СИНТЕТИЧЕСКИЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ И СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ РНК ВИРУСА ВИРУСНОЙ ДИАРЕИ - БОЛЕЗНИ СЛИЗИСТЫХ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА С ПОМОЩЬЮ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ В ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ (ПЦР) С ОДНОВРЕМЕННОЙ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЕЙ ШТАММОВ ВИРУСА НА 1 И 2 ГЕНОТИП Российский патент 2009 года по МПК C12N15/10 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к генетической инженерии, и может быть использовано в ветеринарной вирусологии для диагностики инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных, в частности, вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота (ВД-БС КРС), а также дифференциации штаммов вируса на генетические группы (генотипы).

Согласно современной классификации возбудитель болезни относится к роду Pestivirus семейства Flaviviridae и существует в виде двух биотипов: цитопатогенного и нецитопатогенного. Последний, в отличие от цитопатогенного БТ, не вызывает деструкцию культур клеток.

Вирус проявляет антигенную вариабельность и представлен двумя генотипами: 1 и 2. Генотип 2 объединяет высоковирулентные штаммы, вызывающие острую и сверхострую формы болезни с высокой смертностью, тромбоцитопенией и геморрагиями.

Первый генотип вируса распространен повсеместно и вызывает репродуктивные нарушения у коров и быков, желудочно-кишечные и респираторные болезни у телят. Штаммы второго генотипа циркулируют преимущественно в США и Канаде, а в Европе, Азии и Южной Америке регистрируют лишь спорадические случаи вызванной им инфекции.

До настоящего времени основным способом диагностики вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота является длительная процедура, основанная на выделении вируса в чувствительной культуре клеток и постановке реакции нейтрализации в той же культуре клеток с парными пробами сыворотки крови, отобранными от больных животных дважды с интервалом 21 день (Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В., Фомина Н.В. Вирусные болезни животных. - М.: ВНИТИБП. - 1998. - 928 с.).

К недостаткам данного способа можно отнести длительность и трудоемкость.

Известен способ выявления РНК вируса при помощи полимеразной цепной реакции, включающий синтез олигонуклеотидных праймеров, синтез комплементарной ДНК на матрице вирусной РНК в реакции обратной транскрипции и амплификацию синтезированной комплементарной ДНК методом полимеразной цепной реакции с использованием олигонуклеотидных праймеров. Размер продукта амплификации составляет 997 п.н. Чувствительность 0,1 пг вирусной РНК, что соответствует 10000 вирусных частиц (Семенихин В.И., Донченко А.С., Орешкова С.Ф. и др. Способ выявления вируса вирусной диареи (болезни слизистых оболочек) крупного рогатого скота с помощью специфических олигонуклеотидных праймеров в полимеразной цепной реакции (Патент РФ №2158306 от 19.01.1999 г.).

К недостаткам данного способа можно отнести длительную процедуру выделения вирусной РНК, большой размер продукта амплификации и невозможность генотипирования вируса.

Наиболее близким решением данного изобретения являются праймеры и способ выявления РНК вируса ВД-БС КРС, а также генотипирования вируса, основанный на полимеразной цепной реакции (ПЦР), включающий выделение РНК вируса из вируссодержащей суспензии, синтез олигонуклеотидных праймеров на ген NS5B, амплификацию РНК вируса в гнездовой ПЦР, специфическую идентификацию продуктов ПЦР с помощью электрофореза в 2% геле агарозы (Gilbert.A., Burton K.M., Prins S.E., Deregt D. Typing of Bovine Viral Diarrhea Viruses Directly from Blood of Persistently Infected Cattle by Multiplex PCR // Journal of clinical microbiology. - Vol.37, No. 6. - p.2020-2023).

Наружные праймеры для первого раунда амплификации:

5'AAGATCCACCCTTATGA(A/G)GC 3'

5'AAGAAGCCATCATC(A/C)CCACA3'.

