СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО НЕКРОЗА ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЛОСОСЕВЫХ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ Российский патент 2014 года по МПК G01N33/50 

Предлагаемое изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики вирусных болезней животных, научных исследований в ветеринарии и молекулярной биологии.

Инфекционный некроз поджелудочной железы (Infectious pancreatic necrosis virus, IPNV) - высококонтагиозная вирусная болезнь, поражающая молодь культивируемых лососевых и некоторых видов рыб других семейств, обитающих как в пресной, так и в морской воде. Вирус инфекционного некроза поджелудочной железы наносит существенный экономический ущерб рыбоводческим хозяйствам РФ.

В комплексе мероприятий по оздоровлению хозяйств от вируса инфекционного некроза поджелудочной железы ведущее место принадлежит диагностике. Отсутствие коммерчески доступных диагностикумов на отечественном рынке вызвало необходимость создания тест - системы для идентификации IPNV методом полимеразной цепной реакции.

В настоящее время совершенствование методов диагностики IPNV крайне необходимо поскольку традиционные методы выделения вируса в культурах клеток не всегда позволяют идентифицировать вирус и занимают длительное время.

Принцип ПЦР заключается в многократном увеличении (амплификации) определенного участка ДНК выявляемого объекта путем его копирования с помощью фермента ДНК-полимеразы и специфических праймеров. Поскольку геном IPNV представлен двухцепочечной молекулой РНК в виде двух сегментов А и В, предварительно - перед постановкой ПЦР-РНК переводят в кДНК благодаря ферменту обратной транскриптазе. Специфические праймеры (прямой и обратный) ограничивают определенный фрагмент нуклеотидной последовательности таким образом, что элонгация новой цепи кДНК при обратной транскрипции и последующей амплификации в ПЦР происходит только между ними. Основными параметрами эффективного прохождения реакции амплификации, обеспечивающими специфичность и чувствительность, являются правильный выбор области генома идентифицируемого агента, структура и температурный режим отжига олигонуклеотидных праймеров.

Известны способы выявления фрагмента генома вируса инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых методом ПЦР с использованием праймеров к сегменту А [1].

Также описан способ выявления РНК вируса инфекционного некроза поджелудочной железы методом «гнездовой» ПЦР (nested-PCR) с праймерами к сегменту А, которые имеют следующую структуру:

1 5'-CCAAACCAACAGGTCCTATCCTAC-3' (внешний прямой)

2 5'-TGATGCCGTTGTTCTCATCAGCTG-3' (внешний обратный)

3 5'-GAAGGAGATGACATGTGCTACACC-3' (внутренний прямой праймер с биотинилированной меткой на 5'-конце)

4 5'-GAGAGATGTGTTTGCCACCATCTC-3' (внутренний обратный)

Фрагмент, полученный в первом раунде ПЦР, служит матрицей во втором раунде ПЦР. Во втором раунде используется два меченых праймера: один имеет биотинилированную метку на 5'-конце, другой содержит радиоактивную метку ³²P. Разделение ампликонов проходит с использованием магнитных частиц с последующей детекцией уровня радиоактивного излучения [2].

Известные способы выявления фрагментов генома вируса инфекционного некроза поджелудочной железы не лишены недостатков: использование радиоактивной метки требует соблюдения специальных мер безопасности и лицензирования лаборатории, в способе, предложенном K. Williams et al., амплифицируется фрагмент гена VP2, характерный для всех бирнавирусов, что не исключает возможность ложноположительных результатов. Описанные в литературе праймеры подобраны к генам сегмента А. В то же время установлено, что изоляты IPNV, выделенные из разных географических мест, отличаются высоким генетическим разнообразием, главным образом, обусловленным вариабельностью генов, кодируемых именно сегментом А. В этой связи высока вероятность того, что праймеры к сегменту А могут не подойти к вновь изолированным вирусам с измененным генотипом. В первую очередь это касается изолятов из водоемов тех регионов, где исследование на присутствие IPNV ранее не проводилось.

Для идентификации возбудителя методом ПЦР целесообразно использовать праймеры к наиболее консервативной области генома. В случае IPNV это может быть сегмент В, кодирующий ключевой фермент репликации вирусного генома РНК-зависимую РНК-полимеразу.

В задачу исследований входило - разработка эффективного способа обнаружения фрагменов генома вируса инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых методом гнездовой ПЦР с использованием 4 специфических олигонуклеотидных праймеров.

Первоочередной задачей было конструирование четырех специфических праймеров к IPNV, которые являются главным компонентом ПЦР и обеспечивают ее специфичность и чувствительность.

