СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИГАЛАКТУРОНАЗНОГО ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА Российский патент 2005 года по МПК C12N9/14 C12N9/26 

Описание патента на изобретение RU2253676C2

Изобретение относится к области биотехнологии, гидролизной промышленности и виноделия и предназначено для препаративного получения очищенного полигалактуроназного ферментного препарата, пригодного для исследования структуры растительных пектинов методом ферментативного гидролиза, для переработки и утилизации растительного сырья с целью получения олиго- и моносахаридов, для удаления винного камня и осветления лучших сортов вин.

Известен способ получения полигалактуроназы (прототип), [US 4801540, 31.01.89, C 12 N 015/00], включающий предварительное концентрирование ферментов путем осаждения сульфатом аммония при 90%-ном насыщении с последующим фракционированием с помощью хроматографии на гидроксиапатите. При этом 2 мл раствора вводится в HPLC-колонку для жидкостной хроматографии высокого разрешения, после чего проводится хроматографирование ферментов в линейном градиенте фосфатного буфера с рН 6,8 от 10 до 350 мМ при расходе 1 мл/мин. Фракции, содержащие полигалактуроназу, диализуются против 6% уксусной кислоты и лиофилизируются.

Недостатком данного способа является относительно низкая степень очистки полигалактуроназы, низкая производительность процесса и существенное разбавление исходного раствора фермента в ходе очистки, что затрудняет препаративное получение целевого продукта.

Технический результат изобретения заключается в увеличении степени очистки по удельной полигалактуроназной активности (ПгА) и в повышении производительности процесса препаративного получения целевого продукта. Применение изобретения позволяет также снизить разбавление исходного раствора фермента в ходе очистки и увеличить выход ферментного препарата.

Технический результат по способу достигается тем, что после предварительного концентрирования ферментов путем осаждения или другим подходящим методом ферментный раствор обессоливают, например, диализом, после чего вторично концентрируют ферменты при вводе пробы непосредственно на колонке с гидроксиапатитом путем пропускания обессоленного ферментного раствора с объемом, равным 1-2 объемам колонки, промывают колонку слабым фосфатным буфером и проводят градиентное элюирование активной фракции. Все операции проводят при температуре 3-5°С.

Способ осуществляют следующим образом: 1000 см3 культуральной жидкости или раствора ферментного препарата предварительно концентрируют в 5-10 раз подходящим методом, например осажением сульфатом аммония, ультрафильтрацией или вакуумной дистилляцией и обессоливают, например, диализом при температуре около 4°С против 10 мМ фосфатного буфера с рН 6,0-7,0. После этого 100-200 см3 обессоленного раствора с помощью насоса пропускают со скоростью 4 см3/мин через термостатированную при 4°С колонку 1,6×50 см (объем 100,5 см3), заполненную гидроксиапатитом с зернением 100-250 мкм. После введения всего объема раствора колонку промывают 100 см3 10 мМ фосфатного буфера с рН 6,0-7,0 и далее производят элюирование активной фракции линейным градиентом того же буфера от 10 до 500 мМ в течение 30 минут со скоростью 4 см3/мин. По результатам детектирования при 280 нм отбирают белоксодержащую фракцию, которая элюируется при концентрации фосфатного буфера, равной 250-300 мМ, диализуют ее против 10 мМ ацетатного буфера с рН 4,0-4,5 или проводят гель-хроматографию на TSK-геле HW-50F, используя 10 мМ ацетатный буфер с рН 4,0-4,5 в качестве элюента, после чего лиофилизируют.

Низкая ионная сила исходного ферментного раствора перед фракционированием способствует более сильной адсорбции ферментов гидроксиапатитом при 4°С, что приводит к их концентрированию на колонке и отмыванию неактивных примесей уже в процессе ввода пробы, что увеличивает конечную степень очистки.

Вторичное концентрирование ферментов на колонке перед их разделением позволяет уменьшить объем активной фракции по сравнению с исходным раствором. При этом увеличение концентрации белков на старте колонки способствует стабилизации фермента и, следовательно, увеличению его выхода по активности.

Использование гель-хроматографии на TSK-геле HW-50F вместо диализа перед лиофилизацией приводит к дополнительному увеличению степени очистки полигалактуроназы.

Способ увеличивает производительность очистки, так как позволяет за 80 минут провести очистку 100 см3 ферментного раствора, тогда как по способу-прототипу за это время может быть очищено не более 5-6 см3 того же раствора.

Способ опробован на примере растворов ферментного препарата Пектофоетидин Г3х. В таблице 1 приведены экспериментальные данные по использованию способа для получения очищенного полигалактуроназного препарата.

