ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ДОПОЛНИТЕЛЬНОЙ ХИМИОТЕРАПИИ ТУБЕРКУЛЕЗА Российский патент 2007 года по МПК A61K9/08 A61K31/198 A61K33/30 A61P31/06 

Изобретение относится к области медицины и касается нового лекарственного препарата, предотвращающего развитие нефагоцитируемых колониальных форм микобактерий туберкулеза и стимулирующего функции иммунной системы.

В настоящее время в связи с увеличивающимся числом случаев заболеваний туберкулезом особое значение приобретает поиск безопасных фармацевтических препаратов, обладающих профилактическими свойствами и позволяющих повысить эффект стандартной химиотерапии [Хоменко А.Г. Туберкулез. - М.: Медицина, 1992. - 312 с.; Перельман М.И. О концепции Национальной российской программы борьбы с туберкулезом // Проблемы туберкулеза. - 2000. - №3. - С.51-55, Treatment of tuberculosis. Guidelines for national programs. WHO; 1997]. Одним из важнейших факторов защиты организма при инфицировании туберкулезом является клеточный иммунитет. Однако он недостаточно эффективен. Одна из причин неэффективности - недоступность микобактерий туберкулеза для фагоцитоза вследствие образования ими полицеллюлярных колониальных форм, а также ультрамелких форм [Дорожкова И.Р. и др. L-трансформация микобактерий в свете текущей эпидемиологической ситуации туберкулеза в мире // Вестник РАМН. - 1995. - №7. - С.30-33].

В настоящее время разработка новых противотуберкулезных средств производится в основном за счет изменения соотношений между уже известными действующими компонентами (синтетические препараты, антибиотики), применения дополнительно к основной химиотерапии неспецифических препаратов растительного или животного сырья [патент РФ №2211035], а также синтеза новых соединений на основе уже известных [патент РФ №93057160, №2169565]. Это не решает имеющиеся проблемы, а именно: возникновение мультирезистентных штаммов, нейро-, нефро- и гепатотоксичность препаратов [Туберкулез. Патогенез, защита, контроль. Под ред. Б.Р.Блума. - М.: Медицина. - 2002].

Задачей предлагаемого изобретения являлось создание новой высокоэффективной, нетоксичной, без побочных эффектов фармацевтической композиции, обладающей действием как по предотвращению образования нефагоцитируемых колониальных и ультрамелких форм микобактерий туберкулеза, так и стимулирующей функции иммунной системы.

Заявляемая фармацевтическая композиция является новой и в литературе не описана.

Указанные задачи по предотвращению образования нефагоцитируемых форм микобактерий туберкулеза с одновременной активацией иммунитета решаются путем создания фармацевтической композиции, содержащей в качестве действующего вещества раствор сульфата цинка и глицина, таким образом, чтобы не менее 70% ионов цинка находились в составе аквакомплекса Zn²⁺ с глицином. Расчет аналитических (добавленных) концентраций необходимых для образования комплекса ионов цинка с глицином ведется стандартным способом с использованием уравнения для константы равновесия реакции комплексообразования [например, Физическая химия. По ред. Б.П.Никольского. - Л., Химия. - 1987; Россоти Ф., Россоти X. Определение констант устойчивости и других констант равновесия в растворах. - М.: Мир. - 1965] и табличными данными для константы диссоциации цинк-глициновых комплексов [например, Справочник химика. - Л. Химия. - 1965].

Фармацевтическая композиция предпочтительно применяется в виде раствора перорально. Концентрации сульфата цинка и глицина, лежащие в интервале 0,75-1,25 мМ и 15-25 мМ соответственно, являются наиболее оптимальными по следующим причинам. Более 70% ионов цинка связаны в комплекс с глицином, что потенциально увеличивает биодоступность цинка [например, патент РФ №2222996, патент №2000116327]. В этих концентрациях при приеме человеком per os по 200-400 мл утром и вечером может быть достигнута достаточная концентрация цинка и глицина в крови и легких, как следует из данных по фармакокинетике компонентов препарата [Государственный реестр лекарственных средств. - М.: Минздрав России, Фонд Фармацевтической информации, 2003; Авцын А.П., Жаворонков А.А., Риш М.А., Строчкова Л.С. Микроэлементозы человека (этиология, классификация, органопатология). - М.: Медицина, 1991. - 496 с.]. В этих концентрациях препарат не имеет вкуса и запаха. Это открывает возможность его простого использования не только в медицине, но и в ветеринарии при замене им питьевой воды у животных. Возможно применение фармацевтической композиции и при других концентрациях компонентов при соответствующем изменении дозировки.

