СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АФФИННОГО АДСОРБЕНТА ДЛЯ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ Российский патент 2007 года по МПК A61K38/47 C07K17/14 B01J20/02 

Описание патента на изобретение RU2293571C1

Изобретение относится к области биотехнологии ферментных препаратов, может быть использовано для очистки и фракционирования целлюлолитических ферментов и касается способа получения аффинного адсорбента на основе гидроксиапатита.

Известен способ получения гидроксиапатита (прототип), включающий стадию получения брушита (СаНРО4) путем медленного сливания 0.5М растворов CaCl2 и Na2HPO4 (по 2 л), фильтрование брушита, его 4-кратную промывку тремя литрами воды, обработку суспензии брушита в 3 л воды 100 мл 40%-ного NaOH при кипячении в течение 1 часа (нагрев 45 мин) при постоянном медленном перемешивании, отделение гидроксиапатита от очень мутного супернатанта фильтрованием, 4-кратную промывку гидроксиапатита тремя литрами воды, 2-кратную обработку 0.01М фосфатным буфером (рН 6.8) при нагревании до 100°C и 2-кратную обработку 0.001М фосфатным буфером (рН 6.8) при кипячении в течение 15 мин (Справочник биохимика: Пер. с англ. / Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. - М.: Мир, 1991. - С.463).

Недостатками адсорбента, получаемого по данному способу, является низкая избирательность адсорбции целлюлолитических ферментов. Поэтому при фракционировании экзо- и эндоглюканаз на колонках необходимо использовать ступенчатый или линейный градиент концентрации буфера, а при разделении экзо- и эндоглюканаз с помощью адсорбции в объеме - ступенчатую промывку адсорбента, что усложняет процесс фракционирования.

Технический результат настоящего изобретения заключается в получении аффинного адсорбента на основе гидроксиапатита с высокой избирательностью адсорбции экзоглюканаз.

Технический результат достигается путем химического присоединения к поверхности гидроксиапатита субстрата целлюлолитических ферментов, например натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы.

Способ осуществляют следующим образом. Проводят стадию получения брушита путем медленного сливания растворов CaCl2 и Na2HPO4 аналогично тому, как это описано в прототипе. Для получения аффинного адсорбента к суспензии брушита добавляют раствор натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (Na-КМЦ) в пропорции от 2:1 до 1:1 по сухому веществу, доводят рН среды до 13.0 раствором гидроксида натрия и нагревают реакционную смесь в кипящей водяной бане в течение 1 часа при постоянном медленном перемешивании.

Для получения аффинного гидроксиапатита (адсорбента) может быть использован кристаллический гидроксиапатит. В этом случае предварительно проводят его активацию путем обработки орто-фосфорной кислотой при рН среды от 4.0 до 4.5.

При нагревании брушита в сильнощелочной среде в присутствии Na-КМЦ происходит образование гидроксиапатита, при этом гидроксильные группы Na-КМЦ включаются в его кристаллическую решетку. Это приводит к присоединению Na-КМЦ к поверхности гидроксиапатита. Поперечная сшивка частиц гидроксиапатита полимерными цепями Na-КМЦ способствует образованию ограниченно набухающего в воде материала.

Пример 1. К 1470.6 см3 0.5М раствора CaCl2 медленно приливают при перемешивании 1470.6 см3 0.5М раствора Na2HPO4 (стехиометрический выход брушита 100 г). Брушит отфильтровывают, проводят его 4-кратную промывку тремя литрами воды и суспендируют в 1.0 дм3 дистиллированной воды. К суспензии брушита приливают 500 см3 раствора Na-КМЦ с массовой концентрацией 100 г/дм3, перемешивают в течение 10 минут, после чего добавляют 40%-ный раствор гидроксида натрия до установления рН среды 13.0. Смесь помещают в кипящую водяную баню и выдерживают в течение 1 часа до осаждения целевого продукта и получения прозрачной надосадочной жидкости. Образовавшуюся массу отделяют от раствора центрифугированием или фильтрованием, высушивают при 110°C и размалывают.

Пример 2. Аналогично примеру 1, добавляя к суспензии брушита 1000 см3 раствора Na-КМЦ с массовой концентрацией 100 г/дм3.

Пример 3. К суспензии 100 г гидроксиапатита (фракция от 100 до 250 мкм) в 1000 см3 дистиллированной воды приливают раствор ортофосфорной кислоты до установления рН среды от 4.0 до 4.5 и перемешивают в течение 10 минут для активации гидроксиапатита. Далее приливают 500 см раствора Na-КМЦ с массовой концентрацией 100 г/дм3, перемешивают в течение 10 минут, после чего добавляют 40%-ный раствор гидроксида натрия до установления рН среды 13.0. Смесь помещают в кипящую водяную баню и выдерживают в течение 1 часа до осаждения целевого продукта и получения прозрачной надосадочной жидкости. Образовавшуюся массу отделяют от раствора центрифугированием или фильтрованием, высушивают при 110°C и размалывают.