Для выбора праймеров был использован сегмент В - в то время как в публикациях преимущественно описаны праймеры к сегменту А. При конструировании праймеров и оценке их специфичности использовали нуклеотидные последовательности и программу BLAST, доступные в Интернете на сайте NCBI Предложенный способ заключается в следующем: с помощью компьютерной программы DNASTAR (Lasergene Co., США) на основании программы, предоставленной в базах данных Интернет ресурсов GenBank(CLUA), по генотипам вируса инфекционного некроза поджелудочной железы выбирают рефернс - последовательность NC_001916 штамма Jasper. Праймеры проверяют на отсутствие гомологии с последовательностями других вирусов и генома человека программой BLAST с помощью веб-ресурса Национального центра биотехнологической информации (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). На основании проведенного компьютерного анализа была подобрано 2 пары праймеров: внешние B37 и B853r и внутренние B123 и B320r.

Название 5'--3' длина B37 ACG TTG GTG GCA CCC GAC АТА С 22 B123 TGT CGG АСА ТСТ ТСА ACT CAC С 22 B320r CAG TCG AGGCAG AGCGGC АТС 21 B853r GTG ТСТ ССТ TTGGTT TTGCCT ATG 24

Синтез разработанных олигонуклеотидных праймеров заказывается в коммерческом сервисном центре.

Четыре праймера к сегменту В были подобраны таким образом, что позволяют применить технику гнездовой и полугнездовой ПЦР, а также могут быть использованы для секвенирования.

Праймеры имеют следующую характеристику: комлементарность выбранной области гена сегмента В, отсутствие самокомлементарных участков внутри каждого праймера и между прямым и обратным, фланкируют область фрагментов гена В размером 860 пн и ≈240 пн, соответственно. Синтез разработанных олигонуклеотидных праймеров заказывается в коммерческом сервисном центре.

Пример 1

Амплификация специфических фрагментов кДНК вируса инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых с помощью разработанных праймеров для диагностики болезни.

В процессе проведения практических экспериментов подбирают оптимальные условия прохождения полимеразной цепной реакции с разработанными праймерами.

Предварительно проводят реакцию обратной транскрипции с парой внешних праймеров. Реакция обратной транскрипции проходит при 42° в течение 45 минут, затем полученную кДНК прогревают при 95° в течение 3 минут и используют для постановки ПЦР. Состав реакционной смеси указан в таблице 1. В качестве положительного контроля на стадии обратной транскрипции и ПЦР используют эталонные штаммы IPN (предоставлен доктором E. Neuvonen, Ветеринарный институт, Хельсинки, Финляндия. Предварительно штамм был испытан методом ИФА), в качестве отрицательного - воду или среду для культур клеток (например, Игла MEM).

Полимеразную цепную реакцию проводят в объеме реакционной смеси 25 мкл на 1 пробу ДНК.

Состав реакционной смеси представлен в таблице 2. Температурно-временной режим проведения реакции для амплификатора «Терцик» («ДНК-технология», Россия) представлен в таблице 3. Условия амплификации и реакционной смеси для первого и второго раунда одинаковые.

После проведения реакции амплификации продукты ПЦР анализируют методом электрофоретического разделения в 2% агарозном геле с добавлением бромистого этидия.

В процессе ПЦР были получены продукты амплификации кДНК вируса инфекционного некроза поджелудочной железы размером около 860 пн в первом раунде ПЦР и 240 пн во втором раунде ПЦР, что подтверждалось во всех экспериментах. Электрофореграмма результатов ПЦР представлена на рис.1. При учете результатов ПЦР в первую очередь оценивали контрольные образцы. В электрофоретической дорожке с положительным контрольным образцом (K+) присутствовала светящаяся полоса на уровне соответствующем фрагменту длиной 860 или 240 пн (в первом и втором раунде, соответственно; оценивали по маркеру М).

Опытные пробы оценивали по наличию в соответствующей дорожке специфической полосы, которая в положительных образцах располагалась на том же уровне, что и полоса в положительной контрольной пробе. В отрицательных пробах полоса отсутствовала (рис.2).

Пример 2

Определение чувствительности реакции амплификации с использованием разработанных специфических олигонуклеотидных праймеров.

Анализировали десятикратные разведения инфицированной IPNV суспензии клеток с исходным титром 7,5 lg ТЦД₅₀/мл. (10^7,5 ТЦД₅₀/мл).

