СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РИБОФЛАВИНА Российский патент 2025 года по МПК C12N1/21 C12P25/00 C12R1/125 

Область техники

Настоящее изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способу получения рибофлавина с использованием бактерий, принадлежащих к роду Bacillus.

Уровень техники

Рибофлавин (витамин В₂) является важнейшим соединением для высших животных, включая человека. Недостаток рибофлавина приводит к задержке роста, воспалению кожных покровов, конъюнктивиту, ухудшению зрения и другим нарушениям. В животноводстве рибофлавин используют в качестве обязательного компонента кормов для интенсивного выращивания скота и птицы. Кроме того, рибофлавин используют в качестве пищевого красителя, например, в майонезах, мороженом и других продуктах.

Рибофлавин получают как химическими, так и микробиологическими методами. В химических методах рибофлавин обычно получают как конечный продукт сложного многостадийного процесса, в котором используют дорогостоящее исходное сырье D-рибозу. В микробиологических методах для получения рибофлавина используют различные микроорганизмы, прежде всего бактерии рода Bacillus.

Описаны мутанты Bacillus subtilis, полученные селекцией на аналогах пуринов, азагуанине и азаксантине, продуцирующие существенные количества рибофлавина (U.S. Pat. №3,900,368).

Было показано, что мутантные штаммы Bacillus subtilis, обладающие активностью по высвобождению фосфорной кислоты из 5'-гуаниловой кислоты, способны к продукции рибофлавина (ЕР 0531708 В1).

Также было показано, что мутантные штаммы Bacillus subtilis, селектированные по устойчивости к розеофлавину и 8-азагуанину и содержащие мутацию в гене ribC, производят рибофлавин (АС СССР 908092).

Был получен штамм Bacillus subtilis 304/рМХ45, содержащий плазмиду с rib опероном из Bacillus subtilis, обладающий повышенной способностью к продукции рибофлавина (до 3.5 г/л) (патент Франции 2546907).

Описан штамм Bacillus subtilis 62/рМХ30 ribO186, продуцирующий до 12.5 г/л рибофлавина в течение 42 часов ферментации (патент РФ 2081906). Штамм Bacillus subtilis 62/рМХ30 ribO186 был получен из штамма Bacillus subtilis RK6121 как мутант, устойчивый к 8-азагуанину, метионинсульфоксиду, диацетилу и псикофуранину и дополнительно содержащий плазмиду с мутантным (мутация в гене ribO) rib опероном из Bacillus subtilis.

Известен штамм Bacillus subtilis RB50::[pRF69]₆₀(Ade⁺), несущий модифицированный рибофлавиновый оперон, содержащий два промотора SP01-15, который продуцировал 13.0-14.0 г/л рибофлавина в течение 48 часов и 15 г/л рибофлавина в течение 56 часов (US Pat. 5,925,538) при выращивании на стандартных коммерческих средах и в стандартных коммерческих условиях.

Известен разработанный способ получения рибофлавина с использованием штаммов Bacillus subtilis, содержащих дерегулированный rib оперон из Bacillus amyloliquefaciens или обладающих способностью к утилизации глицерофосфата и устойчивых к ингибированию роста глиоксилатом (патент РФ 2261273, штаммы B.subtilis GM51/pMX45, GM41/pMX45, GM44/pMX45). При выращивании в 1 л ферментере в течение 70 ч штаммы B.subtilis GM51/pMX45 производил 15 г/л рибофлвина, штаммы GM41/pMX4 - 18 г/л рибофлвина, штаммы B.subtilis GM44/pMX455 - 21 г/л рибофлвина. В способе согласно изобретению выращивание бактерии, принадлежащей к роду Bacillus, выделение и очистка рибофлавина из культуральной жидкости могут быть осуществлены способом, подобным традиционным способам получения рибофлавина методом ферментации с использованием бактерии.

Несмотря на значительный прогресс в получении штаммов - продуцентов и разработке способов микробиологического получения сохраняется потребность в разработке более эффективных процессов получения рибофлавина для того, чтобы удовлетворить растущий спрос на этот витамин.

