата натрия, 2,7 г/л сульфата аммония растворяют в воде для получения 740 мл раствора, автоклавируют, после чего добавляют 200 мл раствора 1 М фосфата калия, рН 7,0 и 60 мл 50% стерильного раствора глюкозы) с добавлением 5 г/л β-аланина и 5 г/л α-кетоизовалерата удается достичь концентрации пантотеновой кислоты 3,0 г/л (24 часа).

Получение штамма РА221 Bacillus subtilis (генотип P₂₆panBCD, trpC2 (Trp^-)) описывается в следующем разделе:

Классическими генноинженерными методами с помощью последовательности оперона panBCD E.coli (смотрите Merkel et al., FEMS Microbiol. Lett., 143, 1996:247-252), исходя из плазмидной библиотеки Bacillus subtilis GP275 был клонирован оперон panBCD Bacillus. Для клонирования использовался штамм ВМ4062 E.coli (bir^ts) и информация, что оперон Bacillus располагается рядом с геном panA. Оперон panBCD вставлялся в реплицируемую в E.coli плазмиду. Для повышения экспрессии оперона panBCD промотор заменялся сильным, конститутивным промотором фага Bacillus subtilis SP01 (Р₂₆), а участок связывания рибосом (=RBS) перед геном panB искусственным участком связывания. Перед блоком P₂₆panBCD в плазмиде вставлялся фрагмент ДНК, расположенный непосредственно перед геном panB в нативном геноме Bacillus. Эта плазмида трансформировалась в штамм RL-1 Bacillus subtilis (полученное путем классического мутагенеза производное Bacillus subtilis 168 (штамм Marburg ATCC 6051), генотип trpC2 (Trp^-)) и в результате гомологичной рекомбинации нативный оперон panBCD заменялся опероном p₂₆panBCD. Полученный штамм называется РА221 и имеет генотип P₂₆panBCD, trpC2 (Trp^-).

При использовании штамма РА221 Bacillus subtilis в 10 мл культуры в среде SVY с добавлением 5 г/л β-аланина и 5 г/л α-кетоизовалерата удается достичь концентрации пантотеновой кислоты 0,92 г/л (24 часа).

Получение штамма РА303 Bacillus subtilis (генотип Р₂₆раnЕ1) описывается в следующем разделе:

С помощью последовательности гена panE E.coli аналогичным образом клонировалась последовательность гена panE Bacillus. Оказалось, что в геноме Bacillus subtilis присутствует два гомолога гена panE E. coli, получившие названия panE1 и panE2. При анализе результатов делеций того и другого гена оказалось, что ген panE1 ответственен за производство 90% пантотеновой кислоты, тогда как делеция гена panE2 не оказывала значительного эффекта на уровень производства пантотеновой кислоты. Здесь также как и при клонировании оперона panBCD промотор был заменен сильным конститутивным промотором Р₂₆, а участок связывания рибосом перед геном panE1 искусственным участком связывания. Фрагмент Р₂₆раnЕ1 клонировался в вектор, который был сконструирован таким образом, что бы фрагмент Р₂₆раnЕ1 мог встраиваться в исходный локус panE1 в геноме Bacillus subtilis. Полученный в результате трансформации и гомологичной рекомбинации штамм называется РА303 и имеет генотип P₂₆panE1. При использовании штамма РА303 Bacillus subtilis в 10 мл культуры в среде SVY с добавлением 5 г/л β-аланина и 5 г/л α-кетоизовалерата удается достичь концентрации пантотеновой кислоты 1,66 г/л (24 часа).

Дальнейшее конструирование штамма осуществлялось путем трансформация РА327 плазмидой, содержащей оперон P₂₆ilvBNC и маркерный ген спектиномицина. Оперон P₂₆ilvBNC встраивался в локус amyE, что было показано методом ПЦР. Полученный штамм получил название РА340 (генотип P₂₆panBCD, Р₂₆раnЕ1, P₂₆ilvBNC, specR, trpC2 (Trp^-)).

При использовании штамма РА340 Bacillus subtilis в 10 мл культуры в среде SVY с добавлением только 5 г/л β-аланина удается достичь концентрации пантотеновой кислоты 3,6 г/л (24 часа), в 10 мл культуры в среде SVY с добавлением 5 г/л β-аланина и 5 г/л α-кетоизовалерата удается достичь концентрации пантотеновой кислоты 4,1 г/л (24 часа).

Затем в штамм РА340 вводился нерегулируемый блок ilvD. Для этого в штамм РА340 трансформировалась плазмида, содержащая ген ilvD под контролем промотора Р₂₆ с искусственным участком связывания рибосом RBS2. При этом ген P₂₆ilvD в результате гомологичной рекомбинации встраивается в исходный локус ilvD. Полученный штамм РА374 имеет генотип P₂₆panBCD, Р₂₆раnЕ1, P₂₆ilvBNC, P₂₆ilvD, specR и trpC2 (Trp^-).

При использовании штамма РА374 Bacillus subtilis в 10 мл культуры в среде SVY с добавлением только 5 г/л β-аланина удается достичь концентрации пантотеновой кислоты 2,99 г/л (24 часа).

Для продуцирования пантотеновой кислоты с помощью штамма РА374 без добавки β-аланина, в штамм РА374 вносились дополнительные копии гена panD, кодирующего аспартат-α-декарбоксилазу. Для этого в штамм РА374 трансформировалась хромосомная ДНК штамма РА401. Путем селекции на тетрациклине был получен штамм РА377. Полученный штамм РА377 имеет генотип P₂₆panBCD, Р₂₆раnЕ1, P₂₆ilvBNC, P₂₆ilvD, specR, tetR и trpC2 (Trp^-).

При использовании штамма РА377 Bacillus subtilis в 10 мл культуры в среде SVY без добавления предшественника удается достичь концентрации пантотеновой кислоты 1,31 г/л (24 часа).

Получение штамма РА401 Bacillus subtilis (генотип P₂₆panD) описывается в следующем разделе:

Ген panD Bacillus subtilis клонировался из оперона panBCD в вектор, содержащий маркерный ген устойчивости к тетрациклину. Перед геном panD клонировался промотор P₂₆ и один из вышеописанных искусственных участков связывания рибосом. Путем обработки рестриктазами был получен фрагмент, содержащий маркерный ген устойчивости к тетрациклину и ген P₂₆panD. Выделенный фрагмент религировался и трансформировался в вышеописанный штамм РА221. При этом фрагмент встраивался в геном штамма РА211. Полученный штамм РА401 имеет генотип P₂₆panBCD, P₂₆panD, tetR и trpC2 (Trp^-).

При использовании штамма РА401 Bacillus subtilis в 10 мл культуры в среде SVY с добавлением 5 г/л α-кетоизовалерата удается достичь концентрации пантотеновой кислоты 0,3 г/л (24 часа). В 10 мл культуры в среде SVY с добавлением 5 г/л D-пантотеновой кислоты и 10 г/л L-аспартата удается достичь концентрации пантотеновой кислоты 2,2 г/л (24 часа).

Исходя из штамма РА377, путем трансформации хромосомной ДНК штамма PY79 был получен прототрофный по триптофану штамм. Этот штамм РА824 имеет генотип P₂₆panBCD P₂₆panE1, P₂₆ilvBNC, P₂₆ilvD, specR, tetR и Trp⁺.

При использовании штамма РА824 Bacillus subtilis в 10 мл культуры в среде SVY без добавления предшественника удается достичь концентрации пантотеновой кислоты 4,9 г/л (48 часов) (по сравнению с РА377:3,6 г/л за 48 часов).

Получение штамма РА668 описывается в следующем разделе:

Ген panB Bacillus subtilis клонировался из оперона panBCD дикого типа и вставлялся в вектор, содержащий помимо гена устойчивости к хлорамфениколу также последовательности локуса vpr Bacillus subtilis.

Сильный конститутивный промотор Р₂₆ вставлялся перед 5′ концом гена panB. Путем обработки рестриктазами был получен фрагмент, содержащий ген Р₂₆panB, маркерный ген устойчивости к хлорамфениколу, а также последовательности vpr Bacillus subtilis. Выделенный фрагмент религировался и трансформировался в штамм РА824. Полученный штамм получил название РА668. Полученный штамм РА668 имеет генотип P₂₆panBCD, Р₂₆раnЕ1, P₂₆ilvBNC, P₂₆ilvD, Р₂₆panB, specR, tetR, CmR and Trp⁺.

Были выделены две колонии штамма РА668, получившие названия РА668-2А и РА668-24.

При использовании штамма РА668-2А Bacillus subtilis в 10 мл культуры в среде SVY без добавления предшественника в течение 48 часов удается достичь концентрации пантотеновой кислоты 1,5 г/л. В 10 мл культуры с добавлением 10 г/л L-аспартата удается достичь концентрации пантотеновой кислоты 5 г/л.

При использовании штамма РА668-24 Bacillus subtilis в 10 мл культуры в среде SVY без добавления предшественника в течение 48 часов удается достичь концентрации пантотеновой кислоты 1,8 г/л. В 10 мл культуры с добавлением 10 г/л L-аспартата удается достичь концентрации пантотеновой кислоты 4,9 г/л.

Точная конструкция этого штамма описана в заявках США серийный номер 60/262,995 и PCT/US00/25993.

При использовании вышеописанного штамма РА377 в процессе лимитируемой по глюкозе ферментации в среде SVY (25 г/л телячьего инфузионного бульона Difco, 5 г/л дрожжевого экстракта Difco, 5 г/л триптофана, 5 г/л глутамата натрия, 2 г/л (NH₄)₂SO₄, 10 г/л КН₂PO₄, 20 г/л К₂HPO₄, 0,1 г/л CaCl₂, 1 г/л MgSO₄, 1 г/л цитрата натрия, 0,01 г/л FeSO₄ ×7Н₂O и 1 мл/л микроэлементного солевого раствора следующего состава: 0,15 г Na₂MoO₄×2H₂O, 2,5 г Н₃ВО₃, 0,7 г CoCl₂×6H₂O, 0,25 г CuSO₄×5H₂O, 1,6 г MnCl₂×4H₂O, 0,3 г ZnSO₄×7Н₂O, растворяют в воде для получения 1 литра раствора)) в объеме 10 л при непрерывном добавлении раствора глюкозы в течении 36 часов (48 часов) удается достичь концентрации пантотеновой кислоты в ферментационном растворе 18-19 г/л (22-25 г/л).

При использовании штамма РА824, прототрофного по триптофаку производного от штамма РА377, в процессе лимитируемой по глюкозе ферментации в среде на дрожжевом экстракте (10 г/л дрожжевого экстракта Difco, 5 г/л глутамата натрия, 8 г/л (NH₄)₂SO₄, 10 г/л КН₂PO₄ 20 г/л К₂HPO₄ 0,1 г/л CaCl₂, 1 г/л MgSO₄, 1 г/л цитрата натрия, 0,01 г/л FeSO₄×7Н₂О и 1 мл/л вышеописанного микроэлементного солевого раствора) в объеме 10 л при непрерывном добавлении раствора глюкозы глюкозы в течении 36 ч, 48 ч и 72 ч удается достичь следующих значений концентрации пантотеновой кислоты в ферментационном растворе: 20 г/л, 28 г/л и 36 г/л.

Путем дальнейшей оптимизации среды при использовании штамма РА824 в процессе лимитируемой по глюкозе ферментации в среде, состоящей из 10 г/л дрожжевого экстракта Difco, 10 г/л нитрозоамина A (Quest International GmbH, Erftstadt), 10 г/л глутамата натрия, 4 г/л (NH₄)₂SO₄, 10 г/л КН₂PO₄ 20 г/л К₂HPO₄ 0,1 г/л CaCl₂, 1 г/л MgSO₄, 1 г/л цитрата натрия, 0,01 г/л FeSO₄×7Н₂O и 1 мл/л вышеописанного микроэлементного солевого раствора, в объеме 10 л при непрерывном добавлении раствора глюкозы в течение 36 часов (48 часов) удается достичь концентрации пантотеновой кислоты в ферментационном растворе 37 г/л (48 г/л).

Дополнительное повышение концентрации пантотеновой кислоты в ферментационном растворе возможно путем дальнейшей оптимизации среды, увеличения продолжительности ферментации, усовершенствования технологических процедур и используемого штамма, а также посредством комбинации предложенных мер. Кроме того, указанные выше концентрации пантотеновой кислоты могут быть достигнуты посредством ферментации с использованием штаммов, являющихся производными вышеописанного штамма РА824. Этипроизводные могут быть получены путем классических методов разработки штаммов, а также с помочью генноинженерных манипуляций. Путем усовершенствования среды, штаммов и технологии ферментатации можно добиться повышения концентрации пантотеновой кислоты в ферментационном растворе до 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, и более 90 г/л.

Существенным преимуществом заявленного в данном изобретении способа является то, что ферментация протекает в культуральной среде, которая помимо источников углерода и азота в качестве исходных соединений не содержит других предшественников конечного продукта. Т.е. биосинтез D-пантотеновой кислоты является независимым от добавки других предшественников. Под такими предшественниками в рамках данного изобретения следует понимать такие вещества как, β-аланин и/или L-аспартат и/или L-валин и/или α-кетоизовалерат и/или их комбинации.

В предпочтительном варианте заявленного в данном изобретении способа ферментация осуществляется продуцирующим D-пантотеновую кислоту организмом, в культуральной среде, содержащей один источник углерода и один источник азота, но без добавления свободного β-аланина и/или солей β-аланина до или в процессе ферментации. То есть, для получения D-пантотеновой кислоты в концентрации, по меньшей мере, 10 г/л культуральной среды, предпочтительно, по меньшей мере, 20 г/л, особенно предпочтительно, по меньшей мере, 40 г/л, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 60 г/л и в особенности, по меньшей мере, 70 г/л, согласно изобретению не требуется добавление свободного β-аланина и/или солей β-аланина. Независимость от добавления предшественника представляет собой важное с экономической точки зрения преимущество заявленного в данном изобретении способа по сравнению с известными способами, поскольку большинство предшественников являются очень дорогостоящими.

