НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ РНК ВИРУСА КРЫМСКОЙ-КОНГО ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ В ПОЛЕВЫХ И КЛИНИЧЕСКИХ ОБРАЗЦАХ Российский патент 2007 года по МПК C12N15/40 C12Q1/68 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и может быть использовано в медицине для выявления генетического материала вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки (ККГЛ) в пробах, а также для решения научно-исследовательских задач по изучению ККГЛ.

Метод обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) является прямым методом выявления РНК вируса и имеет высокую степень чувствительности. В основе метода ОТ-ПЦР лежит получение кДНК на матрице вирусной РНК с помощью РНК-зависимой-ДНК-полимеразы (обратная транскриптаза) и многократное копирование с помощью ДНК-зависимой-ДНК-полимеразы определенного фрагмента полученной кДНК, являющегося маркерным для данного вида возбудителя инфекционного заболевания. Для эффективного проведения ОТ-ПЦР необходимы праймеры - синтетические олигонуклеотиды определенного размера, специфичные для каждого вида вируса. Ограниченность использования праймеров обусловлена их видоспецифичностью. Праймеры должны быть комплементарны последовательностям ДНК, фланкирующим выбранный участок, и ориентированы таким образом, чтобы синтез ДНК, осуществляемый ДНК-полимеразой, протекал между ними. В результате происходит экспоненциальное увеличение количества копий специфичного фрагмента. От правильно выбранных праймеров, определяющих специфичность ПЦР, зависит точность диагностирования исследуемого вируса.

Известен аналог, выбранный в качестве прототипа и представляющий собой набор олигонуклеотидных праймеров (PS1, PS2, PS3 и PS4), обеспечивающих специфический синтез продуктов амплификации на матрице малого сегмента геномной РНК вируса ККГЛ фрагмента кДНК длиной 506 п.о., а также контрольный праймер PS5, расположенный внутри амплифицируемого фрагмента и позволяющий проверять специфичность реакции (Патент РФ №2209830, МПК С 12 Р 19/30, опубл. 10.08.2003 г.).

Однако данный набор праймеров имеет два существенных недостатка. Во-первых, этот набор праймеров разработан на основе множественного выравнивания нуклеотидных последовательностей небольшого количества (около 10) штаммов и изолятов вируса ККГЛ, известных к моменту разработки. В настоящее время накопление новых данных по строению генома вируса ККГЛ обнаруживает недостаточную универсальность и надежность детекции этого набора праймеров в реакции ОТ-ПЦР. Особенно это касается ключевых праймеров: PS1, с которого инициируется синтез кДНК и первый раунд ПЦР, а также PS5, предназначенного для проверки специфичности ОТ-ПЦР.

Во-вторых, длина амплифицируемого фрагмента кДНК (506 п.о.) слишком велика, что предъявляет довольно высокие требования к качеству обратной транскриптазы и матричной РНК и, таким образом, снижает надежность детекции вируса.

Техническим результатом заявляемого изобретения является разработка более универсального набора праймеров для индикации генетического материала вируса ККГЛ с учетом вариаций в строении генома различных географических изолятов вируса, циркулирующего в различных регионах мира, в особенности в России и странах Средней Азии, позволяющего упростить и повысить надежность процесса идентификации вируса ККГЛ методом ОТ-ПЦР в полевых и клинических образцах.

Указанный результат достигается разработкой двух пар праймеров для идентификации РНК вируса ККГЛ, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в ОТ-ПЦР, имеющих следующую структуру:

5' gaagccaa(a,g)aagac(t,c)gt(a,g)gaggctc 3' - SP1;

5' caattgtcttggc(a,g)ca(t,c)ggatt 3' - SP2;

5' gcacagattgacac(t,c)(g,c)ctttcagc 3' - SP3;

5' gtccg(t,a)aggtt(a,g)agaatggacttggt 3' - SP4.

В рамках заявляемого технического решения разработана схема выбора праймеров с учетом вариаций в строении генома различных географических изолятов вируса ККГЛ, циркулирующего в различных регионах мира. Апробация праймеров была осуществлена с использованием большого числа европейских и азиатских штаммов и изолятов вируса ККГЛ. Было показано, что применение данных праймеров для индикации РНК вируса ККГЛ в полевых и клинических образцах обеспечивает синтез фрагментов ДНК рассчитанного размера (350 п.о.) в условиях ОТ-ПЦР. Специфичность продуктов амплификации была подтверждена методом прямого секвенирования.

Характеристика набора праймеров и участка амплифицируемой геномной РНК

Праймеры фланкируют консервативный участок малого сегмента РНК вируса ККГЛ, кДНК которого имеет приблизительно одинаковое содержание нуклеотидных пар A-T и G-C и не образует выраженных вторичных структур. Специфичность образующегося фрагмента кДНК можно установить прямым секвенированием полученного фрагмента, используя праймер SP3 и/или SP4, что нами и было выполнено для большого количества штаммов и изолятов вируса ККГЛ, выделенных в различных регионах России и странах Средней Азии от больных и от клещей рода Hyalomma - переносчиков вируса.