Пример 1. 1000 см3 раствора ферментного препарата Пектофоетидин Г3х (40 г/дм3 по сухому веществу) предварительно концентрируют в 5-10 раз с помощью ультрафильтрации, диализуют при 4°С против 10 мМ фосфатного буфера с рН 6,8 и фильтруют через мембранный фильтр 0,45 мкм.

Пробу объемом 2 см3 (по прототипу) вводят в колонку 1,6×50 см (объем 100,5 см3), заполненную гидроксиапатитом с зернением 100-250 мкм, после чего проводят элюирование при 4°С градиентом фосфатного буфера с рН 6,8 от 10 до 500 мМ за 30 минут со скоростью 4 см3/мин. По результатам детектирования при 280 нм отбирают белоксодержащую фракцию, которая элюируется при концентрации фосфатного буфера, равной 250-300 мМ, диализуют против 10 мМ ацетатного буфера с рН 4,0-4,5 и лиофилизируют. Показатели процесса очистки и характеристика препарата приведены в таблице 1.

Пример 2. Операции проводят аналогично п.1, при этом после концентрирования ультрафильтрацией, диализа и микрофильтрации на фильтре 0,45 мкм, с целью вторичного концентрирования, пробу объемом 180 см3 при помощи насоса со скоростью 4 см3/мин вводят в колонку 1,6×50 см (объем 100,5 см3), заполненную гидроксиапатитом с зернением 100-250 мкм, колонку промывают 100 см3 10 мМ фосфатного буфера с рН 6,8 и далее производят элюирование активных фракций линейным градиентом того же буфера от 10 до 500 мМ в течение 30 минут со скоростью 4 см3/мин. По результатам детектирования при 280 нм отбирают белоксодержащую фракцию, которая элюируется при концентрации фосфатного буфера, равной 250-300 мМ, диализуют против 10 мМ ацетатного буфера с рН 4,0-4,5 и лиофилизируют. Показатели процесса очистки и характеристика препарата приведены в таблице 1.

Пример 3. Операции проводят аналогично п.2, но вместо диализа перед лиофилизацией проводят гель-хроматографию: 2 см3 активной фракции вводят в колонку 1,6×50 см (объем 100,5 см3), заполненную TSK-гелем HW-50F, после чего проводят элюирование фракций 10 мМ ацетатным буфером с рН 4,0-4,5 при 4°С со скоростью 1 см3/мин. По результатам рефрактометрического детектирования отбирают фракции, в которых определяют активность (ПгА) и содержание белка. Активную фракцию подвергают лиофилизации. Показатели процесса очистки и характеристика препарата приведены в таблице 1.

Данные таблицы 1 показывают, что предлагаемый способ позволяет увеличить степень очистки и выход полигалактуроназы, а также производительность процесса при ее препаративном получении с использованием хроматографии на гидроксиапатите. Способ позволяет также снизить разбавление исходного раствора фермента, что повышает технологичность процесса очистки.

Таблица 1N п/пV, см3 до очисткиV, см3 после очисткиПгА, ед/см3ПгАобщ, едВыход активности, (%)ПгАуд, ед/мг белкаКратность очистки, n разПример 1       исходный р-р2,0-492,0984-134,8-очищенный р-р-56,017,296397,8161,81,2Пример 2       исходный р-р180,0-492,088560-134,8-очищенный р-р-86,41330,3114938129,8350,12,6Пример 3       р-р после п.22,0-1330,32660,6-350,1-очищенный р-р-18,6141,32628,298,8441,61,26/3,28** - в числителе дано значение по отношению к примеру 2, в знаменателе - по отношению к исходному раствору.

