ОБЛАДАЮЩАЯ СЫПУЧЕСТЬЮ КОРМОВАЯ ДОБАВКА, СОДЕРЖАЩАЯ D-ПАНТОТЕНОВУЮ КИСЛОТУ И/ИЛИ ЕЕ СОЛИ, И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2006 года по МПК A23K1/16 

Изобретение относится к обладающим сыпучестью добавкам к корму для животных, получаемым на основе сбраживаемой среды, которые содержат D-пантотеновую кислоту и/или ее соль, и к способу получения таких добавок.

Предпосылки создания изобретения

Производство пантотеновой кислоты во всем мире составляет несколько тысяч тонн в год. Большую часть производимой пантотеновой кислоты используют в качестве корма для продуктивного скота, такого как домашняя птица и свиньи. Потребность в пантотеновой кислоте постоянно возрастает.

Пантотеновую кислоту можно получать путем химического синтеза или биотехнологическими методами с помощью ферментации с использованием пригодных микроорганизмов в соответствующих питательных растворах. При химическом синтезе важным предшественником является D,L-пантолактон. Его получают с помощью многостадийного процесса из формальдегида, изобутилальдегида и цианида; на последующих стадиях процесса производят разделение рацемической смеси, осуществляют конденсацию D-пантолактона с β-аланином, в результате чего получают D-пантотеновую кислоту.

Как правило, в продажу поступает кальциевая соль D-пантотеновой кислоты. Широко применяют также кальциевую соль рацемической смеси D,L-пантотеновой кислоты.

Преимущество ферментативного способа получения с использованием микроорганизмов заключается в том, что при этом сразу получают требуемую стереоизомерную форму, а именно D-форму, не содержащую L-пантотеновую кислоту.

Как описано в заявках ЕР-А 0493060, ЕР-А 0590857 и WO 97/10340, различные виды бактерий, такие, например, как Escherichia coli, Arthrobacter ureafaciens, Corynebacterium erythrogenes, Brevibacterium ammoniagenes, а также дрожжи, такие, например, как Debaromyces castellii, в пригодных для ферментации условиях могут продуцировать D-пантотеновую кислоту. Наиболее пригодными микроорганизмами являются описанные в указанных документах производные штамма Escherichia coli IFO3547, такие, например, как штаммы FV5069/pFV31 или FV5069/pFV202.

Для получения D-пантотеновой кислоты ферментативным путем согласно методу, описанному в заявках ЕР-А 0493060, ЕР-А 0590857 и WO 97/10340, микроорганизм, способный продуцировать D-пантотеновую кислоту, культивируют в пригодной питательной среде и затем образовавшуюся D-пантотеновую кислоту с помощью сложной процедуры выделяют, очищают и превращают в форму кальциевой соли.

Пригодные питательные среды содержат источник углерода, такой, например, как глюкоза или гидролизат пшеничного крахмала или сахароза, или меласса, предшественники, такие, например, как β-аланин, D,L-пантоиновая кислота или D,L-пантолактон, источник азота, такой, например, как сульфат аммония, источник фосфора, такой, например, как фосфат калия, а также другие соли, микроэлементы и витамины и необязательно добавки, представляющие собой сложные среды, такие, например, как дрожжевой экстракт. Затем микроорганизмы инкубируют в этой среде при необходимом значении рН, соответствующей аэрации и перемешивании, в результате чего они секретируют D-пантотеновую кислоту.

Согласно существующему уровню техники, описанному в WO 96/33283 и ЕР-А 590857, кальциевую соль D-пантотеновой кислоты получают из содержащей пантотеновую кислоту сбраживаемой среды с помощью сложной процедуры выделения и очистки. После того как сначала с помощью фильтрации или центрифугирования отделяют биомассу, фильтрат подвергают дальнейшей обработке путем очистки с помощью активированного угля или хроматографии на колонках. После взаимодействия образовавшихся растворов с гидроксидом кальция происходит кристаллизация требуемой кальциевой соли.

Согласно методу, описанному в WO 96/33283, фильтрат обесцвечивают активированным углем, пропуская через первую колонку. Значение рН доводят до 3,0 с помощью концентрированной соляной кислоты и затем жидкость очищают, пропуская последовательно через две дополнительные колонки, упакованные активированным углем. Элюирование D-пантотеновой кислоты осуществляют с помощью метилового спирта. Затем после нейтрализации с помощью порошкообразного Са(ОН)₂ получают раствор, из которого D-пантотенат кальция получают путем кристаллизации при 5°С.

При использовании метода, описанного в ЕР-А 590857, фильтрат сначала очищают с помощью катионо- и анионообменных колонок. Элюирование осуществляют с помощью соляной кислоты. Затем полученную в результате элюирования фракцию нейтрализуют с помощью Са(ОН)₂, добавляют активированный уголь и смесь фильтруют. Затем полученный фильтрат экстрагируют низкомолекулярным спиртом (метанол, этанол, изопропанол) и путем кристаллизации получают D-пантотенат кальция.

Полученный описанными выше методами D-пантотенат кальция применяют в качестве кормовой добавки к корму для животных.

Задача изобретения

Согласно существующему уровню техники соли D-пантотеновой кислоты или D,L-пантотеновой кислоты получают путем химического синтеза или из сбраживаемых сред и затем добавляют в чистой форме к кормам.