Пример 4. Аналогично примеру 3, добавляя к суспензии гидроксиапатита после активации 1000 см3 раствора Na-КМЦ с массовой концентрацией 100 г/дм3.

Емкость адсорбентов по эндо- и экзоглюканазам определяют адсорбцией в объеме. Для этого порцию раствора ферментного препарата Целловиридин Г20х после диафильтрации против 2000 дм3 0.01М ацетатного буфера обрабатывают навеской адсорбента при перемешивании в течение 30 мин и 4°C. Адсорбент отфильтровывают и определяют активности ферментов в растворах. Емкость адсорбентов по эндо- и экзоглюканазам рассчитывают по разности суммарных активностей растворов до и после обработки.

Единица эндоглюканазной активности соответствует количеству фермента, приводящему к снижению относительной вязкости 0.3%-ного раствора Na-КМЦ, равному 1 мин-1, при рН 4.5 и 30°C.

Единица экзоглюканазной активности соответствует количеству фермента, приводящему к расщеплению хроматографической бумаги с образованием 1 мг глюкозы за 1 час при рН 4.5 и 50°C. Характеристики адсорбентов, полученных по примерам 1-4, приведены в таблице 1.

Таблица 1ПримерВыход, % от массы адсорбентаНасыпная плотность, г/см3Набухаемость*, см3Фильтрующие свойства**, мл/см2×часЕмкость по эндоглюканазе, ед/гЕмкость по экзоглюканазе, ед/г1.124.30.895.8576.6-212.32.142.30.99.7862.7-238.03.117.30.778.6747.5-243.84.133.70.7812.9744.0-271.5прототип-0.771.435.64432.0206.3* - в дистиллированной воде при рН 6.0;
** - скорость свободного истечения 0.01М ацетатного буфера рН 4.7 через слой адсорбента площадью 1 см2 и высотой 1 см (мл/см2×час).

Похожие патенты RU2293571C1

название год авторы номер документа
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДСОРБЕНТА ДЛЯ ХРОМАТОГРАФИИ БЕЛКОВ 2002
  • Донцов А.Г.
  • Попейко О.В.
RU2209665C1
Способ получения комплекса целлюлолитических ферментов 1985
  • Альперович Елена Дмитриевна
  • Гернет Марина Васильевна
  • Грачева Ирина Михайловна
  • Индисова Галина Евгеньевна
SU1317023A1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДСОРБЕНТА ДЛЯ ОЧИСТКИ БЕЛКОВ 2007
  • Донцов Андрей Геннадиевич
RU2349377C1
Штамм мицелиального гриба TRICHODERMA LONGIBRACHIATUM TW-14-220 - продуцент целлюлаз, бета - глюканаз и ксиланаз для кормопроизводства и способ получения кормового комплексного ферментного препарата 2017
  • Синицын Аркадий Пантелеймонович
  • Цурикова Нина Васильевна
  • Костылева Елена Викторовна
  • Веселкина Татьяна Николаевна
RU2654564C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДСОРБЕНТА ДЛЯ ПРЕПАРАТИВНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ БЕЛКОВ 2009
  • Донцов Андрей Геннадиевич
RU2405623C1
ШТАММ МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА TRICHODERMA REESEI - ПРОДУЦЕНТ КОМПЛЕКСА ЭНДОГЛЮКАНАЗЫ, КСИЛАНАЗЫ И ПЕКТИНАЗ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКОВЫХ ДОБАВОК НА ОСНОВЕ ЗЕРНОВОГО И ЗЕРНОБОБОВОГО СЫРЬЯ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В КОРМОПРОИЗВОДСТВЕ 2018
  • Синицын Аркадий Пантелеймонович
  • Цурикова Нина Васильевна
  • Костылева Елена Викторовна
  • Середа Анна Сергеевна
  • Великорецкая Ирина Александровна
  • Веселкина Татьяна Николаевна
  • Нефедова Лидия Ивановна
RU2696074C1
НОВЫЙ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ (ВАРИАНТЫ) МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА PENICILLIUM VERRUCULOSUM И ФЕРМЕНТНЫЙ ПРЕПАРАТ (ВАРИАНТЫ), ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ГИДРОЛИЗА ПЛОДОВО-ЯГОДНОГО СЫРЬЯ, И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ 2014
  • Синицын Аркадий Пантелеймонович
  • Рожкова Александра Михайловна
  • Зоров Иван Никитич
  • Синицына Ольга Аркадьевна
  • Бушина Екатерина Вячеславовна
  • Волчок Анастасия Александровна
  • Матыс Вероника Юрьевна
  • Окунев Олег Николаевич
  • Черноглазов Владимир Михайлович
RU2574206C1
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ФЬЮЖН-КОНСТРУКЦИЯ ДЛЯ ОБЕСПЕЧЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ МУЛЬТИФЕРМЕНТНОГО КОМПЛЕКСА КАРБОГИДРАЗ В КЛЕТКАХ МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА Penicillium verruculosum, ИСПОЛЬЗУЕМОГО В КАЧЕСТВЕ ХОЗЯИНА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ШТАММА ГРИБА Penicillium verruculosum И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА НА ЕГО ОСНОВЕ 2013
  • Синицын Аркадий Пантелеймонович
  • Рожкова Александра Михайловна
  • Зоров Иван Никитич
  • Синицына Ольга Аркадьевна
  • Проскурина Ольга Владимировна
  • Короткова Ольга Генриховна
  • Бушина Екатерина Вячеславовна
  • Окунев Олег Николаевич
  • Матыс Вероника Юрьевна
  • Кошелев Анатолий Владимирович
RU2550044C2
Способ получения сахара из целлюлозусодержащего растительного сырья 1980
  • Березин Илья Васильевич
  • Калунянц Калуст Акопович
  • Рабинович Михаил Лейбович
  • Клесов Анатолий Алексеевич
  • Лосякова Лидия Сергеевна
  • Голгер Леонид Исаевич
  • Серебренников Владимир Михайлович
  • Кожемякина Ольга Павловна
  • Федоренко Борис Николаевич
  • Бочкарева Нина Григорьевна
  • Трефилов Эрлен Михайлович
  • Величко Борис Афанасьевич
  • Черкасова Галина Васильевна
SU949002A1
Штамм @ @ АТ-490 - продуцент целлюлаз 1984
  • Квеситадзе Георгий Иванович
  • Квачадзе Ламара Левановна
  • Алексидзе Тинатин Иосифовна
  • Логинова Любовь Гавриловна
  • Иванова Ирина Ивановна
  • Гужова Эмилия Павловна
SU1252336A1