Впрочем, в рамках данного изобретения не исключается добавление β-аланина и/или солей β-аланина в культуральную среду, таким образом выход D-пантотеновой кислоты может быть дополнительно увеличен путем добавления β-аланина и/или солей β-аланина. При этом исходят из того, что если все требуемые предшественники пантотеновой кислоты имеются в достаточном количестве, и дополнительное увеличение производства пантотеновой кислоты ограничивается лишь активность гена panD, то выход D-пантотеновой кислоты можно повысить, например, еще на 50%, путем добавления свободного β-аланина и/или солей β-аланина. В одном из предпочтительных вариантов представленного изобретения для дополнительного повышения выхода D-пантотеновой кислоты более чем на 50% в культуральную среду может добавляться до 20 г/л свободного β-аланина и/или солей β-аланина. Предпочтительным является добавление в культуральную среду примерно 15 г/л свободного β-аланина и/или солей β-аланина.

Примерами подходящих в рамках данного изобретения источников углерода, добавляемых в культурапьную ферментационную среду с вышеупомянутыми микроорганизмами, являются сахара, такие как крахмальные гидролизаты (моно-, ди-, и олигосахариды), предпочтительно глюкоза или сахароза, а также свекольная или тростниковая сахарная патока, белки, белковые гидролизаты, соевая мука, кукурузный сок, жиры, свободные жирные кислоты, клетки, полученные в результате ферментационных процессов, или их гидролизаты, а также дрожжевой экстракт. Данное перечисление не может рассматриваться в качестве ограничения представленного изобретения.

Кроме того, предпочтительный способ, заявленный в данном изобретении, характеризуется тем, что общее содержание сахара в растворе к концу ферментационного процесса должно быть по возможности сведено к минимуму, поскольку иначе он в результате склеивания затрудняет последующую сушку и/или формовку ферментационного раствора. Этого, согласно данному изобретению, можно добиться, продолжая ферментацию еще некоторое время после того, как источник углерода будет исчерпан (при культивировании в замкнутой культуре без подпитки), или после того, как прекратится подача источника углерода (при протекании процесса в культуре с однократной или многократной подпиткой), и/или отрегулировав процесс таким образом, чтобы концентрация источника углерода в конце процесса практически обращалась в нуль (в культуре с однократной или многократной подпиткой либо в культуре с непрерывной подпиткой).

Это, согласно изобретению, достигается тем, что после прекращения подачи источника углерода (например, сахарного раствора) ферментация продолжается до тех пор, пока концентрация растворенного кислорода (pO₂) не достигнет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно 90% и особенно предпочтительно 95% от значения насыщения в ферментационном растворе.

Примерами подходящих согласно изобретению источников азота являются аммиак, сульфат аммония, мочевина, белки, белковые гидролизаты или дрожжевой экстракт. Данное перечисление не может рассматриваться в качестве ограничения представленного изобретения.

Кроме того, ферментационная среда содержит минеральные соли и/или микроэлементы, а также аминокислоты и витамины. Точные составы подходящих ферментационных сред хорошо известны специалистам в данной области.

После затравки ферментационной среды подходящим, продуцирующим D-пантотеновую кислоту микроорганизмом (с известными специалистам плотностями клеток) осуществляется, после добавления при необходимости противопенной присадки, культивирование данного микроорганизма. При необходимости отрегулировать значение рН среды можно при помощи различных неорганических или органических щелочей или кислот, таких, например, как гидроксид натрия, гидроксид калия, аммиак, фосфорная кислота, серная кислота, соляная кислота, муравьиная кислота, янтарная кислота, лимонная кислота и т.д.

В зависимости от используемой при ферментации буферной системы, которая, как описано выше, может включать в себя такие компоненты, как гидроксид натрия, гидроксид калия, аммиак, фосфорная кислота, серная кислота, соляная кислота, муравьиная кислота, янтарная кислота, лимонная кислота и т.д., образующаяся в ферментационном растворе D-пантотеновая кислота может находиться в виде соответствующей соли (солей). Поскольку при этом наличие одновалентных катионов солей D-пантотеновой кислоты представляется нежелательным, и предпочтительным является получение D-пантотеновой кислоты в виде ее кальциевых или магниевых солей, согласно изобретению ферментационный раствор подвергают обработке методом электрического разделения на мембране.

Таким образом, представленное изобретение включает в себя все доступные методы электрического разделения на мембране, такие как мембранный электролиз или электродиализ. Выбор подходящего метода предоставляется специалисту в данной области. В рамках данного изобретения предпочтительным является использование электродиализа. При этом используются как электродиализ с применением исключительно монополярных мембран, так и электродиализ с применением моно- и/или биполярных мембран. Наиболее предпочтительными представляются методы электродиализа с использованием исключительно монополярных мембран, особенно электродиализ с использованием селективных для одновалентных ионов монополярных мембран, так называемых моноселективных мембран.

В принципе, для реализации заявленного в данном изобретении способа могут использоваться любые мембраны, обычно применяемые при электродиализе. Для проведения электродиализа в рамках данного изобретения преимущественно используются имеющиеся в продаже ионообменные мембраны.

В качестве анионообменных мембран могут использоваться, например, мембраны Neosepta AMI, AM2, АМ3, АМХ, АМН, AFN, производства Tokuyama Corp. и AMV производства Asahi Glass.

В качестве катионообменных мембран могут использоваться, например, мембраны Neosepta СМ1, СМ2, СМХ, СМН, СМВ, Asahi Glass CMV, а также Nafion 435 или 350 производства Du Pont de Nemours.

В качестве моноселективной катионообменной мембраны может использоваться, например, мембрана Neosepta CMS.

В качестве моноселективных ионообменных мембран могут использоваться, например, мембраны Neosepta ACS производства Tokuyama Corp. или Selmion ASV производства Asahi Glass in Betracht.

В качестве материала для электрода могут использоваться нержавеющая сталь, никель, благородные металлы, например платина, и другие материалы, известные специалистам в данной области.

При использовании монополярного электродиализа в рамках данного изобретения как анионы, так и катионы из содержащего D-пантотенат раствора могут под действием электрического поля мигрировать через анионно- или катионообменные мембраны во второй раствор (раствор концентрата, KONZ) и, в результате удаляются из содержащего пантотеновую кислоту раствора (раствор дилюата, DIL). Преимущественно, согласно изобретению, из содержащего пантотеновую кислоту раствора удаляются низкомолекулярные ионы. Под низкомолекулярными ионами в рамках данного изобретения следует понимать ионы, входящие в состав культуральной среды и/или буферной системы, но являющиеся нежелательными в конечном продукте, к ним относятся, в частности, следующие ионы: ионы аммония, калия, натрия, железа, хлорид-ионы, фосфат-ионы или сульфат-ионы.