Настоящее изобретение позволило улучшить один из эффективных способов получения рибофлавина.

Раскрытие изобретения

Технической проблемой на которую направлено настоящее изобретения является улучшение способа получения рибофлавина.

Техническим результатом, на достижение которого направлено заявленное изобретение, является, обеспечение сокращения времени ферментации и увеличение выхода рибофлавина за счет добавления в ферментационную среду соевой муки и использования вместо мочевины сернокислого аммония.

Технический результат достигается тем, что предложен способ получения рибофлавина, включающий стадии выращивания бактерии Bacillus subtilis - продуцента рибофлавина и выделения рибофлавина из культуральной жидкости, при этом в ферментационную среду дополнительно добавляют соевую муку и используют вместо мочевины сернокислый аммоний, соевую муку и сернокислый аммоний добавляют в среду в количестве 5-20 г/л и 5-10 г/л, соответственно.

Также:

предпочтительное количество соевой муки и сернокислого аммония составляет 10 г/л и 7,2 г/л, соответственно;

в качестве штамма используют B.subtilis GM44/pMX45; в качестве штамма используют B.subtilis GM41/pMX45.

Предложенный способ по сравнению со способом, описанном в патенте РФ 2261273, обеспечивает сокращение времени ферментации с 72 до 60 ч и увеличение выхода рибофлавина путем добавления в ферментационную среду соевой муки и использования вместо мочевины сернокислого аммония.

Осуществление изобретения

Предложен способ получения рибофлавина, включающий стадии выращивания Bacillus subtilis в питательной среде и выделения рибофлавина из культуральной жидкости, отличающийся от решения известного из патента РФ 2261273 тем, что в питательную среду добавляют соевую муку и используют для питательной среды вместо мочевины сернокислый аммоний.

В способе согласно настоящему изобретению выращивание бактерии, принадлежащей к роду Bacillus, выделение и очистка рибофлавина из культуральной жидкости могут быть осуществлены способом, описанным в патенте РФ 2261273.

Продукция рибофлавина осуществляют путем выращивания-бактерии в аэробных условиях от 50 до 70 часов, предпочтительно 60 часов, при температуре от 37 до 45°С, предпочтительно 40°С и значениях рН - от 6,5 до 7,5, предпочтительно 7.0, которые поддерживают, используя неорганические и органические кислые и основные соединения, а также газообразный аммиак.

Рибофлавин может быть выделен из культуральной жидкости любым или комбинацией любых известных методов, таких как методики с использованием ионообменной хроматографии и осаждение (патент РФ2261273).

Условия продукции рибофлавина соответствуют условиям известного способа, за исключением того, что ферментационная среда содержит соевую муку и сернокислый аммоний вместо мочевины (см. табл.). Биосинтез рибофлавина проводили в 1 л ферментерах.

Питательная среда для продукции рибофлавина может быть, как синтетической, так и натуральной при условии, что она содержит источники углерода, азота, неорганические ионы и другие необходимые органические компоненты. В качестве источника углерода могут быть использованы сахара, такие как глюкоза, лактоза, фруктоза, мальтоза, и гидролизат крахмала; органические кислоты и подобные соединения. В качестве источника азота могут быть использованы неорганические соли азота, такие как сульфат аммония, хлорид аммония и фосфат аммония или газообразный аммиак, водный раствор аммиака. Дрожжи, дрожжевой экстракт и подобные соединения присутствовали в подходящих количествах в качестве органических питательных добавок. Кроме того, небольшие количества фосфата кальция, сульфата магния, ионов железа, марганца и подобных соединений могут быть добавлены, если это необходимо.

В одном из вариантов осуществления изобретения штаммом - продуцентом рибофлавина является Bacillus sublilis GM44/pMX 45 (патент РФ 2261273). В другом варианте осуществления изобретения штаммом - продуцентом рибофлавина является B.subtilis GM41/pMX45 (патент РФ 2261273).

Оба штамма содержат rib оперон из Bacillus amyloliquefaciens в хромосоме этой бактерии и обладают способностью к утилизации глицерофосфата и устойчивостью к ингибированию роста глиоксилатом.