Задачей настоящего изобретения является разработка более легко поддающихся обработке форм D-пантотеновой кислоты и ее солей и способов их обработки для применения в качестве добавки к кормам.

Описание изобретения

Изобретение относится к обладающей сыпучестью добавке к корму для животных, получаемой на основе сбраживаемой среды, которая содержит D-пантотеновую кислоту и/или ее соли и отличается тем, что она

а) содержит образовавшуюся в процессе ферментации биомассу в количестве от ≥0 до 100%;

б) содержит по меньшей мере большую часть других компонентов сбраживаемой среды;

в) находится в твердой форме, имеет распределение размеров частиц от 20 до 2000 мкм, предпочтительно от 50 до 800 мкм, более предпочтительно от 150 до 600 мкм, и обладает сыпучестью.

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения обладающая сыпучестью добавка к корму для животных, которая содержит D-пантотеновую кислоту и/или ее соли, отличается тем, что она дополнительно включает находящиеся в твердой форме содержащие хлориды компоненты в концентрации <3 мг/г добавки, предпочтительно <2 мг/г добавки и наиболее предпочтительно <1,5 мг/г добавки.

Согласно изобретению добавки, как правило, находятся в уплотненной, гранулированной, мелкогранулированной, но в любом случае в обладающей сыпучестью форме и содержат различные количества биомассы. Кажущаяся плотность составляет от 200 до 800 кг/м³, предпочтительно приблизительно от 400 до 700 кг/м³. Добавки являются легко текучими и стабильными при хранении.

Если биомассу удаляют, то, как правило, удаляют и другие неорганические твердые компоненты, например те, которые добавляли в процессе ферментации. Кроме того, добавка по изобретению содержит по меньшей мере большую часть других, прежде всего органических субстанций, которые образовались или были добавлены в процессе ферментации и растворены в сбраживаемой среде, если их не удалили в результате соответствующего процесса.

Такие субстанции включают органические побочные продукты, которые продуцируются и секретируются используемыми для ферментации микроорганизмами в дополнение к D-пантотеновой кислоте. К ним относятся L-аминокислоты, выбранные из группы, включающей L-метионин, L-лизин, L-валин, L-треонин, L-аланин или L-триптофан, прежде всего L-валин. Они могут включать также органические кислоты, несущие 1-3 карбоксильные группы, такие, например, как уксусная кислота, молочная кислота, лимонная кислота, яблочная кислота или фумаровая кислота. Наконец, они могут включать также сахара, такие, например, как трегалоза. Включение таких соединений может оказаться целесообразным, поскольку они повышают питательную ценность добавки.

В предпочтительном варианте получают сбраживаемую среду, содержащую D-пантотеновую кислоту и/или ее соли, причем

а) ферментацию осуществляют в среде, практически не содержащей хлоридов,

б) образовавшуюся сбраживаемую среду необязательно после удаления биомассы и концентрирования сушат, уплотняют, сушат распылением, гранулируют распылением или гранулируют или наносят на носитель или погружают в стабилизирующую матрицу.

В способе по изобретению можно применять сбраживаемые среды, которые получают с использованием микроорганизмов, пригодных для получения D-пантотеновой кислоты, и которые содержат D-пантотеновую кислоту и/или ее соли. Соли предпочтительно представляют собой натриевую, калиевую, аммонийную, магниевую или кальциевую соль.

Микроорганизмы могут представлять собой грибы или дрожжи, такие, например, как Debaromyces castellii, или грамположительные бактерии, например, из рода Corynebacterium, или грамотрицательные бактерии, например, из семейства Enterobacteriaceae. Среди семейства Enterobacteriaceae следует особо отметить род Escherichia и вид Escherichia coli. Внутри вида Escherichia coli следует особо отметить так называемые штаммы группы К-12, например, такие штаммы, как MG1655 или W3110 (Neidhard и др.: Escherichia coli and Salmonella. Cellular and Molecular Biology (ASM Press, Washington D.C.)) или штамм Escherichia coli дикого типа IFO3547 (Institut für Fermentation, Osaka, Japan) и полученные из них мутанты. Среди штаммов, выведенных из IFO3547, наиболее предпочтительными являются FV5069/pFV31 (EP-A 0590857) и FV5069/pFV202 (WO 97/10340). Из представителей рода Corynebacterium следует особо отметить вид Corynebacterium glutamicum.

Для продуцирования пантотеновой кислоты описанные выше микроорганизмы можно культивировать непрерывно или периодически с использованием периодического процесса, или периодического процесса с подпиткой, или периодического процесса с повторяющейся подпиткой. Обзор известных способов культивирования приведен в учебнике Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (изд-во Gustav Fischer, Stuttgart, 1991)) или в учебнике Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (изд-во Vieweg, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).

