НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ-ПРАЙМЕРОВ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ РНК ВИРУСА КРЫМСКОЙ-КОНГО ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ Российский патент 2003 года по МПК C12P19/30 C12Q1/68 C07H21/04 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и может быть использовано в медицине для выявления генетического материала вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки (ККГЛ) в пробах, а также для решения научно-исследовательских задач по изучению ККГЛ.

Метод обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) является прямым методом выявления РНК вируса и имеет высокую степень чувствительности. В основе ОТ-ПЦР лежит получение кДНК на матрице вирусной РНК с помощью фермента обратной транскриптазы и многократное копирование с помощью фермента ДНК-полимеразы определенного фрагмента кДНК, являющегося маркерным для данного вида возбудителя инфекционного заболевания. Для эффективного проведения ОТ-ПЦР необходимы праймеры - синтетические олигонуклеотиды определенного размера, специфичные для каждого вида и типа вируса. Ограниченность использования праймеров обусловлена их видоспецифичностью. Праймеры должны быть комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, чтобы синтез ДНК, осуществляемый ДНК-полимеразой, протекал только между ними. В результате происходит экспоненциальное увеличение количества копий специфического фрагмента. От правильно выбранных праймеров, определяющих специфичность ПЦР, зависит точность диагностирования исследуемого вируса.

Известен зарубежный аналог (прототип), представляющий собой набор олигонуклеотидов-праймеров, обеспечивающих специфический синтез продуктов амплификации на матрице ДНК-копии РНК вируса ККГЛ различных географических изолятов (Luis L. Rodriguez, Gary 0. Maupin and al. Molecular investigation of a multisource outbreak of crimean-congo hemorragic fever in the United Arab Emirates//J. The American Society of Tropical Medicine and Hygiene, 57(5), 1997. - pp.512-518) [1].

Однако данный набор праймеров разработан на основе структуры РНК изолятов вируса ККГЛ, циркулирующих за пределами южных регионов России и других стран СНГ и отличающихся по строению генома от вирусов, циркулирующих на территории стран СНГ, что не обеспечит надежного выявления генетического материала вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки (ККГЛ) в пробах, отобранных на указанных территориях.

Техническим результатом заявляемого изобретения является разработка набора праймеров для индикации генетического материала вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки с учетом вариаций в строении генома различных географических изолятов вируса, циркулирующих на территории республик Средней Азии и южных регионов России.

Указанный результат достигается разработкой набора олигонуклеотидов-праймеров для идентификации РНК вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки, содержащего 2 пары дезоксирибоолигонуклеотидов, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции, имеющих следующую структуру:
5'agagactgaggggaagggag3' - PS1;
5'aattgtcttggcacacggat3' - PS2;
5'caaaaagactgtagaggctc3' - PS3;
5'ttgtccgtaggttaagaatg3' - PS4.

В набор также включены аналоги вышеприведенных праймеров, имеющих вырожденную структуру с учетом вариаций в этих участках генома различных изолятов, в особенности из регионов России и прилегающих к ней. Праймеры имеют следующую структуру:
Ps1* 5'-agagac(t,c)gaggggaa(a,g)ggag-3';
Ps2* 5'-aattgtcttggc(a,g)ca(t,c)ggat-3';
Ps3* 5'-caa(a,g)aagac(t,c)gt(a,g)gaggctc-3';
PS4* 5'-ttgtccg(t,a)aggtt(a,g)ag(a,g)atg-3'.

В набор также входит контрольный праймер Ps5, располагающийся внутри амплифицируемого района и имеющий следующую структуру:
Ps5 5'-ct(t,c)tcagctc(a,g)t(t,a)ctactggct-3'
В рамках заявляемого технического решения разработана схема выбора праймеров с учетом вариаций в строении генома различных географических изолятов вируса, циркулирующих на территории республик Средней Азии и южных регионов России. Апробация праймеров была осуществлена с использованием европейских и азиатских штаммов и изолятов вируса. Было показано, что применение данных праймеров для индикации РНК вируса ККГЛ в пробах обеспечивает синтез фрагментов ДНК рассчитанного размера в условиях ОТ-ПЦР. Специфичность продуктов амплификации была подтверждена методом прямого секвенирования.

Характеристика набора праймеров и участка амплифицируемой геномной РНК.