Множественные внутренние праймеры для второго раунда ПЦР:

5'TGGAGATCTTTCACACAATAGC3',

5'GGGAACCTAAGAACTAAATC3',

5'GCTGTTTCACCCAGTT(A/G)TACAT3'

К недостаткам данного способа можно отнести то, что он проводится методом гнездовой ПЦР, требующей синтез двух пар праймеров (внутренних и наружных) и, соответственно, проведения реакции в два раунда, а также низкую чувствительность 30-50 ТЦД₅₀/мл.

Задачей изобретения является разработка новых синтетических олигонуклеотидных праймеров и нового эффективного метода выявления вируса вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота (ВД-БС КРС) с помощью синтетических олигонуклеотидных праймеров в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с одновременной дифференциацией вируса на 1 и 2 генотип, за счет повышения степени специфичности и чувствительности, а также сокращение времени проведения метода, за счет проведения ПЦР за один шаг в пробах биоматериала от больных животных различного происхождения.

Поставленная задача решается тем, что синтезируются синтетические олигонуклеотидные праймеры, комплементарные высоко консервативной области генома вируса вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота района гена NS5B, использующиеся для выявления РНК вируса вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота, согласно изобретению имеющие следующий нуклеотидный состав:

5'GAGATCTTTCACACAATAGCTG3',

5'GAACCTAAGAACTAAATCGG 3',

5'TGTTTCACCCAGTTATACATGC3'.

Задача решается также тем, что в способе выявления РНК вируса вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота с помощью синтетических олигонуклеотидных праймеров в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с одновременной дифференциацией штаммов вируса на 1 и 2 генотип, включающий выделение РНК, проведение обратной транскрипции, амплификацию комплементарной ДНК (кДНК) вируса вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота на синтетических олигонуклеотидных праймерах, перенос продукта амплификации на гель и оценку проведения реакции, согласно изобретению праймеры имеют нуклеотидные последовательности 5'GAGATCTTTCACACAATAGCTG3', 5'GAACCTAAGAACTAAATCGG3', 5'TGTTTCACCCAGTTATACATGC3', в случае положительной реакции синтезируется фрагмент, соответствующий размеру 356 н.п. для BVDV1 и 600 н.п. для BVDV2.

Задача решается также тем, что согласно изобретению ПЦР проводится в 1 раунд.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Способ получения синтетических олигонуклеотидных праймеров.

Поиск новых синтетических олигонуклеотидных праймеров осуществляют на основе полных геномов штаммов вируса ВД-БС КРС 1 генотипа «Oregon C24» и 2 генотипа "New York 93", представленных в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/GenbankSearch.html), при помощи пакета программного обеспечения "Lasergen". Полученные последовательности нескольких пар праймеров дополнительно тестируют на специфичность с помощью моделирования ПЦР в программе "Vector NTI Suit" с последовательностями геномов вирусов классической чумы свиней, пограничной болезни овец.

Окончательный выбор праймеров основывается на следующих критериях: высокий индекс сходства фрагмента и РНК различных штаммов BVDV, высокая температура отжига (GC-метод), большая длина консенсусов.

В результате выбраны синтетические олигонуклеотидные праймеры

5'GAGATCTTTCACACAATAGCTG3' специфичный BVDV1,

5'GAACCTAAGAACTAAATCGG3' специфичный BVDV2,

5'TGTTTCACCCAGTTATACATGC3' - специфичный BVDV1 и BVDV2.

Химический синтез праймеров осуществляют амидофосфитным методом на автоматическом синтезаторе ASM-102U.

Концентрацию синтетических олигонуклеотидных праймеров в маточном растворе определяют спектрометрическим методом.

Таким образом, указанный способ позволяет получать синтетические олигонуклеотидные праймеры, комплементарные высоко консервативной области генома вируса ВД-БС КРС района гена NS5B.