Используемая культуральная среда должна быть адаптирована соответствующим образом к требованиям конкретного микроорганизма. Сбраживаемая среда практически не содержит хлоридов. Согласно изобретению концентрация ионов хлора в ферментере для получения продукта составляет <300 мг/л, предпочтительно <200 мг/л и более предпочтительно <150 мг/л. В качестве источника углерода можно использовать сахара и углеводы, такие, например, как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, меласса, крахмал и целлюлоза, масла и жиры, такие, например, как соевое масло, подсолнечное масло, арахисовое масло и кокосовое масло, жирные кислоты, такие, например, как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линолевая кислота, спирты, например, такие, как глицерин и этанол, и органические кислоты, такие, например, как уксусная кислота. Эти вещества можно применять индивидуально или в виде смеси. В качестве источника азота можно применять органические азотсодержащие соединения, такие, как пептоны, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, солодовый экстракт, жидкость, образующуюся после замачивания зерен кукурузы до разбухания, соевую муку и мочевину, или неорганические соединения, такие, как сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония. Источники азота можно применять индивидуально или в виде смеси. В качестве источника фосфора можно применять кислый фосфат калия или дикалийгидрофосфат, или соответствующие натриевые соли. Кроме того, культуральная среда должна содержать соли металлов, такие, например, как сульфат магния или сульфат железа, которые необходимы для роста. Наконец, в дополнение к вышеназванным соединениям можно использовать такие важные для роста вещества, как аминокислоты и витамины. Кроме того, в культуральную среду можно добавлять предшественники D-пантотеновой кислоты, такие как аспартат, β-аланин, кетоизовалерат, кетопантоиновая кислота или пантоиновая ислота и при необходимости их соли. Вышеуказанные добавки можно вводить в культуральную среду в виде одноразовой добавки или добавлять соответствующим образом в процессе культивирования.

Для контроля значения рН применяют аммиак или аммиачную воду или другие основания, такие как гидроксид натрия, гидроксид калия или гидроксид кальция. Если для контроля значения рН требуются кислоты, то целесообразно применять фосфорную или серную кислоту. Для того чтобы получать непосредственно кальциевую соль пантотеновой кислоты, в процессе ферментации применяют гидроксид кальция в форме водной суспензии. Для контроля пенообразования можно применять противовспенивающие вещества, такие, например, как полигликолевые эфиры жирных кислот. Для поддержания стабильности плазмид в среду необязательно можно добавлять соответствующие обладающие избирательным действием вещества, например, антибиотики. Для поддержания аэробных условий в культуру вводят кислород или содержащие кислород газовые смеси, такие, например, как воздух. Температура культивирования, как правило, составляет 20-45°С, предпочтительно 35-40°С. Культивирование продолжают до тех пор, пока не образуется максимальное количество D-пантотеновой кислоты. Как правило, эта цель достигается в течение периода времени от 10 до 160 ч.

Полученные таким образом сбраживаемые среды, как правило, имеют содержание сухого вещества от 7,5 до 25 мас.% и содержат от 2 до 20 мас.% D-пантотеновой кислоты. Наиболее предпочтительными являются процессы ферментации, при которых после завершения процесса ферментации содержание D-пантотеновой кислоты в виде сухого вещества составляет по меньшей мере 20 мас.%. Целесообразно также ограничивать количество сахара в сбраживаемой среде по меньшей мере в конце периода ферментации, предпочтительно по меньшей мере в течение 30% периода ферментации. Это означает, что в течение этого периода времени концентрацию применяемого сахара в сбраживаемой среде поддерживают на уровне от ≥0 до 3 г/л или снижают до указанного уровня.

Для приготовления добавок по изобретению из сбраживаемых сред, содержащих D-пантотеновую кислоту и/или ее соли, предпочтительно сначала полностью или частично удаляют биомассу с помощью известных методов разделения, таких, например, как центрифугирование, фильтрация, декантация или комбинация указанных методов. Однако согласно изобретению можно также всю биомассу оставлять в сбраживаемой среде. Затем полученную таким образом суспензию концентрируют предпочтительно до получения содержания сухого вещества не более чем 60 мас.% и обрабатывают с получением порошка, например, с помощью распылительной сушилки или устройства для лиофилизации. После этого порошок с помощью соответствующих методов уплотнения или грануляции превращают в крупнозернистый, легко текучий, обладающий способностью храниться и практически беспылевой продукт. При осуществлении грануляции или уплотнения предпочтительно применяют обычные органические или неорганические вспомогательные вещества или носители, такие как крахмал, желатин, производные целлюлозы или аналогичные вещества, которые обычно применяют в качестве связующих веществ, желирующих агентов или наполнителей при обработке кормовых продуктов или кормов, или другие вещества, такие, например, как диоксид кремния, силикаты или стеараты.

Для того чтобы общая концентрация D-пантотеновой кислоты и/или ее солей в кормовой добавке составляла приблизительно от 20 до 80 мас.%, к сбраживаемой среде, полученной после удаления воды, и от ≤0 до 100% биомассы, образовавшейся в процессе ферментации, добавляют указанную кислоту и/или ее соли. Причем соли выбирают из группы, включающей натриевую, калиевую, аммонийную, магниевую или кальциевую соль.

В альтернативном варианте продукт можно добавлять к известному и обычно применяемому при обработке кормов органическому или неорганическому носителю, такому, например, как диоксид кремния, силикаты, кормовая мука, отруби, мука различных видов, крахмалы, сахара или т.п. и/или стабилизировать с помощью обычно применяемых наполнителей или связующих веществ. Соответствующие примеры и методы описаны в литературе (Die Mühle + Mischfuttertechnik 132, 49, стр.817 (1995)).