Праймеры фланкируют консервативный участок малого сегмента РНК вируса ККГЛ, кДНК которого имеет приблизительно одинаковое содержание нуклеотидных пар А-Т и G-C и не образует выраженных вторичных структур. Причем для большинства известных изолятов, у которых структура данного участка малого сегмента генома установлена, внутри этого участка содержится сайт рестрикции для эндонуклеазы HindIII в позиции 1127. Данное обстоятельство позволяет проводить оценку специфичности продуктов амплификации простым рестрикционным анализом. В тех случаях, когда указанный сайт отсутствует, специфичность образующегося в реакции ОТ-ПЦР фрагмента легко установить при помощи повторного проведения ПЦР с использованием в качестве матрицы полученного фрагмента и пары праймеров Ps5 (прямой) и Ps3 либо Ps3* (обратный). Причем полученный фрагмент не исключает возможности расщепления рестриктазой HindIII в случае наличия этого сайта. Безусловное доказательство возможно проведением прямого секвенирования ПЦР-фрагмента, что нами и было выполнено. Возможные вариации в геноме некоторых изолятов в местах расположения праймеров Ps1-Ps4 могут не обеспечить надежного тестирования; тогда их заменяют праймерами Ps1*Ps-4* либо во втором раунде ПЦР вместо праймера Ps3 используют Ps5 и амплифицируют фрагмент меньшей длины (335 п.о.). Таким образом, возможны различные варианты проведения ОТ-ПЦР с использованием разных праймеров из предложенного набора и оценки специфичности амплифицированного фрагмента.

Кроме того, разработаны условия ОТ-ПЦР с использованием ферментов и прибора для амплификации отечественного производства (Бис-1), что является важным обстоятельством, так как зарубежные наборы для ОТ-ПЦР чрезвычайно дорогостоящи. Технический результат: разработаны праймеры для индикации вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки.

Перечень графических материалов.

На фиг.1 представлена нуклеотидная последовательность участка малого сегмента РНК вируса ККГЛ (изолят HU2015, Казахстан), амплифицируемая патентуемым набором олигонуклеотидов-праймеров. Продукт амплификации соответствует отрезку нуклеотидной последовательности участка генома длиной 506 п.о. (из которых 259 составляют А-Т-пары, т.е. соотношение пар A-T/G-C, близкое к 1/1) и несет мутацию в сайте HindIII (AAGCTT=>AAGCTC).

На фиг.2 приведена электрофореграмма продуктов ОТ-ПЦР-исследования (2-й раунд амплификации) с использованием праймеров серии Ps клинических образцов (сыворотки крови больных ККГЛ) в 1,5%-ном агарозном геле.

Пример 1. Методика получения набора праймеров для выявления вируса ККГЛ в пробах
На основе теоретического изучения структуры малого сегмента РНК вируса ККГЛ были синтезированы праймеры для проведения обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (таблица).

В качестве контрольных праймеров синтезировали праймеры, соответствующие по первичной структуре зарубежному аналогу [1] -прототипу:
5'tggacaccttcacaaactc3' F2 (135-153);
5'gaatgtgcatgggttagctc3' F3 (290-309);
5'gacatcacaatttcaccagg3' R2 (549-530);
5'gacaaattccctgcacca3' R3 (670-653).

Отработка условий амплификации проводилась при использовании в качестве матрицы плазмидного вектора, содержащего клонированную ДНК-копию малого сегмента РНК вируса ККГЛ.

В качестве ДНК стандарта был использован плазмидный вектор, содержащий полную ДНК-копию малого сегмента РНК вируса ККГЛ, полученный из Оксфордского Института микробиологии в 1992 году.

Отработаны условия амплификации, которые были использованы для обнаружения генетического материала вируса ККГЛ в клинических образцах (препараты крови заболевших и секционный материал умерших). В качестве положительного контроля использовали музейные штаммы вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки (ККГЛ), адаптированные к культуре клеток SW-13.

Ниже в примерах (2-6) приведена методика индикации генетического материала вируса ККГЛ в пробах.

Пример 2. Выделение РНК вируса ККГЛ из проб (сыворотки крови, суспензии клещей):
1) 150 мкл пробы смешивают со 150 мкл раствора Д+ и выдерживают 5 мин во льду.

2) Добавляют 300 мкл смеси фенол:хлороформ:изоамиловый спирт (24:24:1), встряхивают вручную 1 минуту.

3) Центрифугируют при +4^oС 30 мин при 15000g.

4) Отбирают водную (верхнюю) фазу и помещают в новую пробирку, содержащую 300 мкл охлажденного во льду изрпропанола.

5) Образец замораживают при -70^oС (не менее 15 мин) или выдерживают 12 ч в морозильной камере.

6) Центрифугируют 10 мин при комнатной температуре при 15000g, супернатант убирают. (При выделении РНК из цельной крови осадок ресуспендируют в 100 мкл раствора Д и повторяют пункты 2-5).

7) Дважды обмывают осадок 75% этанолом (по 0,5 мл) и 1 раз 96% этанолом с центрифугированием 1 мин при 12000g при комнатной температуре.

8) Этанол сливают, пробирку переворачивают вверх дном и помещают на бумагу на 2 мин, затем высушивают осадок при комнатной температуре 20 мин.

9) Растворяют осадок РНК в 40мкл воды при энергичном всряхивании на Vortex. Примечание: состав растворов:
Д - 4 М гуанидин изоцианат
25 мМ цитрат натрия рН 7,0
0,5% саркозил
0,1 М 2-меркаптоэтанол
Хранится при комнатной температуре или при +4^oC до 1 года. Д+ -это раствор Д, содержащий 0,2М натрий ацетат рН 4,0.