В одном из вариантов изобретения используют соевую муку в количестве 5 г/л.

В другом варианте изобретения используют соевую муку в количестве 20 г/л. В еще одном варианте количество соевой муки составляет 10 г/л. В одном варианте изобретения используют сернокислый аммоний в количестве 10 г/л.

В другом варианте изобретения используют сернокислого аммония в количестве 5 г/л.

В еще одном варианте количество сернокислого аммония составляет 7,2 г/л. Ниже изобретение иллюстрируется следующими примерами, представленными для подтверждения, но не ограничения объема притязаний. Примеры среды и штаммов приведены в табл.

В одном из осуществлений настоящего изобретения используют бактерию Bacillus sublilis GM44/pMX45, обладающую способностью к продукции рибофлавина, причем продукция рибофлавина увеличена путем ведения в хромосому бактерии rib оперона из Bacillus amyloliquefaciens.

Термин «rib оперон» означает фрагмент хромосомы, содержащий гены, кодирующие белки, существенные для продукции рибофлавина, rib оперон в бактериях, принадлежащих к роду Bacillus, содержит следующие гены: ген ribO, кодирующий регуляторный элемент, ген ribG, кодирующий деаминаза/редуктазу, ген ribB, кодирующий рибофлавинсинтазу (α-субъединицу), ген ribA, кодирующий ГТФ-циклогидролазу/3,4-дигидрокси-2-бутанон-4-фосфатсинтазу, ген ribH, кодирующий лимазинсинтетазу, и ген ribT.

Штамм B.subtilis GM44/pMX45 был получен из штамма B.subtilis GM41/pMX45 как спонтанный мутант, устойчивый к глиоксилату в концентрации 1 мг/мл. Штамм B.subtilis GM44/pMX45 был получен селекцией на минимальной питательной среде Спицайзена, содержащей 1 мг/мл глиоксилата и глицерофосфат (0.1%) вместо глюкозы.

Штамм B.subtilis GM44/pMX45 был депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 113545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) под инвентарным номером ВКПМ В-8387.

Штамм B.subtilis GM44/pMX45 производил 21 г/л рибофлавина в течение 70 часов ферментации в ферментерах объемом 1 л. в соответствии со способом по патенту РФ 2261273.

В соответствии с заявленным способом штамм B.subtilis GM44/pMX45 производил от 19, 6 до 21, 3 г/л рибофлавина в течение 60 часов ферментации в ферментерах объемом 1 л (Примеры 1, 2, 3).

В другом варианте настоящего изобретения используют бактерию Bacillus sublilis GM41/pMX 45, обладающую способностью к продукции рибофлавина, которая обусловлена введением в хромосому бактерии rib оперона из Bacillus amyloliquefaciens.

Штамм B.subtilis GM41/pMX45 был депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 113545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) под инвентарным номером ВКПМ В-8386.

Штамм B.subtilis GM41/pMX45 производил 18 г/л рибофлавина в течение 70 часов ферментации в ферментерах объемом 1 л, согласно способу по патенту РФ 2261273.

В соответствии с заявленным способом штамм B.subtilis GM41/pMX45 производил от 18, 3 до 19, 3 г/л рибофлавина в течение 60 часов ферментации в ферментерах объемом 1 л (Примеры 1, 2, 3).

Пример 1. Способ получения рибофлавина

Продукция рибофлавина осуществляют путем выращивания-бактерии в аэробных условиях в течение 60 часов при температуре 39°С и значении рН=7.0, которое поддерживают, используя неорганические и органические кислые и основные соединения, а также газообразный аммиак.

Рибофлавин выделяют из культуральной жидкости любым или комбинацией любых известных методов, таких как методики с использованием ионообменной хроматографии и осаждение (патент РФ2261273).

Условия продукции рибофлавина соответствуют условиям известного способа (патент РФ2261273), за исключением того, что ферментационная среда содержит соевую муку в количестве 20 г/л и сернокислого аммония вместо мочевины в количестве 10 г/л

Биосинтез рибофлавина проводили в 1 л ферментерах.