Новые твердые продукты по изобретению, которые содержат D-пантотеновую кислоту и/или ее соли и которые можно получать с помощью описанного выше процесса, содержат от 20 до 80 мас.%, предпочтительно от 30 до 75 мас.% D-пантотеновой кислоты. Как правило, они содержат неорганические компоненты в количестве от 2,5 до 25 мас.% и необязательно органические побочные продукты в количестве от >0 до 30 мас.%. Содержание сухой биомассы составляет от ≥0 до 35 мас.%. Содержание воды предпочтительно составляет <5 мас.%.

Новые продукты по изобретению, которые содержат D-пантотеновую кислоту и/или ее соли и которые можно получать с помощью описанного выше процесса, характеризуются тем, что имеют распределение размеров частиц от 20 до 2000 мкм, предпочтительно от 50 до 800 мкм и наиболее предпочтительно от 150 до 600 мкм. Содержание очень тонкой пыли (<10 мкм) составляет приблизительно от 0 до 10 мас.%, предпочтительно от 0 до 5 мас.%. Продукт применяют в качестве кормовой добавки.

Концентрацию D-пантотеновой кислоты можно определять известными методами (Velisek; Chromatographic Science 60, 515-560 (1992)).

Распределение размеров частиц можно определять методами лазерной дифракционной спектрометрии. Соответствующие методы описаны в учебнике R.H.Müller и R.Schumann "Teilchengrössenmessung in der Laborpraxis", Wissenschaftliche Verlaggesellschaft Stuttgart (1996) или в учебнике М.Rhodes "Introduction to Particle Technology", изд-во Wiley & Sons (1998).

Примеры

Ниже настоящее изобретение более подробно пояснено с помощью примеров. Для этой цели были проведены тесты с использованием продуцирующего D-пантотеновую кислоту штамма Escherichia coli 5069/pFV31, который в соответствии с Будапештским договором депонирован под регистрационным номером FERM-BP 4395 в Институте исследований в области ферментации Агентства промышленных исследований в области науки и технологии, 1-1-3, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki (Япония) (ЕР-А 0590857).

Измерения проводили с помощью лазерного дифракционного спектрометра типа Cilas 920 фирмы Quanto Chrome (Одельзхаузен, Германия). Обработку результатов измерений для определения распределения размеров частиц проводили согласно Немецкому Промышленному Стандарту DIN 66141.

Пример 1

Получение кальциевой соли D-пантотеновой кислоты в сбраживаемой среде

1. Получение инокулята (мастер-банк клеток)

Образец штамма Escherichia coli FV5069/pFV31 помещали на LBG-агар, дополненный 50 мкг/мл ампициллина. Выращенную на агаровой пластине культуру инкубировали в течение 17 ч при 37°С и затем хранили в холодильнике при +4°С. Затем отбирали отдельные колонии и размножали в LBG-бульоне. LBG-бульон имел следующий состав: 10 г/л пептона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl и 1 г/л глюкозы. LBG-агар дополнительно содержал 12 г/л агара. Готовые к употреблению препараты можно получать от фирмы Gibco/BRL (Пейсли, Шотландия, Великобритания) в виде основы для LB-бульона или LB-агара. Затем после добавления 1 г/л глюкозы получали указанные среды. 10 мл культур, находящихся в колбах Эрленмейера объемом 100 мл, инкубировали в течение 16 ч при 37°С и 180 об./мин в термостате типа ESR фирмы Kühner AG (Бирсфельден, Швейцария). Затем суспензию клеток отделяли центрифугированием в течение 15 мин при 4000 об./мин с помощью центрифуги типа J-6B фирмы Beckmann (Ганновер, Германия). Клеточный дебрис ресуспендировали в 10 мл среды LBG, дополненной 20% глицерина, делили в стерильных условиях на 10 аликвот объемом по 1 мл каждая и замораживали при -70°С. Эти культуры использовали в качестве мастер-банка клеток.

Для получения рабочего банка клеток среду LBG, дополненную 50 мкг/мл ампициллина, делили на порции объемом 10 мл и помещали в колбы Эрленмейера объемом 100 мл, после чего инокулировали, используя 100 мкл культуры из описанного выше мастер-банка клеток. Инкубацию осуществляли в течение 16 ч при 37°С и 180 об./мин в термостате типа ESR фирмы Kühner AG (Бирсфельден, Швейцария).

После инкубации определяли оптическую плотность (ОП) суспензии культуры при длине волны 660 нм с помощью фотометра типа LP2W фирмы Dr.Lange (Берлин, Германия). Оптическая плотность составляла 3,5. Затем клеточную суспензию вносили в стерильных условиях в стерильные полиэтиленовые пробирки фирмы Greiner (Фрикенхаузен, Германия) объемом 30 мл и разделяли путем центрифугирования в течение 15 мин при 2500 об./мин с помощью центрифуги типа J-6B фирмы Beckmann (Ганновер, Германия). Затем отделенную биомассу ресуспендировали в 10 мл среды LBG, дополненной 20% глицерина. После этого клеточную суспензию в стерильных условиях вносили порциями по 500 мкл в стерильные пробирки объемом 1 мл фирмы Nalgene (Нью Йорк, США) и замораживали при -70°С. Полученные таким путем и помещенные на хранение партии продукта использовали в качестве рабочего банка клеток.