Пример 3. Получение кДНК методом обратной транскрипции.

Состав реакционной смеси:
Вода - 11 мкл,
Праймер PS2 (27 о.е./мл) - 0,2 мкл
Раствор суммарный dNTP (25 мМ) - 0,8 мкл
Буфер Х10 - 2 мкл
РНК - 5 мкл.

Обратная транскриптаза - 1 мкл.

Условия проведения реакции:
37^oС - 1 час; 99^oС - 10 минут; 37^oС - 7 минут.

Пример 4. 1 раунд РТ-ПЦР.

Состав реакционной смеси:
Вода - 38 мкл
Буфер Х10 - 5 мкл
Раствор суммарный dNTP (25 мМ) - 0,6 мкл
Праймер PS2 (27 о.е./мл) - 0,2 мкл
Праймер PS1 (17,4 о.е./мл) - 0,4 мкл
кДНК - 5 мкл
taq-ДНК-полимераза - 1 мкл.

Условия проведения реакции:
94^oС - 0,5 мин; 40^oС - 1,0 мин; 71^oС - 2,0 мин - 5 циклов.

94^oС - 0,4 мин; 45^oС - 0,7 мин; 71^oС - 1,0 мин - 40 циклов.

71^oС - 5 мин.

Пример 5. 2 раунд ОТ-ПЦР.

Состав реакционной смеси:
Вода - 41 мкл
Буфер X10 - 5 мкл
Раствор суммарный dNTP (0,25 мМ) - 0,6 мкл
Праймер PS3 (27,6 о.е./мл) - 0,2 мкл
Праймер PS4 (24,4 о.е./мл) - 0,2 мкл
ДНК 1 раунда - 2 мкл
Taq-ДНК-полимераза - 1 мкл.

Условия проведения реакции:
94^oС - 0,5 мин; 49^oС - 1 мин; 71^oС - 2 мин - 5 циклов
94^oС - 0,4 мин; 50^oС - 0,5 мин; 71^oС - 0,7 мин - 35 циклов
71^oС - 5 мин.

Пример 6. Данные анализа продуктов амплификации
Анализ продуктов амплификации проводился в 1,5% агарозном геле (фиг.2). Длина полученного после двух раундов ПЦР фрагмента в случаях исследуемых образцов соответствовала расчетной, а в отрицательном контроле (сыворотка здорового человека и реакционная смесь) продукты амплификации отсутствовали.

Заявляемый набор праймеров апробирован для индикации вируса ККГЛ в сыворотке крови больных ККГЛ из южных регионов стран СНГ и показал высокую надежность и достоверность анализов.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицине для выявления генетического материала вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки (ККГЛ) в пробах. Разработан набор олигонуклеотидов-праймеров для идентификации вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки, содержащий 2 пары дезоксиолигонуклеотидов, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции со следующей структурой: 5' agagactgaggggaagggag 3' - PS1; 5' aattgtcttggcacacggat 3' - PS2; 5' caaaaagactgtagaggctc 3' - PS3; 5' ttgtccgtaggttaagaatg 3' - PS4; а также их аналоги с вырожденной структурой: Psl* 5' -agagac(t, c)gaggggaa(a, g)ggag-3', Ps2* 5' aattgtcttggc (a,g)ca(t,c)ggat 3', Ps3* 5'-caa(a, g)aagac(t,c)gt(a,g)gaggctc-3', Ps4* 5'- ttgtccg(t,a)aggtt(a, g)ag(a, g)atg-3' и прямой контрольный праймер со следующей структурой: Ps5 5'-ct(t, c)tcagctc(a, g)t(t, a)ctactggct-3'. Использование набора праймеров позволяет выявлять вирус ККГЛ с учетом вариаций в строении генома различных географических изолятов, циркулирующих на территории Средней Азии и .южных регионов России. 2 ил., 1 табл.

Набор олигонуклеотдов-праймеров для идентификации вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки, содержащий 2 пары дезоксиолигонуклеотидов, обладающих активностью прямого и обратного прайиеров в реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции со следующей структурой:
5' agagactgaggggaagggag 3' - PS1; 5' aattgtcttggcacacggat 3' - PS2;
5' caaaaagactgtagaggctc 3' - PS3; 5' ttgtccgtaggttaagaatg 3' - PS4;
а также их аналоги с вырожденной структурой:
Ps1* 5'-agagac(t, c)gaggggaa(a, g)ggag-3';
Ps2* 5'-aattgtcttggc(a, g)ca(t, c)ggat-3';
Ps3* 5'-caa(a, g)aagac(t, c)gt(a, g)gaggctc-3';
Ps4* 5'-ttgtccg(t, a)aggtt(a, g)ag(a, g)atg-3';
и прямой контрольный праймер со следующей структурой:
Ps5 5'-ct(t, c)tcagctc(a, g)t(t, a)ctactggct-3'.