В другом варианте реализации представленного изобретения осуществляется ионный обмен одновалентных катионов, таких как ионы натрия или аммония, на многовалентные катионы, такие как ионы кальция. При этом используются катионообменные мембраны селективные для одновалентных ионов. Так, например, в первую камеру I помещается раствор хлорида кальция, а во вторую камеру II, отделенную от камеры I катионообменной мембраной, раствор D-пантотеновой кислоты, содержащий одновалентные катионы. Затем в третью камеру III через установленную между камерой II и камерой III, селективную для одновалентных ионов катионообменную мембрану, переносятся преимущественно одновалентные катионы. Одновременно из камеры I в камеру III через установленную между камерой I и камерой III анионообменную мембрану переносятся анионы, такие как хлорид-ионы. Ионы кальция переносятся из камеры I в камеру II через катионообменную мембрану. Таким образом, непосредственно образуется D-пантотенат кальция. При наличии солей слабых кислот, таких как, например, пантотеновая кислота, с помощью подобной системы можно также получать свободную D-пантотеновую кислоту, если вместо раствора хлорида кальция в камеру I поместить водный раствор соляной кислоты.

При реализации представленного изобретения могут также использоваться соли кальция и/или магния в виде неорганических или органических анионов. Преимущественно в рамках данного изобретения используются хлорид, нитрат, гидроксид, формиат, ацетат, пропионат, глицинат и/или лактат кальция и/или магния.

В одном из вариантов осуществления представленного изобретения в процессе проведения биполярного электродиализа преимущественно катионы переносятся (при одновременном образовании протонов в результате диссоциации воды в биполярной мембране) из содержащего D-пантотенат раствора через катионообменную мембрану во второй раствор и таким образом удаляются из содержащего пантотеновую кислоту раствора. Во втором растворе при взаимодействии с образовавшимися в результате диссоциации воды в биполярной мембране гидроксид-ионами перенесенные катионы образуют соответствующие основания.

В другом варианте осуществления представленного изобретения в процессе проведения биполярного электродиализа преимущественно анионы переносятся (при одновременном образовании гидроксид-ионов в результате диссоциации воды в биполярной мембране) из содержащего D-пантотенат раствора через анионообменную мембрану во второй раствор и таким образом удаляются из содержащего пантотеновую кислоту раствора. Во втором растворе при взаимодействии с образовавшимися в результате диссоциации воды в биполярной мембране протонами перенесенные анионы образуют соответствующие кислоты.

Данное изобретение предусматривает также вариант осуществления, при котором в процессе проведения биполярного электродиализа с одной стороны анионы (при одновременном образовании гидроксид-ионов в результате диссоциации воды в биполярной мембране) переносятся из содержащего D-пантотенат раствора через анионообменную мембрану во второй раствор и таким образом удаляются из содержащего пантотеновую кислоту раствора, а с другой стороны катионы (при одновременном образовании протонов в результате диссоциации воды в биполярной мембране), переносятся из содержащего D-пантотенат раствора через катионообменную мембрану в третий раствор и таким образом удаляются из содержащего пантотеновую кислоту раствора. Во втором растворе при взаимодействии с образовавшимися в результате диссоциации воды в биполярной мембране протонами перенесенные анионы образуют соответствующие кислоты, а в третьем растворе при взаимодействии с образовавшимися в результате диссоциации воды в биполярной мембране гидроксид-ионами перенесенные катионы образуют соответствующие основания.

В рамках данного изобретения при реализации представленного способа предпочтительным является также, доведение, с помощью кислот или оснований, значения рН содержащего D-пантотенат раствора до изоэлектрического значения рН D-пантотеновой кислоты. Благодаря этому можно еще больше повысить выход свободной D-пантотеновой кислоты и, соответственно, снизить потери.

Использование монополярного электродиализа является особенно предпочтительным, поскольку по сравнению с биполярным электродиализом он гораздо дешевле.

Биполярный электродиализ используется преимущественно тогда, когда добавление кислот или оснований для доведения значения рН не допускается, или когда предполагается последующее использование образующихся кислот или оснований.

Все варианты электродиализа, используемые в данном изобретении, обладают тем преимуществом, что они не приводят к появлению сточных вод, которые образуются при регенерации ионообменных смол.

Использование заявленного в данном изобретении метода электрического разделения позволяет преимущественно удалять нежелательные низкомолекулярные ионы (посторонние ионы), такие как ионы аммония, калия, натрия, железа, хлорид-ионы, фосфат-ионы или сульфат-ионы, из содержащего D-пантотенат раствора. В результате образуется преимущественно свободная D-пантотеновая кислота или нужные соли, такие как D-пантотенат кальция и/или магния. Согласно данному изобретению содержание в растворе одновалентных катионов, преимущественно ионов аммония, калия и/или натрия, доводится до концентрации меньше или равной 1 г/кг.

Также можно существенно снизить содержание нежелательных анионов, таких, например, как хлорид-ионы, фосфат-ионы или сульфат-ионы, путем использования соответствующей ионообменной мембраны, предпочтительно, анионообменной мембраны.

Полученный таким образом раствор, содержащий свободную D-пантотеновую кислоту согласно изобретению путем добавления кальциевых и/или магниевых оснований доводят до значения рН от 3 до 10. Предпочтительными являются значения рН от 5 до 10. Предпочтительным является доведение рН раствора до значений 5-9, особенно предпочтительно до значений 6-9 и в особенности до значений 6-8. Таким образом получают раствор, содержащий пантотенат кальция и/или магния. Предпочтительно для нейтрализации в раствор добавляют гидроксид кальция, карбонат кальция, оксид кальция, гидроксид магния и/или основной карбонат магния в виде твердого вещества и/или в виде водной суспензии.

При этом предпочтительным согласно изобретению является нейтрализация содержащего свободную D-пантотеновою кислоту раствора с помощью кальциевых и/или магниевых оснований в виде водной суспензии. При использовании водной суспензии нейтрализация протекает быстрее и без больших колебаний значения рН чем при использовании соответствующих компонентов в виде твердого вещества.

Заявленный в данном изобретении способ характеризуется тем, что в раствор на стадии с) добавляют водную суспензию, содержащую 2-55% мас., предпочтительно 10-50% мас. и особенно предпочтительно 20-40% мас. гидроксида кальция.

Кроме того, данное изобретение включает в себя способ, при котором в раствор на стадии с) добавляют водную суспензию, содержащую 2-65% мас., предпочтительно 10-50% мас. и особенно предпочтительно 20-40% мас. карбоната кальция. В другом варианте осуществления представленного изобретения в раствор на стадии с) добавляют водную суспензию, содержащую 2-60% мас., предпочтительно 10-50% мас. и особенно предпочтительно 20-40% мас. гидроксида магния. Данное изобретение включает в себя также способ, при котором в раствор на стадии с) добавляют водную суспензию, содержащую 2-25% мас., предпочтительно 10-20% мас. основного карбоната магния.