2. Получение сбраживаемой среды, содержащей D-пантотенат кальция

Для получения сбраживаемой среды, содержащей D-пантотенат кальция, культуру рабочего банка клеток сначала размножали во встряхиваемых колбах и затем полученную культуру использовали для инокуляции среды в предварительном ферментере. Культуру из предварительного ферментера использовали для инокуляции среды в ферментере для получения продукта.

Для культивирования во встряхиваемых колбах использовали среду СКА (таблица 1). Среду СКА получали следующим образом: 7,0 г (NH₄)₂SO₄, 0,5 г КН₂PO₄, 1,0 г К₂HPO₄, 0,5 г MgSO₄·7H₂O, 0,01 г MnSO₄·H₂O, 0,001 г ZnSO₄·7H₂O, 0,005 г Fe₂(SO₄)₃ и 20 г жидкости, полученной после замачивания зерен кукурузы до разбухания, значение рН которой предварительно доводили до 6,8 с помощью 25% аммиачного раствора, вносили в стеклянный стакан объемом 1 л и затем доводили с помощью дистиллированной воды до достижения общей массы 825 г. Этот солевой раствор, содержащий жидкость, полученную после зерен кукурузы до разбухания, стерилизовали в течение 20 мин в автоклаве при 121°С. Кроме того, приготавливали раствор, содержащий 25 г глюкозы и 0,002 г тиамина HCl, который доводили с помощью дистиллированной воды до достижения общей массы 125 г и стерилизовали фильтрацией. В колбу объемом 100 мл вносили 10 г СаСО₃ и стерилизовали в течение 20 мин в автоклаве при 123°С. Среду СКА получали путем объединения двух указанных выше компонентов с солевым раствором, содержащим жидкость, полученную после замачивания зерен кукурузы до разбухания.

Среду СКА вносили порциями по 12,5 мл в колбы Эрленмейера объемом 100 мл и затем инокулировали с помощью 0,5 мл клеточной суспензии. Используемую клеточную суспензию получали из помещенной ранее на хранение партии рабочей культуры клеток путем ее разбавления стерильным физиологическим раствором в соотношении 1:100. Инкубацию осуществляли в течение 20 ч при 32°С и 150 об./мин в термостате типа RC-1-TK фирмы Infors AG (Боттминген, Швейцария). Величина оптической плотности, которую измеряли при длине волны 660 нм (ОП 660), составляла 12,5.

Для инокуляции 20 кг среды А1-102 для предварительной культуры, находящейся в ферментере объемом 42 л, имеющим снабженный мешалкой реактор фирмы Bioengineering (модель LP-42, Вальд, Швейцария), 0,5 мл среды СКА разбавляли в соотношении 1:100 и 50 мл полученной суспензии вносили в ферментер. Компоненты среды А1-102 для предварительной культуры перечислены в таблице 2. Культуру выращивали в течение 15,5 ч при температуре 37°С, удельном объеме аэрации 0,5 об./об./мин, парциальном давлении кислорода, составляющем 20% от насыщающего давления в воздухе, и при значении рН 6,5 до достижения величины ОП 660, равной 11,3.

Для инокуляции 5830 г среды М1-380 для основной культуры, находящейся в ферментерах объемом 14 л, имеющих снабженный мешалкой реактор фирмы В. Braun (модель Biostat E/ED, фирма BBI, Мелзунген, Германия), добавляли 423 мл второй предварительной культуры в среде А1-102. Компоненты среды М1-380 для основной культуры перечислены в таблице 3. Сначала культуру выращивали в течение 6,5 ч при температуре 37°С, удельном объеме аэрации 0,75 об./об./мин, при минимальной скорости перемешивания 400 об/мин и при значении рН 6,5 до достижения величины ОП 660, равной 18,6, и парциального давления кислорода, составляющего 2% от насыщающего давления в воздухе. После этого культуру выращивали еще в течение 41 ч при температуре 37°С, парциальном давлении кислорода, составляющем 2% от насыщающего давления в воздухе, и при значении рН 6,0 до достижения величины ОП 660, равной 66,8. После осуществления ферментации в течении 13 ч добавляли в течение 34,5 ч раствор, содержащий 152,7 г β-аланина в 570 мл Н₂О. После осуществления ферментации в течение 21,5 ч для контроля значения рН добавляли в течение 26 ч 10%-ный раствор Са(ОН)₂. В течение 41 ч добавляли 3,43 кг среды М2-257, в которой концентрация глюкозы составляла 650,8 г/л и концентрация тиамин·HCl составляла 35,7 г/л.

Затем определяли оптическую плотность (ОП) при длине волны 660 нм с помощью цифрового фотометра типа LP1W фирмы Dr.Bruno Lange GmbH (Берлин, Германия) и с помощью ЖХВР (колонка типа Hypersil APS 2,5 мм, 250×5 мм, обнаружение в ИК-лучах) оценивали концентрацию образовавшейся D-пантотеновой кислоты.

Было установлено, что через 70,0 ч в образце, полученном после конечной ферментации, концентрация D-пантотената кальция, оцененная по количеству D-пантотеновой кислоты, составляла 49,7 г/л.

Содержание D-пантотеновой кислоты определяли на основе измерения RI (коэффициент отражения) с помощью устройства для ЖХВР (жидкостная хроматография высокого разрешения) типа М321 фирмы Knauer (Берлин, Германия) с использованием аминофазы Hypersil APS2 с размером частиц 5 мкм.

