Изобретение относится к области биотехнологии ферментных препаратов, может быть использовано для очистки и фракционирования целлюлолитических ферментов и касается способа получения аффинного адсорбента на основе гидроксиапатита.
Известен способ получения гидроксиапатита (прототип), включающий стадию получения брушита (СаНРО4) путем медленного сливания 0.5М растворов CaCl2 и Na2HPO4 (по 2 л), фильтрование брушита, его 4-кратную промывку тремя литрами воды, обработку суспензии брушита в 3 л воды 100 мл 40%-ного NaOH при кипячении в течение 1 часа (нагрев 45 мин) при постоянном медленном перемешивании, отделение гидроксиапатита от очень мутного супернатанта фильтрованием, 4-кратную промывку гидроксиапатита тремя литрами воды, 2-кратную обработку 0.01М фосфатным буфером (рН 6.8) при нагревании до 100°C и 2-кратную обработку 0.001М фосфатным буфером (рН 6.8) при кипячении в течение 15 мин (Справочник биохимика: Пер. с англ. / Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. - М.: Мир, 1991. - С.463).
Недостатками адсорбента, получаемого по данному способу, является низкая избирательность адсорбции целлюлолитических ферментов. Поэтому при фракционировании экзо- и эндоглюканаз на колонках необходимо использовать ступенчатый или линейный градиент концентрации буфера, а при разделении экзо- и эндоглюканаз с помощью адсорбции в объеме - ступенчатую промывку адсорбента, что усложняет процесс фракционирования.
Технический результат настоящего изобретения заключается в получении аффинного адсорбента на основе гидроксиапатита с высокой избирательностью адсорбции экзоглюканаз.
Технический результат достигается путем химического присоединения к поверхности гидроксиапатита субстрата целлюлолитических ферментов, например натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы.
Способ осуществляют следующим образом. Проводят стадию получения брушита путем медленного сливания растворов CaCl2 и Na2HPO4 аналогично тому, как это описано в прототипе. Для получения аффинного адсорбента к суспензии брушита добавляют раствор натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (Na-КМЦ) в пропорции от 2:1 до 1:1 по сухому веществу, доводят рН среды до 13.0 раствором гидроксида натрия и нагревают реакционную смесь в кипящей водяной бане в течение 1 часа при постоянном медленном перемешивании.
Для получения аффинного гидроксиапатита (адсорбента) может быть использован кристаллический гидроксиапатит. В этом случае предварительно проводят его активацию путем обработки орто-фосфорной кислотой при рН среды от 4.0 до 4.5.
При нагревании брушита в сильнощелочной среде в присутствии Na-КМЦ происходит образование гидроксиапатита, при этом гидроксильные группы Na-КМЦ включаются в его кристаллическую решетку. Это приводит к присоединению Na-КМЦ к поверхности гидроксиапатита. Поперечная сшивка частиц гидроксиапатита полимерными цепями Na-КМЦ способствует образованию ограниченно набухающего в воде материала.
Пример 1. К 1470.6 см3 0.5М раствора CaCl2 медленно приливают при перемешивании 1470.6 см3 0.5М раствора Na2HPO4 (стехиометрический выход брушита 100 г). Брушит отфильтровывают, проводят его 4-кратную промывку тремя литрами воды и суспендируют в 1.0 дм3 дистиллированной воды. К суспензии брушита приливают 500 см3 раствора Na-КМЦ с массовой концентрацией 100 г/дм3, перемешивают в течение 10 минут, после чего добавляют 40%-ный раствор гидроксида натрия до установления рН среды 13.0. Смесь помещают в кипящую водяную баню и выдерживают в течение 1 часа до осаждения целевого продукта и получения прозрачной надосадочной жидкости. Образовавшуюся массу отделяют от раствора центрифугированием или фильтрованием, высушивают при 110°C и размалывают.
Пример 2. Аналогично примеру 1, добавляя к суспензии брушита 1000 см3 раствора Na-КМЦ с массовой концентрацией 100 г/дм3.
Пример 3. К суспензии 100 г гидроксиапатита (фракция от 100 до 250 мкм) в 1000 см3 дистиллированной воды приливают раствор ортофосфорной кислоты до установления рН среды от 4.0 до 4.5 и перемешивают в течение 10 минут для активации гидроксиапатита. Далее приливают 500 см раствора Na-КМЦ с массовой концентрацией 100 г/дм3, перемешивают в течение 10 минут, после чего добавляют 40%-ный раствор гидроксида натрия до установления рН среды 13.0. Смесь помещают в кипящую водяную баню и выдерживают в течение 1 часа до осаждения целевого продукта и получения прозрачной надосадочной жидкости. Образовавшуюся массу отделяют от раствора центрифугированием или фильтрованием, высушивают при 110°C и размалывают.
Пример 4. Аналогично примеру 3, добавляя к суспензии гидроксиапатита после активации 1000 см3 раствора Na-КМЦ с массовой концентрацией 100 г/дм3.