Кроме того, разработаны условия ОТ-ПЦР с использованием ферментов и прибора для амплификации отечественного производства (ТП4-ПЦР-01-"Терцик", АО ДНК-Технология, г.Москва), что является важным обстоятельством, так как зарубежные наборы для ОТ-ПЦР и приборы для амплификации чрезвычайно дорогостоящи.

Получен следующий технический результат:

Набор праймеров, взятый за прототип, был разработан на основе известных к тому времени нуклеотидных последовательностей малого сегмента генома вируса ККГЛ: 12 полных последовательностей, из которых лишь две представляли штаммы из России и 1 из Средней Азии (Узбекистан) и нескольких фрагментов этого геномного сегмента штаммов и изолятов из России и Средней Азии (Таджикистан и Казахстан).

К моменту разработки нового заявляемого набора праймеров количество установленных полных нуклеотидных последовательностей малого сегмента возросло вдвое, кроме того авторами были определены нуклеотидные последовательности фрагментов S-сегмента генома для большого количества штаммов и изолятов вируса ККГЛ из различных регионов юга России, Среднеазиатского региона (Казахстан, Таджикистан, Туркменистан) и Болгарии. Причем авторам удалось установить, что популяция вируса ККГЛ в Средней Азии генетически очень гетерогенна и набор праймеров, взятый в качестве прототипа, не мог обеспечить надежной детекции некоторых генетических вариантов вируса. В общей сложности при разработке нового набора праймеров учитывались вариации в строении генома более чем 40 штаммов и изолятов вируса ККГЛ, причем более половины из них - представители России и стран ближнего зарубежья, что особенно важно для надежной диагностики ККГЛ в этом регионе. Заявляемый набор праймеров прошел удачную апробацию на вируссодержащих образцах различного происхождения (донорская кровь, секционный материал, гомогенаты клещей разных видов) - всего более 80 образцов. Надежность детекции повышается за счет большей специфичности и универсальности новых праймеров, а также в связи с уменьшением длины амплифицируемого участка.

Таким образом, повышение надежности и универсальности заявляемого набора праймеров обеспечивается за счет того, что он разработан на основе более 40 изученных штаммов и изолятов вируса ККГЛ (в прототипе использованы только 10 штаммов). Особенно это касается ключевых праймеров: PS1, с которого инициируется синтез кДНК и первый раунд ПЦР, а также PS5, предназначенного для проверки специфичности ОТ-ПЦР. Длина амплифицируемого фрагмента кДНК содержит 350 п.о. (в прототипе - 506 п.о.), что снижает требования к качеству обратной транскриптазы и матричной РНК. Не требуется прямой контрольный праймер, используемый в прототипе.

Перечень графических материалов.

На фиг.1 представлена нуклеотидная последовательность участка малого сегмента РНК вируса ККГЛ, амплифицируемая патентуемым набором олигонуклеотидных праймеров. Продукт амплификации соответствует фрагменту нуклеотидной последовательности малого сегмента генома длиной 350 п.о. На фиг.2 приведена электрофореграмма продуктов ОТ-ПЦР с использованием различных образцов; 1,5% агарозный гель.

Пример 1. Методика получения набора праймеров для выявления генетического материала вируса ККГЛ в пробах

На основе теоретического изучения структуры малого сегмента РНК всех известных штаммов и изолятов вируса ККГЛ из различных регионов мира были рассчитаны и синтезированы праймеры для проведения ОТ-ПЦР (таблица 1).

Таблица 1
Структура набора заявляемых праймеров для выявления РНК вируса ККГЛСтруктура праймеровНаименованиеЛокализация на малом сегменте генома, нукл.5' gaagccaa(a,g)aagac(t,c)gt(a,g)gaggctc 3'SP1800-8245' caattgtcttggc(a,g)ca(t,c)ggatt 3'SP21325-13465' gcacagattgacac(t,c)(g,c)ctttcagc 3'SP3959-9825' gtccg(t,a)aggtt(a,g)agaatggacttggt 3'SP41283-1308

Отработка условий амплификации проводилась при использовании в качестве матрицы рекомбинантной плазмиды, содержащей полную копию малого сегмента генома вируса ККГЛ штамма STV/HU29223 (Ставрополь), полученную нами ранее. Отработаны условия амплификации, которые были использованы для обнаружения генетического материала вируса ККГЛ в клинических (препараты крови заболевших и секционный материал умерших) и полевых (суспензии клещей) образцах. В качестве положительного контроля использовали музейные штаммы вируса ККГЛ, адаптированные к культуре клеток SW-13 и вышеназванную рекомбинантную плазмиду.

Ниже в примерах (2-6) приведена методика индикации генетического материала вируса ККГЛ в образцах.

Пример 2. Выделение РНК вируса ККГЛ из клинических и полевых образцов (сыворотки крови, суспензии клещей)

1. 150 мкл пробы смешивают со 150 мкл раствора Д+ и выдерживают 5 мин во льду.

2. Добавляют 300 мкл смеси фенол:хлороформ:изоамиловый спирт (24:24:1) встряхивают вручную 1 мин.

3. Центрифугируют при +4°С 30 мин при 15000g.