Сушка и/или формовка раствора или суспензии, содержащих пантотенат кальция и/или магния осуществляется известными методами, например, такими, как распылительная сушка, распылительная грануляция, сушка в вихревом слое, грануляция в вихревом слое, сушка в барабанной сушилке или термическая сушка во вращающейся сушилке (Ullmann′s Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6^th edition, 1999, электронная версия, Kapitel "Drying of Solid Materials"). Температура газа на входе при конвекционной сушке составляет от 100 до 280°С, предпочтительно от 120 до 210°С. Температура газа на выходе составляет от 50 до 180°С, предпочтительно от 60 до 150°С. Для обеспечения требуемого распределения по размеру частиц, которым определяются связующие свойства продукта, мелкие частицы могут улавливаться и возвращаться назад. Кроме того, крупные комки могут быть измельчены в порошок и затем также возвращены назад.

Преимуществом представленного изобретения является сокращение при использовании представленного выше способа дорогостоящих технологических процессов, в особенности отказ от использования органических растворителей, при одновременном получении нужного продукта, обладающего высокой биологической ценностью. Кроме того, при использовании заявленному в данном изобретении способа можно значительно снизить количество образующихся сточных вод. Это дает дополнительную экономию на дорогостоящих установках по переработке и утилизации отходов. Таким образом, способ, заявленный в данном изобретении, обладает тем преимуществом, что он проще, надежнее, быстрее, значительно дешевле и, соответственно, экономичнее, чем традиционный способ.

Это, однако, не исключает некоторых вариаций заявленного в данном изобретении способа. Указанные в начале технологические стадии заявленного в данном изобретении способа с а) по d), могут быть дополнены одним или несколькими дополнительными стадиями, которые сами по себе известны специалистам в данной области. При этом данное изобретение включает в себя все мыслимые комбинации этих дополнительных (факультативных) технологических стадий с (существенными) технологическими стадиями с а) по d).

Так, растворы, полученные на стадиях а)-с), могут, например, подвергнуться обеззараживанию путем нагревания (стерилизация) или другими методами, такими, например, как пастеризация или стерильная фильтрация.

В других вариантах заявленного в данном изобретении способа перед сушкой и/или формовкой раствора возможно дополнительное проведение одной или нескольких процедур, включая лизирование и/или подавление жизнедеятельности клеток и/или отделение клеточной массы от ферментационного раствора и/или дополнительная добавка наполнителей и/или концентрирование ферментационного раствора, предпочтительно путем дегидратации.

Таким образом, объектом представленного изобретения является также способ, при котором лизирование и/или подавление жизнедеятельности клеток проводится еще в ферментационном растворе или сразу же после отделения клеточной массы от ферментационного раствора. Это может осуществляться, в частности, путем термической обработки, предпочтительно при температуре 80-200°С и/или кислотной обработки, предпочтительно серной или соляной кислотой, и/или ферментативным способом, предпочтительно с помощью лизоцима.

В другом варианте осуществления представленного изобретения клетки ферментирующих микроорганизмов могут быть путем фильтрации, сепарации (например центрифугирования) и/или декантации удалены из раствора или суспензии, полученных на стадиях а), b) или с) заявленного в данном изобретении способа. Возможно также непосредственное пропускание раствора или суспензии, полученных на стадиях а), b) или с) без отделения содержащихся в нем микроорганизмов под воздействием электрического поля через одну или несколько ионоселективных мембран.

Полученный в результате мембранного электролиза или электродиализа раствор может сразу же после нейтрализации выпариваться для повышения его концентрации в соответствующем испарителе, например, тонкопленочном испарителе или испарителе вращающегося типа. Такие испарители производятся, в частности, фирмами GIG (4800 Attnang Пухайм, Австрия), GEA Canzler (52303 Дюрен, Германия), Diessel (31103 Хильдес-хайм, Германия) и Pitton (35274 Кирхайн, Германия).

Для улучшения красящих свойств конечного продукта, может использоваться дополнительная стадия фильтрации, при которой в полученные посредством указанного способа растворы добавляют некоторое количество активированного угля, после чего содержащая активированный уголь суспензию фильтруют. Полученные в процессе ферментации растворы могут также пропускаться через тонкий слой активированного угля. Требуемые для этого количества добавляемого активированного угля составляют менее 1% мас. ферментационного раствора и устанавливаются по усмотрению соответствующего специалиста.

Этот процесс можно облегчить, если перед фильтрацией в соответствующий раствор добавить обычное коагулирующее средство (например Sedipur CF 902 или Sedipur CL 930 производства фирмы BASF AG, Ludwigshafen).

В одном из предпочтительных вариантов осуществления представленного изобретения ферментационный раствор стерилизуют путем нагревания и затем путем центрифугирования, фильтрации или декантации отделяют от клеточной массы. После добавления обычного коагулирующего средства из расчета 50-1000 мг/кг, предпочтительно 100-200 мг/кг ферментационный раствор фильтруют через тонкий слой активированного угля и песка, для получения свободного от клеточной массы раствора с высоким содержанием D-пантотеновой кислоты. В завершение полученный таким образом раствор под воздействием электрического поля пропускают через одну или несколько ионоселективных мембран.

Последующая сушка раствора, содержащего пантотенат кальция и/или магния может осуществляться, например, путем распылительной сушки. Она может протекать в прямоточном, противоточном или смешанном процессе. Для распыления могут использоваться все известные распылители, в частности центробежные распылители, распылители с однокомпонентными или двухкомпонентными насадками. Предпочтительный температурный диапазон сушки составляет 150-250°С на входе в барабан и 70-130°С на выходе из барабана. Сушка также может проводиться при более высоких или более низких температурах. Для максимального удаления остаточной влаги может дополнительно проводиться сушка в вихревом слое.

Распылительная сушка также может проводиться в сушилках типа FSD (Fluidized Spray Dryer) или SBD (Spray Bed Dryer), производимых фирмами Niro (Копенгаген, Дания) и APV-Anhydro (Копенгаген, Дания), в которых реализуется комбинация распылительной сушки и сушки в вихревом слое. При распылительной сушке в сушилку может добавляться вспомогательное средство. Это позволяет уменьшить покрытие стенок сушилки и улучшить характер течения мелкозернистого порошка. В качестве вспомогательного средства могут использоваться, в частности, силикаты, стеараты, фосфаты и кукурузный крахмал.

В принципе сушка также может осуществляться путем распыления вихревом слое, причем протекать как в непрерывном, так и в прерывистом режиме. Подача раствора или суспензии может осуществляться сверху (Topspray), снизу (Bottomspray) или сбоку (Sidespray).

Объектом представленного изобретения является, кроме того, состав для использования в качестве добавок и/или дополнения к корму для животных, при производстве которого

a) используют, по меньшей мере, один организм, продуцирующий D-пантотеновую кислоту, в котором нарушена регуляция биосинтеза пантотеновой кислоты-(pan) и/или изолейцина/валина-(ilv), и который в процессе ферментации в культуральной среде производит, по меньшей мере, 2 г/л соли D-пантотеновой кислоты, причем в культуральную среду добавляют 0-20 г/л, предпочтительно 0 г/л, свободного β-аланина и/или солей β-алакина,

b) ферментационный раствор, содержащий D-пантотенат, под воздействием электрического поля пропускают через одну или несколько ионоселективных мембран, в результате чего низкомолекулярные ионы удаляются из содержащего D-пантотенат раствора

c) рН раствора, содержащего свободную D-пантотеновою кислоту, добавлением кальциевых и/или магниевых оснований доводят до значения 3-10, при этом получают раствор, содержащий пантотенат кальция и/или магния, и

d) раствор, содержащий пантотенат кальция и/или магния, подвергают сушке и/или формовке.