Посевную культуру (50 мл) получали путем выращивания штамма/ов в колбах на роторной качалке (200-220 об/мин) в течение 18 часов при 37°С.

Посевная среда:

Сахароза 20.0 г/л Дрожжевой автолизат 10.0 г/л MgSO₄×6H₂O 1.0 г/л Эритромицин, 10 мкг/мл рН перед стерилизацией 7.1-7.2

Состав начальной среды и подпитки согласно заявленному способу представлены в табл. 1. В ходе выращивания штамма/ов контролировали остаточные концентрации Сахаров (фруктоза, глюкоза, сахароза и мальтоза). Обычно режим подпитки выбирали таким образом, чтобы общая концентрация Сахаров не превышала 10 г/л.

Условия продукции рибофлавина были следующими:

перемешивание - 1100 об/мин,

температура - 39°С,

аэрация - 1:1 (v/v),

значение рН - 7.0±0.2 (поддерживаемое с помощью 6% водного раствора аммиака и 5% серной кислоты).

Количество произведенного рибофлавина определяли спектрофотометрически при 464 нм и подтверждали обращенно-фазовой ВЭЖХ (элюент - 34% метанол).

Штамм GM44/pMX 45 произвел 21,3 г/л рибофлавина в течение 60 ч при ферментации в ферментере объемом 1 л в соответствии с заявленным способом.

Штамм GM41/pMX 45 произвел 18,3 г/л рибофлавина в течение 60 ч при ферментации в ферментере объемом 1 л в соответствии с заявленным способом.

Пример 2

Условия получения рибофлавина соответствовали условиям, описанным в Примере 1 при содержании соевой муки 5 г/л и сернокислого аммония 5 г/л. Штамм GM44/pMX 45 произвел 19,6 г/л рибофлавина в течение 60 ч при ферментации в ферментере объемом 1 л.

Штамм GM41/pMX 45 произвел 19,3 г/л рибофлавина в течение 60 ч при ферментации в ферментере объемом 1 л в соответствии с заявленным способом.

Пример 3

Условия получения рибофламина соответствовали условиям, описанным в Примере 1 при содержании соевой муки 10 г/л и сернокислого аммония 7,2 г. мл.

Штамм GM41/pMX 45 произвел 19,0 г/л рибофлавина в течение 60 ч при ферментации в ферментере объемом 1 л.

Штамм GM44/pMX 45 произвел 20,5 г/л рибофлавина в течение 60 ч при ферментации в ферментере объемом 1 л.

Таким образом, предложенный способ по сравнению со способом, описанном в патенте РФ 2261273, обеспечивает сокращение времени ферментации с 72 до 60 ч и увеличение выхода рибофлавина путем добавления в ферментационную среду соевой муки и использования вместо мочевины сернокислого аммония.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения рибофлавина, включающий стадии выращивания бактерии Bacillus subtilis - продуцента рибофлавина в ферментационной среде, включающей сахарозу, дрожжи сухие, кукурузный экстракт, фосфат калия однозамещенный, фосфат калия двузамещенный, в аэробных условиях и выделения рибофлавина из культуральной жидкости, при этом в ферментационную среду дополнительно добавляют соевую муку в количестве 5-20 г/л и сернокислый аммоний в количестве 5-10 г/л, поддерживая значение рН ферментационной среды 7,0±0,2. Изобретение обеспечивает повышение выхода целевого продукта. 1 табл., 3 пр.

Способ получения рибофлавина, включающий стадии выращивания бактерии Bacillus subtilis - продуцента рибофлавина в ферментационной среде, включающей сахарозу, дрожжи сухие, кукурузный экстракт, фосфат калия однозамещенный, фосфат калия двузамещенный, в аэробных условиях, и выделения рибофлавина из культуральной жидкости, отличающийся тем, что в ферментационную среду дополнительно добавляют соевую муку в количестве 5-20 г/л и сернокислый аммоний в количестве 5-10 г/л, поддерживая значение рН ферментационной среды 7,0±0,2.