4. Отбирают водную (верхнюю) фазу и помещают в новую пробирку, содержащую 300 мкл охлажденного во льду изопропанола.

5. Образец замораживают при -70°С (не менее 15 мин) или выдерживают 12 ч в морозильной камере.

6. Центрифугируют 10 мин при комнатной температуре при 15000g, супернатант убирают. (При выделении РНК из цельной крови осадок ресуспендируют в 100 мкл раствора Д и повторяют пункты 2-5).

7. Дважды обмывают осадок 75% этанолом (по 0,5 мл) и 1 раз 96% этанолом с центрифугированием 1 мин при 12000g при комнатной температуре.

8. Этанол сливают, пробирку переворачивают вверх дном и помещают на бумагу на 2 мин, затем высушивают осадок при комнатной температуре 20 мин.

9. Растворяют осадок РНК в 40 мкл воды при энергичном всряхивании на Vortex.

Примечание: состав растворов:

Д - 4 М гуанидинизоцианат; 25 мМ цитрат натрия рН 7,0; 0,5% саркозил;

0,1 М 2-меркаптоэтанол. Хранится при комнатной температуре или при +4°С до 1 года.

Д+ - это раствор Д, содержащий 0,2 М натрия ацетат рН 4,0.

Пример 3. Получение кДНК методом обратной транскрипции.

Состав реакционной смеси:

Вода - 9,2 мкл.

Праймер SP1 (10 пкм/мкл) -2 мкл.

Раствор суммарный dNTP (25 мМ) - 0,8 мкл.

Буфер Х10 - 2 мкл.

РНК - 5 мкл.

Обратная транскриптаза - 1 мкл (25 е.а.).

Условия проведения реакции:

37°С - 1 ч; 99°С - 10 мин; 37°С - 7 мин.

Пример 4. Первый раунд ПЦР

Состав реакционной смеси:

Вода - 36,4 мкл.

Буфер Х10 - 5 мкл.

Раствор суммарный dNTP (25 мМ) - 0,6 мкл.

Праймер SP2 (10 пкм/мкл) - 1 мкл.

Праймер SP1 (10 пкм/мкл) - 1 мкл.

кДНК - 5 мкл.

Taq-ДНК-полимераза - 1 мкл (5 е.а.).

Условия проведения реакции:

94°С - 0,5 мин; 50°С - 1,0 мин; 72°С - 1,5 мин - 3 цикла.

94°С - 0,4 мин; 55°С - 0,7 мин; 72°С - 0,5 мин - 32 цикла.

72°С - 3 мин.

Пример 5. Второй раунд ОТ-ПЦР

Состав реакционной смеси:

Вода - 39,4 мкл.

Буфер Х10 - 5 мкл.

Раствор суммарный dNTP (0,25 мМ) - 0,6 мкл.

Праймер SP3 (10 пкм/мкл) - 1 мкл.

Праймер SP4 (10 пкм/мкл) - 1 мкл.

ДНК 1 раунда - 2 мкл.

Taq-ДНК-полимераза - 1 мкл (5 е.а.).

Условия проведения реакции те же, что и в первом раунде ПЦР (см. выше).

Пример 6. Данные анализа продуктов амплификации

На фиг.1 представлена нуклеотидная последовательность участка малого сегмента РНК вируса ККГЛ (изолят ASTR/TI28870, Астрахань), амплифицируемая заявляемым набором олигонуклеотидных праймеров. Общая длина продукта амплификации составляет 350 п.о., из которых 50 п.о. приходится на праймеры SP3 и SP4. Таким образом, длина участка, нуклеотидная последовательность которого может быть определена, составляет 300 п.о. (983-1282).

Анализ продуктов амплификации проводится в 1,5% агарозном геле (фиг.2). Электрофореграмма продуктов реакции ОТ-ПЦР получена из клинических и полевых образцов (сывороток крови больных - HU; и гомогенатов положительных на антиген вируса ККГЛ клещей - TI). Изоляты HU0142, HU0152, HU0143, TI0119, TI0131 из Казахстана, а изоляты - TI0213, TI0220, TI0204, TI0212 из Таджикистана, соответственно.

Длина полученного после двух раундов ПЦР фрагмента соответствует расчетной (350 п.о.), а в отрицательном контроле продукты амплификации отсутствуют.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии. Предложен набор олигонуклеотидных праймеров для идентификации вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки, содержащий 2 пары олигонуклеотидов, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции. Изобретение может быть использовано в медицине для выявления генетического материала вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки (ККГЛ) в полевых и клинических образцах, а также для решения научно-исследовательских задач по изучению генома вируса ККГЛ. 2 ил., 1 табл.

Набор олигонуклеотидных праймеров для идентификации РНК вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки в полевых и клинических образцах, содержащий 2 пары олигонуклеотидов, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции со следующей структурой:

5' gaagccaa(a,g)aagac(t,c)gt(a,g)gaggctc 3' - SP1;

5' caattgtcttggc(a,g)ca(t,c)ggatt 3' - SP2;

5' gcacagattgacac(t,c)(g,c)ctttcagc 3' - SP3;

5' gtccg(t,a)aggtt(a,g)agaatggacttggt 3' - SP4.