При проведении «гнездовой» ПЦР последним разведением, в котором обнаруживалась специфическая полоса, было разведение 10^-7, что соответствует 0,5 lg ТЦД₅₀/мл или ~3 ТЦД₅₀/мл. Электрофореграмма результатов ПЦР представлена на Рисунке 2.

Пример 3

Определение специфичности реакции амплификации с использованием разработанных специфических олигонуклеотидных праймеров.

Специфичность праймеров проверяли на образцах вируса инфекционного некроза гемопоэтической ткани, вируса инфекционного некроза поджелудочной железы и вируса геморрагической септицемии лососевых. Специфическая полоса была выявлена только в случае наличия в пробе вируса инфекционного некроза поджелудочной железы.

Предложенный вариант апробирован с положительным результатом и регулярной воспроизводимостью в 2010-2011 годах на 500 пробах, полученных из гомогената внутренних органов рыб, поступивших из хозяйств Московской, Рязанской областей и республики Карелия, а также инфицированных клеточных культур.

Предлагаемое изобретение найдет применение в диагностических исследованиях в научно- исследовательских институтах, ветеринарных лабораториях, рыбоводческих хозяйствах.

Литература

1. Wiliams K., Blake S., Sweeney A., Singer J.T., Nicholson B.L. // Multiplex Reverse transcriptase PCR assay for simultaneous detection of three fish viruses // J of clinical microbiology. - 1999. - V.37 (№12). - Р.4139-4141.

2. Rimstad E., Homes E., Olsvik O., Hyllseth B. // Identification of a double-stranded RNA virus by using polymerase chain reaction and magnetic separation of the synthesized DNA segments // J of clinical microbiology - 1990 -. V.28 (№10). - Р.2275-2278.

Сущность изобретения поясняется таблицами и рисунками, в которых отображается следующая информация:

Таблица 2 Состав реакционной смеси для проведения ПЦР для 1 реакции объемом 25 мкл Компоненты ПЦР Исходная концентрация Конечная концентрация Объем на 1 реакцию ПЦР-смесь 2 red 2,5 х 1х 10 мкл дНТФ 10 µМ 0,2 µМ 0,5 мкл «Прямой» праймер B37(B123)* 10 µМ 0,2 µМ 0,5 мкл «Обратный» праймер B853 (B320)* 10 µМ 0,2 µМ 0,5 мкл Вода     8,5 мкл кДНК (матрица)     5 мкл * в скобках указаны праймеры для второго раунда ПЦР

Таблица 3 Температурно-временной режим проведения ПЦР (прибор «Терцик», Россия) Описание стадии Температура, °С Длительность, сек. Кол-во циклов 1 Предварительное нагревание прибора «пауза» 94 - - 2 Черничная денатурация ДНК 95 120 1 3 Денатурация ДНК 95 20 3 4 Гибридизация праймеров со специфическими участками 50 20 5 Синтез комплементарных цепей 72 50 6 Денатурация ДНК 95 20 30 7 Гибридизация праймеров со специфическими участками 58 20 8 Синтез комплементарных цепей 72 50 9 Конечный синтез комп-х цепей 72 120 1 10 Хранение 10 - -

Изобретение относится к области молекулярной биологии и ветеринарии и предназначено для диагностики вируса инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых. Осуществляют два раунда полимеразной цепной реакции с праймерами B37-B853r и B123-B320r для выявления фрагмента сегмента В, кодирующего РНК-зависимую РНК-полимеразу вируса инфекционного некроза поджелудочной железы с последующим электрофоретическим определением размера амплифицируемого фрагмента нуклеотидной последовательности. По наличию на электрофореграмме фрагментов длиной 860 и/или 240 пн в исследуемом образце диагностируют вирус инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых. Предлагаемое изобретение применимо в диагностических исследованиях в научно-исследовательских институтах, ветеринарных лабораториях, рыбоводческих хозяйствах. 2 ил., 3 табл., 3 пр.

Способ диагностики вируса инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых методом полимеразной цепной реакции, при котором используют два прямых и два обратных олигонуклеотидных праймера для выявления фрагмента сегмента B, кодирующего РНК-зависимую РНК-полимеразу вируса инфекционного некроза поджелудочной железы следующей структуры - B37: ACGTTGGTGGCACCCGACATAC, B123: TGTCGGACATCTTCAACTCACC, B320r: CAGTCGAGGCAGAGCGGCATC, B853r: GTGTCTCCTTTGGTTTTGCCTATG, с электрофоретическим определением размера амплифицируемого фрагмента нуклеотидной последовательности, где по наличию на электрофореграмме фрагментов длиной 860 и/или 240 пн в исследуемом образце диагностируют вирус инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых.