Способ получения комплекса целлюлолитических ферментов Советский патент 1987 года по МПК C12N9/42 C12N9/42 C12R1/885 

11

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам получения фермен тов, и может быть использовано при получении глюкозы для пищевой, микробиологической, химической отраслей промьпи- ленности, медицины и животноводства из целлюлозосодержащего сырья.

Цель изобретения - повышение активности целлюлолитического комплекса и увеличение выхода глюкозы при гидролизе целлюлозосодержащего сырья.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Комплекс целлюлолитических ферментов , получаемьй культивированием гриба Trichoderma longibrachiatum 7-26, содержит эндоглюканазы, в том числе прочно сорбирующиеся, экзо- целлобиогидролазы и экзоглюкозидазы, но недостаточное количество целло- биазы. Этот комплекс обеспечивает эффективньш гидролиз целлюлозосодержащего сырья, однако в продуктах гидролиза кроме глюкозы присутствует целлобиоза, которая может являться дополнительным источником получения глюкозы, при условии присутствия гид- ролизующего ее фермента - деллобиа- зы.

Грибы рода Trichoderraa, такие как Trichoderma aureoviride ВКМ F-2807 Д и Trichoderraa horzianum ВКМ F 2029 Д также являются продуцентами целлюлаз однако активность этих ферментов значительно ниже активности соответствующих ферментов гриба Trichoderma longibrachiatum 7-26, напротив, цел- лобиазная активность у этих грибов значительно вьш1е. Данные представлены в табл. 1. I

Совместное культивирование гриба Trichoderma longibrachiatum 7-26 и гриба рода Trichoderma - продуцента целлобиазы необходимо для получения комплекса ферментов, включающего целлюлазы и целлобиазу, что позволяет увеличить выход глюкозы в гидроли- затах целлюлозы. Получаемый способом совместного культивирования двух грибов рода Trichoderma цёллюлолити- ческий комплекс не содержит сопутствующих ферментов, в частности пекти-- наз. Активность ферментов при смешанном культивировании представлена в табл. 2. .

5

0

5

0

5

0

70232

Способ осуществляют при одновременном или разновременном внесении посевного материала грибов в питательную ср€;ду следующим образом. Одновременное внесение посевного материала.

Посевной материал культуры гриба Trichoderma longibrachiatum 7-26 и культуры гриба - продуцента целлобиазы: Trichoderma aureoviride ВКМ F-2807 Д или .Trichoderma harzia-. num ВКМ F-2029 Д, в виде споровой суспензии или мицелиального материала вносят в питательную среду, содержащую целлюлозу и другие источники углерода, источники азота и минеральные соли. Культивирование проводят при 28-30°С в течение 6-7 сут. В фильтрате культуральной жидкости определяют активность целлюлаз по фильтровальной бумаге (АФВ) и по Na-карбоксиметилцеллюлозе: ЮЩ-оса- харивающую и КМЦ-разжижающую, а также целлобиазную активность.

Разновременное внесение посевного материала.

Посевной материал культуры гриба Trichoderma longibrachiatum 7-26 вносят в питательную среду того же и культивируют 1-2 сут при

культуральную

жидкость вносят, посевной материал культуры гриба - продуцента целлобиазы: Trichoderma aureoviride БКМ F-2807 Д или Trichoderma harzianum ВКМ F 2029 Д.Совместное культивирование при тех же условиях продолжают 5-6 сут.В фильтрате культуральной жидкости определяют активности тех же целлюлолитических ферментов и целлобиазы.

состава

28-30°С, после чего в

45

50

55

Пример. Посевной материал грибов Trichoderma longibrachiatum 7-26 и Trichoderma aureoviride ВКМ F-2807 Д вносят в виде споровой суспензии в питательную среду состава,%: свекловичньй жом 4,0; солодовые ростки 0,35; пщеничные отруби 0,35; аммоний азотнокисльш 0,7; калий фосфорнокислый однозамещенный 0,3; вода водопроводная до 50 мл, рН до стерилизации 5,0 и культивируют в колбах на качалке об/ /мин при 28-30 С. На седьмые сутки активность ферментов в фильтрате культуральной жидкости составляет, ед/мл: АФБ 9,0; КМЦ-осахаривающая

300; КМЦ-разжижающая 3,0; целлобиа- за 0,4.

П р и м е р 2. Посевной материал грибов Trichoderma longibrachiatum 7-26 и Trichoderma harzianum ВКМ F 2029 Д вносят в виде споровой суспензии в питательную среду того же состава, что и в примере 1. Культивируют при тех же условиях. На седьмые сутки активность ферментов в фильтрате культуральной жидкости составляет, ед/мл: АФБ 9,3; КМЦ-Ьсахаривающая 310; КМЦ-разжижающая 3,1; целлобиаза 0,3,

П р и м е р 3. Посевной материал гриба Trichoderma longibrachiatum 7-26 вносят в виде споровой суспензии в питательную среду того же состава, что и в примере 1.Культивируют 1 сут. при тех же условиях, что и ,в примере 1 . После этого в культу-ральную жидкость вносят споровую суспензию гриба Trichoderma aureo- viride ВКМ F-2807 Д и совместное культивирование продолжают при том же режиме в течение 6 сут. Активность ферментов в фильтрате культуральной жидкости на седьмые сутки составляет, .ед/мл: АФБ 11,0; КМЦ-оса харивающая 310; КМЦ-разжижающая 3,2 целлобиаза 0,32.