Пример 2. Способ выявления РНК вируса вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота с помощью синтетических олигонуклеотидных праймеров в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с одновременной дифференциацией штаммов вируса на 1 и 2 генотип.

Способ осуществляется в несколько этапов.

Этап 1. Выделение РНК вируса ВД-БС КРС.

100 мкл осветленной суспензии вируса или супернатанта пробы биоматериала переносят в пробирку с 450 мкл лизирующего раствора, тщательно перемешивают и добавляют 25 мкл ресуспендированного сорбента, перемешивают и оставляют в штативе на 1 минуту, еще раз перемешивают, оставляют на 5 минут, а затем центрифугируют 30 с при 10 тыс.об./мин. Удаляют супернатант, добавляют 400 мкл раствора для отмывки 1, перемешивают и центрифугируют 30 с при 10 тыс.об./мин. Удаляют супернатант, добавляют 500 мкл раствора для отмывки 3 и повторяют процедуру. Добавляют в пробирки 400 мкл раствора для отмывки 4, тщательно ресуспендирют, центрифугируют 30 с при 10 тыс.об./мин. Удаляют супернатант. Помещают открытые пробирки в термостат 60°С на 5 - 10 минут для подсушивания сорбента. Затем добавляют 40 мкл РНК-элюата, перемешивают, выдерживают 2-3 минуты при 60°С, центрифугируют.

Этап 2. Проведение реакции обратной транскрипции для получения кДНК.

В пробирку, содержащую 9,5 мкл реакционной смеси: буфер для ОТ (50 mM Tris-HCl [рН 8.3], 3 мМ MgCl₂, 75 mM KCl, 10 мМ DTT), 0,1 мМ dNTP, 0,1 мкг праймера для ОТ) и 0,5 мкл ревертазы из набора «Реверта-L», добавляют 10 мкл РНК-пробы, осторожно перемешивают и помещают в термостат 37°С на 30 минут. Затем добавляют 20 мкл ДНК-буфера, тщательно перемешивают и используют для постановки ПЦР.

Этап 3. Амплификация участка к-ДНК вируса ВД-БС КРС, кодирующего ген NS5B. Полимеразная цепная реакция. Состав реакционной смеси: ПЦР-буфер (60 mM Tris-HCl [рН 8.5], 1,5 мМ MgCl₂, 25 mM KCl, 10 мМ 2-меркаптэтанола, 0,1% Тритон Х-100), 0,2 мМ dNTP, по 0,1 мкг каждого праймера, 1.25 U Taq-ДНК-полимераза, 5 мкл продукта обратной транскрипции.

Температурный режим проведения ПЦР: Программа амплификации состоит из следующих температурных режимов: 95°С - 2 мин - 1 цикл; 95°С - 30 с, 60°С - 45 с, 72°С - 45 с - 35 циклов; 72°С - 1 мин. Электрофорез ПЦР-продуктов проводят в 2% агарозе.

Этап 4. Определение размера продуктов диагностической ПЦР.

Продукты ПЦР анализируют методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле в стандартном трис-боратном буфере (рН 8,0).

10 мкл продукта ПЦР смешивают с 2 мкл буфера для нанесения образца (0.25% бромфеноловый синий, 40% сахароза) и вносят в лунку агарозного геля. Электрофорез проводят при напряжении 10 В/см длины геля до тех пор, пока краситель не пройдет от старта не менее половины геля (примерно 30 минут). Результаты электрофореза учитывают, просматривая гель в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм на приборе «Трансиллюминатор».

Маркер молекулярного веса 100 bp. Результат ПЦР считают положительным, если продукт ПЦР соответствует размеру фрагмента в 356 и 600 нуклеотидные пары.

Чувствительность ПЦР в таких условиях составляет 1 ТЦД₅₀/мл.

Таким образом, указанный способ позволяет выявлять РНК вируса ВД-БС КРС в исследуемом материале.

Пример 3. Результаты тестирования штаммов и изолятов вируса ВД-БС КРС

Результаты тестирования штаммов и изолятов вируса представлены в таблице 1.

Результаты показали, что ПЦР выявляет РНК всех исследованных штаммов и изолятов вируса, выделенных в культуре клеток от больных и инфицированных животных и типированных в реакции нейтрализации. Исследованные штаммы и изоляты вируса относятся к первому генотипу вируса.

Таблица№ п/пНаименование штамма (изолята)Клиническая форма заболевания, источник выделенияАмплификация в ПЦРГенотипШтаммы1NADLРеферентный+12Oregon C24Референтный+13BKРеферентный+14TM-340Референтный+1Изоляты5Бизон +16Бонго +171140 +18T-1 +19ЕМ +1

Определение специфичности ПЦР для выявления второго генотипа вируса проводили с использованием программы "Vector NTI Suit" на основе последовательностей полных геномов штаммов BVDV2 "С 412", "New York 93", представленных в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Genbank/GenbankSearch.html).

Таким образом, предлагаемый способ позволяет эффективно выявлять штаммы и изоляты вируса ВД-БС КРС.

Пример 4. Определение специфичности ПЦР.

Результаты опытов по определению специфичности реакции представлены в таблице 2.

Таблица 2Вирус (штамм)Результаты ПЦРВирус ВД-БС КРС (NADL)+Вирус ВД-БС КРС (Oregon C24)+Вирус ВД-БС КРС (ТМ)+Вирус ВД-БС КРС (ВК-1)+Герпесвирус КРС 1-го типа (Оренбург)-Герпесвирус КРС 2 типа (М)-Герпесвирус КРС 4-го типа(Моуаг-33/63)-Вирус чумы свиней-Аденовирус КРС 1 типа (BV-10)-Риновирус КРС 1-го типа (SD-1)-Культура клеток КСТ-Примечание:«+» - положительный результат; «-» - отрицательный результат

Таким образом, предлагаемый способ обладает высокой специфичностью при выявлении РНК штаммов и изолятов вируса ВД-БС КРС.

Пример 5. Выявление РНК вируса ВД-БС КРС в пробах биологического материала, полученного от больных и инфицированных животных.

Образец биологического материала (пробы внутренних органов) весом 300-500 мг растирают в ступке со стеклянным порошком (100-200 мг) и готовят 10%-ные суспензии на физрастворе.

Из проб спермы инфицированных быков-производителей готовят 5%-ные суспензии на физрастворе

Из проб носовых и вагинальных выделений готовят 10%-ные суспензии, а если истечения очень густые, предварительно растирают в фарфоровых ступках с песком.

Суспензию центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин. Для выделения РНК используют по 100 мкл осветленного супернатанта.

Дальнейшая процедура согласно примеру 1.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет эффективно выявлять РНК вируса ВД-БС КРС в пробах различного биоматериала от больных и инфицированных животных.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к генетической инженерии. Предложены синтетические олигонуклеотидные праймеры, комплементарные высоко консервативной области генома вируса вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота района гена NS5B, и способ выявления РНК вируса вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота. Способ может быть использован в ветеринарной вирусологии для диагностики инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных, в частности, вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота, а также дифференциации штаммов вируса на генетические группы (генотипы). 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Синтетические олигонуклеотидные праймеры, комплементарные высоко консервативной области генома вируса вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота района гена NS5B, использующиеся для выявления РНК-вируса вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота, имеющие следующий нуклеотидный состав:

5'GAGATCTTTCACACAATAGCTG 3',

5'GAACCTAAGAACTAAATCGG 3',

5'TGTTTCACCCAGTTATACATGC 3'

5' GAGATCTTTCACACAATAGCTG 3', 5' GAACCTAAGAACTAAATCGG 3',

5' TGTTTCACCCAGTTATACATGC 3', в случае положительной реакции синтезируется фрагмент, соответствующий размеру 356 н.п. для BVDV 1 и 600 н.п. для BVDV2.