Емкость адсорбентов по эндо- и экзоглюканазам определяют адсорбцией в объеме. Для этого порцию раствора ферментного препарата Целловиридин Г20х после диафильтрации против 2000 дм3 0.01М ацетатного буфера обрабатывают навеской адсорбента при перемешивании в течение 30 мин и 4°C. Адсорбент отфильтровывают и определяют активности ферментов в растворах. Емкость адсорбентов по эндо- и экзоглюканазам рассчитывают по разности суммарных активностей растворов до и после обработки.
Единица эндоглюканазной активности соответствует количеству фермента, приводящему к снижению относительной вязкости 0.3%-ного раствора Na-КМЦ, равному 1 мин-1, при рН 4.5 и 30°C.
Единица экзоглюканазной активности соответствует количеству фермента, приводящему к расщеплению хроматографической бумаги с образованием 1 мг глюкозы за 1 час при рН 4.5 и 50°C. Характеристики адсорбентов, полученных по примерам 1-4, приведены в таблице 1.
** - скорость свободного истечения 0.01М ацетатного буфера рН 4.7 через слой адсорбента площадью 1 см2 и высотой 1 см (мл/см2×час).
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДСОРБЕНТА ДЛЯ ХРОМАТОГРАФИИ БЕЛКОВ | 2002 |
|
RU2209665C1 |
Способ получения комплекса целлюлолитических ферментов | 1985 |
|
SU1317023A1 |
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДСОРБЕНТА ДЛЯ ОЧИСТКИ БЕЛКОВ | 2007 |
|
RU2349377C1 |
Штамм мицелиального гриба TRICHODERMA LONGIBRACHIATUM TW-14-220 - продуцент целлюлаз, бета - глюканаз и ксиланаз для кормопроизводства и способ получения кормового комплексного ферментного препарата | 2017 |
|
RU2654564C1 |
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДСОРБЕНТА ДЛЯ ПРЕПАРАТИВНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ БЕЛКОВ | 2009 |
|
RU2405623C1 |
ШТАММ МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА TRICHODERMA REESEI - ПРОДУЦЕНТ КОМПЛЕКСА ЭНДОГЛЮКАНАЗЫ, КСИЛАНАЗЫ И ПЕКТИНАЗ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКОВЫХ ДОБАВОК НА ОСНОВЕ ЗЕРНОВОГО И ЗЕРНОБОБОВОГО СЫРЬЯ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В КОРМОПРОИЗВОДСТВЕ | 2018 |
|
RU2696074C1 |
НОВЫЙ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ (ВАРИАНТЫ) МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА PENICILLIUM VERRUCULOSUM И ФЕРМЕНТНЫЙ ПРЕПАРАТ (ВАРИАНТЫ), ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ГИДРОЛИЗА ПЛОДОВО-ЯГОДНОГО СЫРЬЯ, И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ | 2014 |
|
RU2574206C1 |
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ФЬЮЖН-КОНСТРУКЦИЯ ДЛЯ ОБЕСПЕЧЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ МУЛЬТИФЕРМЕНТНОГО КОМПЛЕКСА КАРБОГИДРАЗ В КЛЕТКАХ МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА Penicillium verruculosum, ИСПОЛЬЗУЕМОГО В КАЧЕСТВЕ ХОЗЯИНА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ШТАММА ГРИБА Penicillium verruculosum И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА НА ЕГО ОСНОВЕ | 2013 |
|
RU2550044C2 |
Способ получения сахара из целлюлозусодержащего растительного сырья | 1980 |
|
SU949002A1 |
Штамм @ @ АТ-490 - продуцент целлюлаз | 1984 |
|
SU1252336A1 |
Изобретение относится к области биотехнологии ферментных препаратов, может быть использовано для очистки и фракционирования целлюлолитических ферментов и касается способов получения аффинного адсорбента. Способ заключается в химическом присоединении к поверхности гидроксиапатита субстрата целлюлаз, например натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы. Изобретение обеспечивает получение аффинного адсорбента с высокой избирательностью адсорбции. 2 н.п. ф-лы, 1 табл.
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДСОРБЕНТА ДЛЯ ХРОМАТОГРАФИИ БЕЛКОВ | 2002 |
|
RU2209665C1 |
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИДРОКСИАПАТИТА | 1993 |
|
RU2077475C1 |
Способ получения оксиапатита | 1987 |
|
SU1503875A1 |
US 4335086, 15.06.1982 | |||
HJERTEN S., LINDEBERG J., SHOPOVA В | |||
Аппарат для очищения воды при помощи химических реактивов | 1917 |
|
SU2A1 |
Chromatogr., 1988 May 25; 440:305-13 | |||
SPENCER M | |||
"AN OCTACALCIUM PHOSPHATE INTERMEDIATE IN THE |
Авторы
Даты
2007-02-20—Публикация
2005-07-11—Подача