Таблица 1
Состав среды СКАКомпонентКонцентрация (на литр)глюкоза25,0 гжидкость, полученная после замачивания зерен кукурузы до разбухания20,0 г(NH₄)₂SO₄7,0 гКН₂PO₄0,5 гK₂HPO₄1,0 гMgSO₄·7H₂O0,5 гFeSO₄·7H₂O5 мгMnSO₄·H₂O10 мгZnSO₄·7H₂O1 мгСаСО₃10 гтиамин·HCl2 мгструктол0,7 гТаблица 2
Состав среды А1-102КомпонентКонцентрация (на литр)глюкоза25,0 гжидкость, полученная после замачивания зерен кукурузы до разбухания20,0 г(NH₄)₂SO₄7,0 гКН₂PO₄0,5 гК₂HPO₄1,0 гMgSO₄·7H₂O0,5 гFeSO₄·7H₂O10 мгMnSO₄·H₂O10 мгтиамин·HCl3 мгструктол0,6 гТаблица 3
Состав среды M1-380КомпонентКонцентрация (на литр)глюкоза18,0 гжидкость, полученная после замачивания зерен кукурузы до разбухания40,0 гβ-аланин15,0 г(NH₄)₂SO₄11,8 гКН₂PO₄0,6 гК₂HPO₄1,2 гMgSO₄·7H₂O0,67 гMnSO₄·H₂O10 мгтиамин·HCl1,6 мгструктол0,6 г

Пример 2

Получение тонкодисперсного D-пантотената кальция из сбраживаемой среды

Сначала биомассу отделяли от содержащей кальциевую соль D-пантотеновой кислоты сбраживаемой среды, полученной согласно процессу, описанному в примере 1, и содержащей приблизительно 4,9 мас.% D-пантотеновой кислоты. Для этой цели 90 литров указанной выше сбраживаемой среды фильтровали путем фильтрации в поперечном потоке с использованием микрофильтрующей мембраны с размером пор 0,22 мкм в фильтрационном устройстве типа CERAFLO MSP005756 фирмы Millipore (Бад-Хомбург, Германия).

Затем обработанную таким образом среду концентрировали в вакууме при 80°С с помощью роторного испарителя типа Rotavapor R-152 фирмы Büchi, Швейцария, получая жидкость с содержанием сухого вещества приблизительно 30%. После этого сконцентрированную таким путем среду сушили распылением, получая кальциевую соль D-пантотеновой кислоты. Для этой цели использовали промышленную распылительную сушилку типа NIRO Minor фирмы Niro (Копенгаген, Дания), снабженную распылительной пластиной (диаметр 120 мм; скорость вращения 135 м/с), при температуре на входе 175°С, температуре на выходе 80°С и объемном расходе сушильного газа 525 м³/ч. Для улучшения выделения продукта в поток сушильного газа дополнительно вводили порошкообразный Sipernat 22 фирмы Degussa-Hüls AG (Франкфурт-на-Майне, Германия) в количестве, составляющем 5 мас.% в пересчете на массу сухого вещества в концентрате.

Полученный таким путем содержащий D-пантотенат кальция продукт имел содержание D-пантотеновой кислоты 48,5%, обладал сыпучестью и имел кажущуюся плотность 460 кг/м³ и средний размер частиц 34 мкм.

Таблица 4Тип фракцииДиаметрСодержание (%)тонкодисперсная пыль<10 мкм10пыль10-20 мкм20порошок/пыль20-50 мкм50порошок>50 мкм20

Пример 3

Получение D-пантотената кальция, имеющего размер частиц >100 мкм, путем уплотнения с помощью валкового уплотнителя и просеивания

Содержащий кальциевую соль D-пантотеновой кислоты пылевидный продукт, полученный с помощью процесса, описанного в примере 2, содержащий приблизительно 48,5 мас.% D-пантотеновой кислоты и имеющий средний размер частиц 34 мкм, уплотняли с помощью валкового уплотнителя, снабженного сигарообразными валками (уплотнитель для фармацевтических целей типа L200/50 Р фирмы ВЕРЕХ), при сжимающем усилии от 40 до 90 Н. Скорость вращения валков составляла 10 оборотов в минуту. Затем полученный таким путем уплотненный продукт размалывали с помощью измельчающих сит до получения частиц, имеющих размеры 200-400 мкм. Данные о выходе отдельных фракций частиц обобщены в таблице 5.

Уплотненный продукт отличался существенно более низким содержанием тонкодисперсной пыли и обладал существенно более высокой сыпучестью по сравнению с исходным пылевидным продуктом.

Таблица 5Тип фракцииДиаметрСодержание (%)тонкодисперсная пыль<10 мкм5пыль10-50 мкм5мелкие частицы50-20020частицы среднего размера200-400 мкм50частицы более крупного размера>400 мкм20

Фракцию «частиц среднего размера» выделяли путем просеивания и она представляла собой требуемый продукт. Полученный таким путем продукт имел содержание D-пантотената кальция, оцененное по количеству D-пантотеновой кислоты, приблизительно 40,7 мас.% и кажущуюся плотность 630 кг/м³.

Пример 4

Получение D-пантотената кальция, имеющего средний размер частиц 200-400 мкм, путем грануляции наслаиванием в грануляторе с псевдоожиженным слоем.