Похожие патенты RU2253676C2

название год авторы номер документа
СПОСОБ ОЧИСТКИ ПЕКТОЛИТИЧЕСКОГО ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА 2002
  • Донцов А.Г.
RU2239657C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ЛИМФОТОКСИНА ЧЕЛОВЕКА 1992
  • Денисов А.А.
  • Торский С.П.
  • Николаева О.Г.
  • Воложанцева И.Я.
  • Ураков Н.Н.
  • Коробко В.Г.
RU2039823C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КЕРАТИНАЗЫ ИЗ Penicillium citrinum 2012
  • Никитина Зоя Кимовна
  • Гордонова Ирина Константиновна
  • Быков Валерий Алексеевич
RU2499833C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТА ПЕРОКСИДАЗЫ ИЗ КОРНЕЙ ХРЕНА 2007
  • Бочков Денис Владимирович
  • Толстикова Татьяна Генриховна
  • Брызгалов Аркадий Олегович
  • Хвостов Михаил Владимирович
RU2353652C1
ВНЕКЛЕТОЧНАЯ ГИАЛУРОНИДАЗА ИЗ Streptomyces koganeiensis 2010
  • Мессина, Лучано
  • Ваккаро, Сузанна
  • Карузо, Сальваторе
  • Дженнари, Джованни
RU2553205C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕСТРИКТАЗЫ E.CORII ИЗ ШТАММА БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI B 834/PSK 323 1984
  • Филипченкова Л.П.
  • Косых В.Г.
  • Бурьянов Я.И.
  • Баев А.А.
  • Ансберга С.Э.
SU1321060A1
СПОСОБ ИЗВЛЕЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА ИЗ МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ РЫБ 1995
  • Иголкина Л.А.
RU2065876C1
Способ получения ДНК-полимеразы 1 ЕSснеRIснIа coLI 1988
  • Вайткявичене Регина Стасевна
  • Марцишаускас Ромуальдас Пранович
  • Баронайте Зита Альгирдовна
  • Суджювене Она Феликсовна
  • Песлякас Ионас-Генрикас Ионович
  • Громова Ольга Александровна
  • Гаврюченкова Людмила Павловна
SU1622393A1
ШТАММ ГРИБА PENICILLIUM ESTINOGENUM A.KOMATSU ET S. ABE EX G. SM. - ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ P И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ 2002
  • Балабанова Л.А.
  • Пивкин М.В.
  • Гафуров Ю.М.
  • Рассказов В.А.
RU2220198C1
Способ получения рестриктазы S @ II 1991
  • Никольская-Санович Ирина Игоревна
  • Упорова Татьяна Марковна
  • Громова Елизавета Сергеевна
  • Левченко Ирина Яновна
  • Арутюнян Елена Евгеньевна
  • Грубер Ирина Мироновна
  • Кубарева Елена Александровна
SU1822877A1

Реферат патента 2005 года СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИГАЛАКТУРОНАЗНОГО ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА

Изобретение относится к биотехнологии, в частности касается способа получения полигалактуроназного ферментного препарата, и может быть использовано в виноделии, в гидролизной промышленности. Способ получения полигалактуроназного ферментного препарата предусматривает первичное концентрирование культуральной жидкости или раствора неочищенного ферментного препарата, обессоливание раствора. Вторичное концентрирование фермента ведут непосредственно на колонке путем пропускания через термостатированную колонку при температуре 3-5°С, заполненную гидроксиапатитом с зернением 100-250 мкм. Промывают колонки 10 мМ фосфатным буфером с рН 6,0-7,0, с последующим элюированием фракций градиентом фосфатного буфера. Проводят гель-хроматографию активной фракции и лиофилизацию ферментного препарата. Изобретение позволяет увеличить выход, степень очистки и производительность препаративного получения полигалактуроназного ферментного препарата, а также уменьшить разбавление активной фракции, что повышает технологичность процесса очистки. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

Формула изобретения RU 2 253 676 C2

1. Способ получения полигалактуроназного ферментного препарата, включающий предварительное концентрирование ферментов, фракционирование ферментов хроматографией на гидроксиапатите, очистку активной фракции и лиофилизацию, отличающийся тем, что перед фракционированием проводят обессоливание ферментного раствора и вторично концентрируют ферменты непосредственно на колонке, заполненной гидроксиапатитом, путем пропускания ферментного раствора с объемом, равным 1-2 объемам колонки, при температуре 3-5°С с последующей промывкой колонки 10 мМ фосфатным буфером с рН 6,0-7,0.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что очистку активной фракции проводят диализом или гель-хроматографией на колонке с TSK-гелем - HW-50F.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2005 года RU2253676C2

US 4801540 31.01.1989
ГРАЧЕВА И.М., КРИВОВА А.Ю., Технология ферментных препаратов, М, 2000, ЭЛЕВАР, с.89-92
ГРАЧЕВА И.М., КРИВОВА А.Ю., Технология ферментных препаратов, М, 2000, ЭЛЕВАР, с.149-150
Способ получения пектолитического ферментного препарата из @ 1979
  • Хасирджева Альбина Константиновна
  • Максимов Вячеслав Иванович
  • Молодова Галина Алексеевна
  • Румянцев Владимир Михайлович
SU891775A1

RU 2 253 676 C2

Авторы

Донцов А.Г.

Даты

2005-06-10Публикация

2003-07-09Подача