В одном из вариантов представленного изобретения состав характеризуется тем, что на стадии с) или d) получают или добавляют суспензию, содержащую пантотенат кальция и/или магния.

Кроме того, заявленный в данном изобретении состав характеризуется тем, что он содержит соли D-пантотеновой кислоты в концентрации, по меньшей мере, 1-100% мас., предпочтительно, по меньшей мере, 20-100% мас. и особенно предпочтительно, по меньшей мере, 50% мас. Объектом представленного изобретения является состав, содержащий соли D-пантотеновой кислоты в виде двухвалентных катионов, предпочтительно D-пантотенат кальция и/или магния. В рамках данного изобретения предпочтительным является состав, характеризующийся тем, что содержание в нем солей D-пантотеновой кислоты в виде одновалентных катионов составляет меньше или равно 1 г/кг.

Согласно заявленному в данном изобретении способу может быть получен D-пантотенат кальция и/или магния, удовлетворяющий требованиям, предъявляемым к добавкам кормов для животных. Эти требования предусматривают, в частности, сравнительно высокое содержание D-пантотената и хорошую переносимость соответствующими животными, а также биологическую ценность в смысле "витаминного действия" заявленного в данном изобретении продукта.

Далее данное изобретение более подробно иллюстрируется на приводимых ниже примерах, которые никоим образом не могут рассматриваться как ограничение представленного изобретения:

Пример 1:

В ферментатор емкостью 14 литров, снабженный мешалкой и аэратором, заливается водная ферментационная среда следующего состава:

Исходные компонентыКонцентрация [г/л]Дрожжевой экстракт10Глутамат натрия5Сульфат аммония8Противопенное средство1 мл/л

После стерилизации в среду дополнительно добавляют следующие стерильные компоненты:

Исходные компонентыКонцентрация [г/л]KH₂PO₄10К₂HPO₄20Глюкоза2,5Хлорид кальция0,1Хлорид магния1Цитрат натрия0,1FeSO₄×7Н₂O0,1Микроэлементный солевой раствор1 мл

Микроэлементный солевой раствор готовится следующим образом:

0,15 г Na₂MoO₄×2H₂O, 2,5 г Н₃ВО₃, 0,7 г CoCl₂×6Н₂O, 0,25 г CuSO₄×5Н₂O, 1,6 г MnCl₂×4H₂O, 0,3 г ZnSO₄×7Н₂O растворяют в воде для получения 1 литра раствора. Добавление микроэлементного солевого раствора осуществляется после его стерильной фильтрации. Исходный объем жидкости составляет 8,4 л. Количество вышеуказанных компонентов определяется, исходя из этого значения.

В этот раствор добавляют 160 мл затравочной культуры (OD=10 в среде SVY (среда SVY: телячий инфузионный бульон Difco 25 г, дрожжевой экстракт Difco 5 г, глутамат натрия 5 г, (NH₄)₂SO₄ 2.7 г растворить в 740 мл воды, стерилизовать; добавить 200 мл стерильного 1 М раствора К₂HPO₄ (рН 7) и 60 мл стерильного 50% раствора глюкозы (конечный объем 1 л))) Bacillus subtilis PA824 и проводят ферментацию при температуре 43°С при интенсивном перемешивании при скорости аэрации 12 л/мин. Этот штамм описан в заявке PCT/US00/25993.

В течение 52 часов в раствор добавляют 6 л стерильного водного раствора следующего состава:

Исходные компонентыКонцентрация [г/л]Глюкоза500Сульфат кальция0,6Микроэлементный солевой раствор7 мл

Процесс ферментации лимитируется по глюкозе. В процессе ферментации значение рН раствора поддерживается на уровне 7,2 путем добавления 25%-ного аммиачного раствора или, соответственно, 20%-ного раствора фосфорной кислоты. Аммиак одновременно служит в качестве источника азота для ферментационного процесса. Положение регулятора устанавливается таким образом, чтобы концентрация растворенного кислорода поддерживалась на уровне 30% от значения насыщения. После прекращения подачи источника углерода ферментация продолжается до тех пор, пока концентрация растворенного кислорода (pO₂) не достигнет 95% от значения насыщения. После этого ферментация останавливается, и микроорганизм убивается путем нагревания. Для этого ферментационный раствор подвергается стерилизации в течении 60 минут. Эффективность стерилизации проверяется методом высевания на чашку.

В завершение осуществляется отделение клеточной массы путем центрифугирования. После отделения клеточной массы концентрация D-пантотената составляет (после 52 часов ферментации) 24,7 г/л.

Аналогичным образом получают ферментационные растворы, в которых без добавки β-аланина концентрация пантотеновой кислоты составляет 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 и более 90 г/л.

В полученный ферментационный раствор, подвергшийся термической стерилизации и отцентрифугированный для удаления клеточной массы, дополнительно добавляют D-пантотеновую кислоту и раствором серной кислоты доводят до значения порядка 2. Полученный таким образом раствор фильтруют через тонкий слой песка и активированного угля. Концентрация D-пантотеновой кислоты в этом растворе составляет 67,7 г/л.

900 мл этого фильтрата под действием гидростатического давления пропускают через 250 мл стеклянную колонку, заполненную примерно 100 мл ионообменной смолы Lewatit S 100 G1. Скорость расхода жидкости составляет примерно 20 мл/мин.

Фракции пропущенного через колонку раствора объемом по 100 мл собирались и анализировались на предмет значения рН, концентрации D-пантотената и содержания ионов аммония, кальция, калия, магния и натрия. В качестве примера ниже приводится таблица, в которой сведены результаты анализа для первых трех фракций.

ПробамлрН НачалорН КонецПантотенат (г/л)NH₄ ⁺Са²⁺K⁺Mg²⁺Na⁺Фильтрат  7700,76%0,11%0,20%0,003%0,031%Фракция 11004,51,51,2<1 ppm<0,001%<0,001%<0,001%0,001%Фракция 21001,51,6644 ppm<0,001%0,001%<0,001%0,003%Фракция 31001,62,56819 ppm0,001%0,001%<0,001%0,002%

75 мл фракции 2, содержащей 4,8 г D-пантотената, добавлением при перемешивании твердого гидроксида кальция доводилось до значения рН 7. Полученный таким образом раствор или суспензию D-пантотената кальция высушивают путем выпаривания воды в ротационном выпаривателе с получением 8,98 г слегка коричневатого порошка, содержащего 57% D-пантотената кальция. Этот порошок не обладает склеивающими свойствами и обеспечивает высокое качество продукта.