4.1. Применение воды в качестве связующего вещества для грануляции

Содержащий кальциевую соль D-пантотеновой кислоты пылевидный продукт, который получали из сбраживаемого раствора, содержащего кальциевую соль D-пантотеновой кислоты, путем сушки распылением согласно процессу, описанному в примере 2, подвергали дальнейшей обработке в грануляторе с псевдоожиженным слоем при опрыскивании соответствующим количеством воды.

Для этой цели 300 г пылевидного продукта, содержащего кальциевую соль D-пантотеновой кислоты, полученного согласно процессу, описанному в примере 2, помещали в лабораторное устройство с псевдоожиженным слоем фирмы Aeromatics Niro (Копенгаген, Дания). С помощью дозирующего устройства впрыскивали 3 г воды в минуту при температуре псевдоожиженного слоя 50°С и температуре отходящего газа 30°С. Температура псевдоожиженного газа составляла 70-80°С. Распределение размеров частиц полученного таким путем продукта представлено в таблице 6.

Таблица 6Тип фракцииДиаметрСодержание (%)тонкодисперсная пыль<10 мкм1пыль10-50 мкм4мелкие частицы50-20020частицы среднего размера200-400 мкм75частицы более крупного размера>400 мкм0

Содержание D-пантотената кальция, оцененное по количеству D-пантотеновой кислоты, составляло 38,1 мас.%. В продукте практически отсутствовала пыль. Кажущаяся плотность составляла 310 кг/м³. Продукт обладал очень хорошей сыпучестью.

4.2. Применение концентрата, содержащего пантотенат кальция, в качестве связующего вещества для грануляции

В другом опыте пылевидный продукт, содержащий кальциевую соль D-пантотеновой кислоты, который получали из сбраживаемой среды, содержащей кальциевую соль D-пантотеновой кислоты, путем сушки распылением согласно процессу, описанному в примере 2, подвергали дальнейшей обработке в грануляторе с псевдоожиженным слоем путем опрыскивания соответствующим количеством концентрированного раствора кальциевой соли D-пантотеновой кислоты, имеющего содержание сухого вещества приблизительно 50 мас.%.

Для этой цели 1000 г пылевидного продукта, содержащего кальциевую соль D-пантотеновой кислоты, который получали согласно процессу, описанному в примере 2, помещали в лабораторное устройство периодического действия с псевдоожиженным слоем фирмы Glatt (Бинцен, Германия). В лабораторное устройство с псевдоожиженным слоем впрыскивали приблизительно 5 г указанного выше концентрата в минуту при температуре псевдоожиженного слоя приблизительно 40-45°С и температуре воздуха на входе приблизительно 80°С. Распределение размеров частиц полученного таким путем продукта представлено в таблице 7.

Таблица 7Тип фракцииДиаметрСодержание (%)тонкодисперсная пыль<10 мкм1пыль10-50 мкм2мелкие частицы50-20018частицы среднего размера200-400 мкм79частицы более крупного размера>400 мкм0

Содержание D-пантотената кальция, оцененное по количеству D-пантотеновой кислоты, составляло 38,9 мас.%. В продукте практически отсутствовала пыль. Кажущаяся плотность составляла 400 кг/м³.

С помощью описанного процесса или с помощью другого процесса распыления, использования псевдоожиженного слоя, перемешивания или смешения концентрат, содержащий D-пантотенат кальция или D-пантотеновую кислоту, наносят распылением на другие обычно применяемые органические или неорганические носители или вспомогательные субстанции, такие как диоксид кремния, силикаты, кормовая мука, отруби, мука различных видов, крахмалы, сахара или т.п., и гранулируют необязательно с использованием связующих веществ, желирующих агентов или других вспомогательных веществ, применяемых для приготовления композиций.

Пример 5

Получение D-пантотената кальция, имеющего средний размер частиц 100-400 мкм. путем смешения и грануляции в вакуумной сушилке.

Сначала биомассу отделяли от содержащей кальциевую соль D-пантотеновой кислоты сбраживаемой среды, которую получали согласно процессу, описанному в примере 1, и которая содержала приблизительно 4,9 мас.% D-пантотеновой кислоты. Для этой цели 90 литров указанной выше сбраживаемой среды фильтровали путем фильтрации в поперечном потоке с использованием микрофильтрующей мембраны с размером пор 0,22 мкм в фильтрационном устройстве типа CERAFLO MSP005756 фирмы Millipore (Бад-Хомбург, Германия).