П р и м е р 4. Культивирование начинают так же, как и в примере 3. Через 1 сут. в культуральную жидкость вносят споровую суспензию гриба Trichoderma harzianum ВКМ F-2029 Д и совместное культивирование продолжают при том же режиме в течение 6 6 сут. Активность ферментов в фильтрате культуральной жидкости на седьмые сутки составляет, ед/мл: АФБ 11,5; КМЦ-осахаривающая 320; КМЦ-разжижающая 3,5; целлобиаза 0,25.

П р и м е р 5. Посевной материал гриба Trichoderma longibrachiatum 7-26 вносят в виде споровой суспензии в питательную среду того же состава, что и в примере 1. Культивируют 2 сут. при тех же условиях, что и в примере 1. После этого в культуральную жидкость вносят споровую суспензию гриба Trichoderma aureoviride ВКМ F-2807 Д и совместное культивирование продолжают при том же режиме в течение 5 сут. Активность ферментов в фильтрате культуральной жидкости на седьмые сутки составляет, ед/мл: АФБ 13,0; КМЦ-осахаривающая

5

0

5

330; КМЦ-разжижающая 3,7; целлобиаза 0,21 .

П р и м е р 6. Культивирование начинают так же, как и в примере 5. Через 2 сут. в культуральную жидкость вносят споровую суспензию гриба Trichoderma harzianum ВКМ F-2029 Д и совместное культивирование прожол- жают при том же режиме в течение 5 сут. Активность ферментов в фильтрате культуральной жидкости на седьмые сутки составляет, ед/мл: АФБ 14,0; КМЦ-осахаривающая 340; КМЦ- разжижающая 3,9; целлобиаза 0,18.

Как видно из табл. 2, предлагаемый способ позволяет повысить цепло- биазную активность по сравнению с монокультурой Trichoderma longibrachiatum 7-26 и варьировать соотношение компонентов ферментативного комплекса..

Способ позволяет получить в условиях одной ферментации сбалансированный мультиэнзимный комплекс, включающий эндоглюканазы, экзоцеллобио- гидролазы экзоглюкозидазы и целло- биазы, необходимый для эффективного гидролиза целлюлозосодержащего сырья до глюкозы. Формула изобрет е.н и я

1.Способ получения комплекса целлюлолитических ферментов, предусматривающий совместное глубинное культивирование посевного материала., микроскопических грибов, в том числе рода Trichoderma-продуцентов целлюлолитических ферментов в течение 6-7 сут. с последующим отделением биомассы, отличающийся тем, что, с целью повьшения активности комплексов и увеличения выхода глюкозы при гидролизе целлюлозосодержащего сырья, совместному культивированию подвергают штамм Tri choderma longibrachiatum 7-26-проду- цент эндо- и экзоглюканаз и штамм Т. aureoviride ВКПМ F-2807 Д или Т. harzianum ВКМП-2029 Д - продуцента целлобиазы.

2.Способ по п. 1 , о т л и ч а ю- щ и и с я тем, что посевной материал обеих культур вносят в питательную среду одновременно.

3.Способ поп.1,отлича ю- щ и и с я тем, что посевной материал продуцента целлобиазы вносят

в культуральную жидкость Т.longibrachiatum 7-26 через 1-2 сут.после начала культивирования.

5

0

0

Составитель И.Привалова Редактор И.Сегляник Техред М.Ходанич .Корректор А.Обручар

Заказ 2394/23 Тираж 499Подписное

БНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул. Проектная, 4

Таблица Г

Таблица2

Изобретение относится к ферментной отрасли микробиологической промышленности и может быть использова но при получении глюкозы из целлкшо- зосодержащего сырья. Способ позволяет получить в условиях одной ферментации сбалансированный комплекс цел- люлолитических ферментов, эффективно гидролизующий целлюлозу, повысить активность комплекса и увеличить выход глюкозы. Совместному культивированию подвергают штамм микроскопического гриба Trichoderma.longib- rachiatura 7-26 - продуцент эндо- и экзоглюканаз и культуру Trichoderma aureoviride-2807 или Trichoderma harzianum ВКПМ F-2029. Культивирование проводят в течение 6-7 сут. Посевной материал обеих культур вносят в питательную среду одновременно или продуцент.целлобиазы вносят в культу- ральную жидкость Trichoderma longib- rachiatum 7-26 через 1-2 сут после начала культивирования, что позволяет варьировать соотношение компонентов мультиэнзимного комплекса. 2 з.п. ф-лы, 2 табл. СЛ со ее