Пример 2:

В ферментатор емкостью 14 литров, снабженный мешалкой и аэратором, заливается водная ферментационная среда следующего состава:

Исходные компонентыКонцентрация [г/л]Дрожжевой экстракт10Глутамат натрия5Сульфат аммония8КН₂PO₄8.4К₂HPO₄15

После стерилизации в среду дополнительно добавляют следующие стерильные компоненты:

Исходные компонентыКонцентрация [г/л]Глюкоза2,5Хлорид кальция0,1Хлорид магния1Цитрат натрия1FeSO₄×7Н₂O0,01Микроэлементный солевой раствор1 мл

Микроэлементный солевой раствор готовится следующим образом:

0,15 г Na₂MoO₄×2H₂O, 2,5 г Н₃ВО₃, 0,7 г CoCl₂×6H₂O, 0,25 г CuSO₄×5H₂O, 1,6 г MnCl₂×4Н₂O, 0,3 г ZnSO₄×7Н₂O растворяют в воде для получения 1 литра раствора. Добавление микроэлементного солевого раствора осуществляется после его стерильной фильтрации. Исходный объем жидкости составляет 5,5 л. Количество вышеуказанных компонентов определяется, исходя из этого значения.

В этот раствор добавляют 55 мл затравочной культуры (OD=10 в среде SVY (среда SVY: телячий инфузионный бульон Difco 25 г, дрожжевой экстракт Difco 5 г, глутамат натрия 5 г, (NH₄)₂SO₄ 2.7 г растворить в 740 мл воды, стерилизовать; добавить 200 мл стерильного 1 М раствора К₂HPO₄ (рН 7) и 60 мл стерильного 50% раствора глюкозы (конечный объем 1 л))) Bacillus subtilis PA824 и проводят ферментацию при температуре 43°С при интенсивном перемешивании при скорости аэрации 12 л/мин. Этот штамм описан в заявке PCT/US00/25993.

В течение 48 часов в раствор добавляют 6 л стерильного водного раствора следующего состава:

Исходные компонентыКонцентрация [г/л]Глюкоза550Хлорид кальция0,6Микроэлементный солевой раствор6 мл

Процесс ферментации лимитируется по глюкозе. В процессе ферментации значение рН раствора поддерживается на уровне порядка 7,2 путем добавления 25%-ного аммиачного раствора или, соответственно, 25%-ного раствора фосфорной кислоты. Аммиак одновременно служит в качестве источника азота для ферментационного процесса. Положение регулятора устанавливается таким образом, чтобы концентрация растворенного кислорода поддерживалась на уровне 30% от значения насыщения. После прекращения подачи источника углерода ферментация продолжается до тех пор, пока концентрация растворенного кислорода (pO₂) не достигнет 95% от значения насыщения. После этого ферментация останавливается, и микроорганизм убивается путем нагревания. Для этого ферментационный раствор подвергается стерилизации в течении 30 минут. Эффективность стерилизации проверяется методом высевания на чашку.

В завершение осуществляется отделение клеточной массы путем центрифугирования. После отделения клеточной массы концентрация D-пантотената составляет (после 48 часов ферментации) 24,1 г/л.

Аналогичным образом получают ферментационные растворы, в которых без добавки β-аланина концентрация пантотеновой кислоты составляет 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, и более 90 г/л.

2817 мл полученного после ферментации раствора смешивается с 1183 мл раствора D-пантотеновой кислоты концентрацией 178,9 г/л и затем нейтрализуется 25%-ным аммиачным раствором. Затем раствор фильтруют через слой песка и активированного угля. Концентрация D-пантотеновой кислоты в фильтрате составляет 67 г/л, причем D-пантотеновая кислота главным образом представлена в виде солей аммония.

Примерно 720 мл этого раствор подвергаю электродиалитической обработке, как описано в примере 1:

550 г полученного дилюата (с плотностью 1,017 г/мл) добавлением 3,5 г 40%-ной суспензии гидроксида кальция доводят до значения рН 7,5. В результате получают водный раствор D-пантотената кальция (551,03 г с содержанием D-пантотената кальция 40,9 г/л).

Полученный водный раствор D-пантотената кальция высушивают в лабораторном осушителе Fa. Niro мини-типа. Температура на входе составляет примерно 200°С, температура на выходе 90°С. Распыление осуществляется с использованием двухкомпонентной насадки под давлением 2 бар. В качестве порошкообразующего средства добавляется Sipernat 22F.

Полученный порошковый продукт имеет следующие характеристики (данные приведены в % масс.):

Содержание воды: 2,3%

D-пантотенат кальция: 46,1%

Аммоний: 0,60%

Калий: 0,47%

Натрий: 1,1%

Пример 3:

В ферментатор емкостью 200 литров, снабженный мешалкой и аэратором, помещают 800 г 50%-ного дрожжевого экстракта 438 г глутамата натрия, 3200 г соевой муки, 640 г сульфата аммония, 800 г КН₂PO₄, 1600 г K₂HPO₄ и 50 мл противопенной присадки TegoKS растворяют в 70 л воды и в течение 30 минут стерилизуют при температуре 121°С.

Затем добавляют раствор 1 и 2.

Раствор 1 готовится следующим образом: 1670 г глюкозы ×Н₂O, 10,2 г CaCl₂×2Н₂O и 170,7 г MnCl₂×6H₂O растворяют в 9 л воды и в течение 30 минут стерилизуют.

Раствор 2 готовится следующим образом: к 800 мл раствора цитрата железа (200 г/л цитрата натрия, 2 г/л FeSO₄×7H₂O, стерильно отфильтрованный) добавляют 80 мл микроэлементного солевого раствора (0,15 г Na₂MoO₄×2H₂O, 2,5 г Н₃ВО₃, 0,7 г CoCl₂×6Н₂O, 0,25 г CuSO₄×5H₂O, 1,6 г MnCl₂×4H₂О, 0,3 г ZnSO₄×7Н₂O растворяют в воде для получения 1 литра раствора, стерильно фильтруют).

В этот раствор добавляют 2 л затравочной культуры (OD=10 в среде SVY (среда SVY: телячий инфузионный бульон Difco 25 г, дрожжевой экстракт Difco 5 г, глутамат натрия 5 г, (NH₄)₂SO₄ 2.7 г растворить в 740 мл воды, стерилизовать; добавить 200 мл стерильного 1 М раствора К₂HPO₄ (рН 7) и 60 мл стерильного 50% раствора глюкозы (конечный объем 1 л))) Bacillus subtilis PA668 и проводят ферментацию при температуре 43°С при интенсивном перемешивании при скорости аэрации 3 м³/мин. Этот штамм описан в заявке США серийный номер 60/262, 995.

В течение 48 часов в раствор добавляют примерно 10 л стерильного водного раствора глюкозы. Этот раствор готовится следующим образом: 90 кг глюкозы ×Н₂O растворяют в 55 л воды и в течение 30 минут стерилизуют. После этого в раствор добавляют 300 мл микроэлементного солевого раствора (состав смотрите выше), а также 3 л Цитрат железа раствор (состав смотрите выше). После этого в раствор добавляют 1 л стерильно отфильтрованного раствора CaCl₂×2H₂O с концентрацией 90 г/л и 2 л стерильно отфильтрованного раствора глутамата натрия 375 г/л.