Затем обработанную таким образом среду концентрировали в вакууме при 40-80°С с помощью роторного испарителя типа Rotavapor R-152 фирмы Büchi, Швейцария, получая жидкость с содержанием сухого вещества приблизительно 50 мас.%. Затем полученный таким путем содержащий кальциевую соль D-пантотеновой кислоты концентрат, содержание D-пантотеновой кислоты в котором составляло 28,8 мас.%, с помощью вакуумной сушилки (типа VT 130, фирма Gebrüder Lödige Maschinenbau GmbH, Падерборн, Германия) смешивали с диоксидом кремния (Sipernat 22 фирмы Degussa-Hüls AG, Франкфурт-на-Майне, Германия), получая свободно текучие гранулы. Сначала 15 кг диоксида кремния (Sipernat 22 фирмы Degussa-Hüls AG, Франкфурт-на-Майне, Германия) помещали в вакуумную сушилку (типа VT 130, фирма Gebrüder Lödige Maschinenbau GmbH, Германия) и затем в вакууме при давлении 200 мбар добавляли 39,0 кг полученного согласно описанному выше способу концентрата, содержащего кальциевую соль D-пантотеновой кислоты, со скоростью 2,0 кг/мин, при этом подлежащий смешению продукт имел температуру 45°С, а скорость перемешивания составляла 120 об/мин (оборотов в минуту). Затем процесс смешения продолжали еще в течение 15 мин, создавая более глубокий вакуум (до 50 мбар). После этого полученные таким путем гранулы, содержащие D-пантотенат кальция, сушили во встряхиваемой сушилке с псевдоожиженным слоем (фирма Escher-Wyss, Линден, Германия) до достижения остаточного содержания влаги менее 2 мас.%, при этом площадь поверхности псевдоожиженного слоя составляла 0,3 м², температура слоя 65°С, а расход сушильного газа составлял 270 м³/ч. В таблице 8 представлено распределение средних размеров частиц полученного продукта.

Таблица 8Тип фракцииДиаметрСодержание (%)тонкодисперсная пыль<10 мкм1пыль10-50 мкм2мелкие частицы50-2006частицы среднего размера200-400 мкм89частицы более крупного размера>400 мкм2

Содержание D-пантотената кальция, оцененное по количеству D-пантотеновой кислоты, составляло 38,6 мас.%. В продукте практически отсутствовала пыль. Кажущаяся плотность после сушки составляла 650 кг/м³.

С помощью описанного процесса или с помощью другого процесса распыления, использования псевдоожиженного слоя, перемешивания или смешения концентрат, содержащий D-пантотенат кальция или D-пантотеновую кислоту, можно наносить распылением на другие обычно применяемые органические или неорганические носители или вспомогательные субстанции, такие как диоксид кремния, силикаты, кормовая мука, отруби, мука различных видов, крахмалы, сахара или т.п., и гранулировать необязательно с использованием связующих веществ, желирующих агентов или других вспомогательных веществ, применяемых для приготовления композиций.

Изобретение относится к кормопроизводству. Предложена обладающая сыпучестью добавка к корму для животных, полученная на основе сбраживаемой среды, которая содержит D-пантотеновую кислоту и/или ее соли, причем она содержит от ≥0 до 100% биомассы, образующейся во время ферментации, и/или часть дополнительных компонентов, удаляемых из ферментационной жидкости, и содержит по меньшей мере большую часть других компонентов сбраживаемой среды, находится в твердой форме, имеет распределение размеров частиц от 20 до 2000 мкм, предпочтительно от 50 до 800 мкм, более предпочтительно от 150 до 600 мкм, и обладает сыпучестью; а также способ ее получения (варианты). Изобретение позволяет разработать более легко поддающуюся обработке форму D-пантотеновой кислоты и ее солей и способ ее получения для применения в качестве добавки к кормам. 3 н. и 9 з.п. ф-лы, 8 табл.

1. Обладающая сыпучестью добавка к корму для животных, полученная на основе сбраживаемой среды, которая содержит D-пантотеновую кислоту и/или ее соли, отличающаяся тем, что она

а) содержит от ≥0 до 100% биомассы, образующейся во время ферментации и/или часть дополнительных компонентов, удаляемых из ферментационной жидкости;

б) содержит по меньшей мере большую часть других компонентов сбраживаемой среды;

в) находится в твердой форме, имеет распределение размеров частиц от 20 до 2000 мкм, предпочтительно от 50 до 800 мкм, более предпочтительно от 150 до 600 мкм, и обладает сыпучестью.

а) из сбраживаемой среды, содержащей полученную в процессе ферментации D-пантотеновую кислоту, полностью или частично удаляют биомассу и/или часть других компонентов,

в) смесь, полученную в результате осуществления стадии а), концентрируют и

г) с помощью соответствующих методов получают обладающую сыпучестью добавку к корму для животных, имеющую распределение размеров частиц от 20 до 2000 мкм.

а) из сбраживаемой среды удаляют воду (концентрирование),

б) удаляют от ≥0 до 100% биомассы, образовавшейся в процессе ферментации,

в) к полученной согласно стадиям а) и б) сбраживаемой среде добавляют одно или несколько указанных соединений, при этом количество добавляемых соединений является таким, чтобы их общая концентрация в добавке к корму для животных составляла приблизительно от 20 до 80 мас.%, и

г) превращают добавку к корму для животных в требуемую порошкообразную, предпочтительно гранулированную форму.

а) сушки и уплотнения или

б) сушку распылением или

в) сушки распылением и грануляцией или

г) сушки распылением и грануляцией напылением.

а) из сбраживаемой среды, содержащей полученную в процессе ферментации D-пантотеновую кислоту, полностью или частично удаляют биомассу и/или часть других компонентов,

б) полученную таким путем смесь концентрируют и

в) содержащую пантотенат аммония кормовую добавку превращают с помощью соответствующих методов в обладающую сыпучестью форму и

г) с помощью соответствующих методов получают обладающую сыпучестью добавку к корму для животных, имеющую распределение размеров частиц от 20 до 2000 мкм.