Реферат патента 2007 года СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АФФИННОГО АДСОРБЕНТА ДЛЯ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ

Изобретение относится к области биотехнологии ферментных препаратов, может быть использовано для очистки и фракционирования целлюлолитических ферментов и касается способов получения аффинного адсорбента. Способ заключается в химическом присоединении к поверхности гидроксиапатита субстрата целлюлаз, например натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы. Изобретение обеспечивает получение аффинного адсорбента с высокой избирательностью адсорбции. 2 н.п. ф-лы, 1 табл.

Формула изобретения RU 2 293 571 C1

1. Способ получения аффинного адсорбента для фракционирования целлюлолитических ферментов, предусматривающий получение брушита из кальция хлорида, путем обработки его гидрофосфатом натрия, фильтрование брушита, его 4-кратную промывку водой и суспендирование в дистиллированной воде, отличающийся тем, что суспензию брушита обрабатывают раствором Na-КМЦ при массовом соотношении от 2:1 до 1:1, перемешивают в течение 10 мин, после чего добавляют 40%-ный раствор гидроксида натрия до установления рН 13, с последующим кипячением смеси в течение 1 ч до осаждения целевого продукта, отделением его и высушиванием.2. Способ получения аффинного адсорбента для фракционирования целлюлолитических ферментов, отличающийся тем, что кристаллический гидроксиапатит суспендируют в дистиллированной воде, активируют раствором ортофосфорной кислоты при рН от 4,0 до 4,5, перемешивают в течение 10 мин, обрабатывают раствором Na-КМЦ при массовом соотношении 2:1 до 1:1, перемешивают в течение 10 мин, после чего добавляют 40%-ный раствор гидроксида натрия до установления рН 13, с последующим кипячением смеси в течение 1 ч до осаждения целевого продукта, отделением его и высушиванием.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2007 года RU2293571C1

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДСОРБЕНТА ДЛЯ ХРОМАТОГРАФИИ БЕЛКОВ 2002
  • Донцов А.Г.
  • Попейко О.В.
RU2209665C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИДРОКСИАПАТИТА 1993
  • Комаров Владимир Федорович
  • Мелихов Игорь Витальевич
  • Рудин Всеволод Николаевич
  • Орлов Андрей Юрьевич
  • Минаев Владимир Васильевич
  • Зуев Владислав Петрович
  • Божевольнов Виктор Евгеньевич
RU2077475C1
Способ получения оксиапатита 1987
  • Ахрем Афанасий Андреевич
  • Горская Людмила Николаевна
  • Дрожденюк Анатолий Павлович
  • Егорова Валентина Петровна
  • Желнин Борис Иванович
  • Ландо Дмитрий Юрьевич
  • Сакодынский Карл Иванович
  • Соколов Александр Андреевич
  • Шумилина Татьяна Антоновна
SU1503875A1
US 4335086, 15.06.1982
HJERTEN S., LINDEBERG J., SHOPOVA В
Аппарат для очищения воды при помощи химических реактивов 1917
  • Гордон И.Д.
SU2A1
Chromatogr., 1988 May 25; 440:305-13
SPENCER M
"AN OCTACALCIUM PHOSPHATE INTERMEDIATE IN THE

RU 2 293 571 C1

Авторы

Донцов Андрей Геннадиевич

Даты

2007-02-20Публикация

2005-07-11Подача