Процесс ферментации лимитируется по глюкозе. В процессе ферментации значение рН раствора поддерживается на уровне 7,2 путем добавления 25%-ного аммиачного раствора или, соответственно, 25%-ного раствора фосфорной кислоты. Аммиак одновременно служит в качестве источника азота для ферментационного процесса. Положение регулятора устанавливается таким образом, чтобы концентрация растворенного кислорода поддерживалась на уровне 30% от значения насыщения. Образование пены контролируют добавлением в раствор соответствующего количества противопенной присадки. После прекращения подачи источника углерода ферментация продолжается до тех пор, пока концентрация растворенного кислорода (pO₂) не достигнет 95% от значения насыщения. После этого ферментация останавливается. Отделение клеточной массы осуществляется путем сепарации в сепараторе тарельчатого типа. Оставшиеся клетки в надосадочной жидкости убиваются путем термической стерилизации. Концентрация D-пантотената составляет (после 48 часов ферментации) 13,7 г/л. После сепарации и стерилизации концентрация D-пантотената составляет 10,7 г/л. Аналогичным образом получают ферментационные растворы, в которых без добавки β-аланина концентрация пантотеновой кислоты составляет 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 и более 90 г/л.

3000 г приготовленного таким образом ферментационного раствора подвергают следующей обработке: к двум третям раствора при температуре примерно 10°С добавляют эквивалентное по концентрации многовалентных анионов количество хлорида кальция (40% раствор); к оставшейся трети раствора соответствующее эквивалентное количество гидроксида кальция (в твердом состоянии). Растворы на ночь помещают в холодильный шкаф и затем путем фильтрации под давлением (фильтр Seitz 700) отделяют от выпавшего осадка. После этого растворы смешивают и добавлением еще 10 г гидроксида кальция при температуре примерно 10°С смещают кислотность раствора в щелочную сторону (рН 8,7) и отстаивают. Выпавший осадок также отфильтровывают.

Затем 1800 г полученного раствора при температуре 35°С подвергают обессоливанию в трехкамерной электродиализной ячейке. При этом ферментационный раствор пропускается через одну из двух катионообменных мембран, ограничивающих камеру продукта. Со стороны катода камера продукта отделена от камеры концентрата моноселективной катионообменной мембраной (Tokuyama Soda, CMS), со стороны анода камера продукта отделена от камеры хлорида кальция катионообменной мембраной (Tokuyama Soda, CMX). Камеры концентрата и хлорида кальция отделены друг от друга анионообменной мембраной (Tokuyama Soda, AMX). В камеру концентрата добавляют 750 г 0,5%-ного раствора хлорида натрия, а в камеру хлорида кальция 900 г 3,05%-ного раствора хлорида кальция. В электродной системе циркулирует 0,1 молярный раствор сульфата натрия. Процесс проводили гальваностатически при плотности тока 30 мА/см² в ячейке, состоящей из пяти вышеописанных камер общей площадью мембранной поверхности 500 см² в замкнутом объеме. Критерием прекращения процесса являлось снижение проводимости в камере хлорида кальция до 4 мс/см. Результаты анализа катионного состава растворов в камере продукта и камере концентрата приводятся в следующей таблице.

 PTS [г/л]Са²⁺Na⁺К⁺NH₄ ⁺5329/01/82 Продукт t=0 ч9,270,24%0,15%0,65%0,24%5329/01/82 Продукт t=0,83 ч9,010,43%0,07%0,25%0,06%5329/01/82 Концентрат t=0 ч0,00,0%0,2%0,0%0,0%5329/01/82 Концентрат t=0,83 ч0,0150,02%0,47%0,71%0,29%

При этом снижение концентрации одновалентных ионов составляет 51% для натрия, 66% для аммония и 61% для калия. Средний выход по току составляет 82%. Потери D-пантотеновой кислоты за счет попадания в две соседние камеры составляет 0,08% от общего количества вещества. Значение рН в камере продукта в процессе диализа составляет от 7 до 7,5, в камере концентрата и хлорида кальция примерно 6. Общее падение напряжения в процессе диализа с уменьшением проводимости в камере хлорида кальция увеличивалось примерно от 11 до 16 В.

Подвергшийся такому электродиализу раствор затем подвергается распылительной сушке для получения конечного продукта. Это свидетельствует о том, что при соответствующей предварительной обработке можно использовать электродиализ в трехкамерной ячейке с моноселективными катионообменными мембранами для обмена одновалентных ионов на двухвалентные катионы с целью повышения эффективности распылительной сушки конечного продукта.

Изобретение относится к пищевой промышленности. Смесь D-пантотеновой кислоты и ее солей получают культивированием микроорганизма, который продуцирует D-пантотеновую кислоту, в котором нарушена регуляция биосинтеза пантотеновой кислоты-(pan) и/или изолейцина/валина-(ilv), и который в процессе ферментации в культуральной среде производит, по меньшей мере, 2 г/л соли D-пантотеновой кислоты, причем в культуральную среду не добавляют свободный β-аланин и/или соли β-аланина, затем ферментационный раствор, содержащий D-пантотенат, под воздействием электрического поля пропускают через одну или несколько ионоселективных мембран, в результате чего низкомолекулярные ионы удаляются из содержащего D-пантотенат раствора, причем содержание в нем солей D-пантотеновой кислоты в виде одновалентных катионов снижают до концентрации меньше или равной 1 г/кг, рН раствора, содержащего свободную D-пантотеновою кислоту, добавлением кальциевых и/или магниевых оснований доводят до значения 3-10, при этом получают раствор, содержащий пантотенат кальция и/или магния, и раствор, содержащий пантотенат кальция и/или магния, подвергают сушке и/или формовке. Состав, полученный таким способом, используют в качестве кормовой добавки. Заявленное изобретение позволяет упростить процесс получения смеси пантотеновой кислоты и ее солей, а также снизить количество нежелательных примесей. 2 н. и 21 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ получения смеси D-пантотеновой кислоты и ее солей, заключающийся в том, что

a) используют, по меньшей мере, один микроорганизм, продуцирующий D-пантотеновую кислоту, в котором нарушена регуляция биосинтеза пантотеновой кислоты-(pan) и/или изолейцина/валина-(ilv) и который в процессе ферментации в культуральной среде производит, по меньшей мере, 2 г/л соли D-пантотеновой кислоты, причем в культуральную среду не добавляют свободный β-аланин и/или соли β-аланина,

b) ферментационный раствор, содержащий D-пантотенат, под воздействием электрического поля пропускают через одну или несколько ионоселективных мембран, в результате чего низкомолекулярные ионы удаляются из содержащего D-пантотенат раствора, причем содержание в нем солей D-пантотеновой кислоты в виде одновалентных катионов снижают до концентрации, меньшей или равной 1 г/кг,

c) рН раствора, содержащего свободную D-пантотеновою кислоту, добавлением кальциевых и/или магниевых оснований доводят до значения 3-10, при этом получают раствор, содержащий пантотенат кальция и/или магния, и

d) раствор, содержащий пантотенат кальция и/или магния, подвергают сушке и/или формовке.