Указанные в композиции компоненты являются естественными метаболитами, содержащимися в растительных и животных тканях, и представляют собой официнальные порошкообразные вещества белого цвета без запаха, хорошо растворимые в воде, трудно растворимые в этиловом спирте и маслах. В медицине глицин применяется как антистрессовое, ноотропное, нормализующее обменные процессы средство [например, патент РФ №2096034]. Цинка сульфат используют наружно как антисептик, внутрь при недостатке этого элемента [Государственный реестр лекарственных средств. - М.: Минздрав России, Фонд фармацевтической информации, 2003].

Фармацевтическая композиция содержит в качестве растворителя дистиллированную воду или воду, обедненную по дейтерию, или воду, обогащенную по дейтерию, что увеличивает неспецифическую резистентность эукариотической клетки [Сыроешкин А.В., Фролов В.А. От теории топологии и кинетики клеточного формообразования к направленному управлению нормальными и патологическими реакциями клеточных популяций. // Патофизиология и современная медицина. Вторая международная конференция. 22-24 апреля 2004 г. - Москва, Издательство РУДН, 2004. - С.377-379].

Заявляемая фармацевтическая композиция предотвращает развитие нефагоцитируемых колониальных форм Mycobacteria tuberculosis и обладает профилактическим действием при туберкулезе, а также стимулирует функции иммунной системы, как показано ниже в примерах. Из примеров следует, что заявляемая фармацевтическая композиция имеет и иное применение, а именно как средство для дополнительной химиотерапии туберкулеза, предотвращая развитие микобактерий туберкулеза не за счет бактериостатического или бактерицидного действия, а за счет блокирования межпопуляционных переходов. Известные противотуберкулезные средства, включающие изониазид, рифампицин, ПАСК и другие, действуют бактериостатически и бактерицидно [Хоменко А.Г. Туберкулез. - М.: Медицина, 1992. - 312 с. Государственный реестр лекарственных средств. - М.: Минздрав России], снижая концентрацию микобактерий туберкулеза в организме больного. Заявляемая фармацевтическая композиция будет дополнительно оказывать терапевтический эффект за счет ингибированния образования колониальных форм и L-форм микобактерий туберкулеза, снижая таким образом вероятность формирования устойчивости к химиопрепаратам. Повышенная устойчивость L-форм к химиотерапии хорошо известна [Дорожкова И.Р. и др. L-трансформация микобактерий в свете текущей эпидемиологической ситуации туберкулеза в мире // Вестник РАМН. - 1995. - №7. - С.30-33]. Образование полицеллюлярных (колониальных) форм является общей для многих организмов адаптивной реакцией на неблагоприятные внешние воздействия, включая химиотерапию [Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий. - М.: Медицина, 1999. - 366 с.]. Следовательно, предотвращая образование ассоциатов, мы улучшаем доступность микобактерий для воздействия противотуберкулезных средств. Также хорошо известно, что противотуберкулезная химиотерапия вызывает целый комплекс побочных эффектов: гепато- нефро- и нейротоксические реакции, а также угнетение клеточного иммунитета [Хоменко А.Г. Туберкулез. - М.: Медицина, 1992. - 312 с. Treatment of tuberculosis. Guidelines for national programs. WHO; 1997]. Неспецифическая активация резистентности эукариотической клетки и активация иммунного ответа, вызываемые заявляемой фармацевтической композицией, приведут к снижению побочного токсического действия стандартной противотуберкулезной химиотерапии.

Фармакологическое действие заявляемой композиции изучали в экспериментах в суспензии культуры клеток М. tuberculosis на модельной эукариотической клетке и на лабораторных животных. В качестве иллюстрации ее эффективности приведены следующие примеры.

Пример 1. При изучении влияния заявляемой композиции на развитие микобактерий туберкулеза было установлено, что при их размножении в среде Сатона образуются полицеллюлярные колониальные формы, которым принадлежит на определенных стадиях развития (4 неделя) до 90% биомассы клеток. Максимум массового распределения колоний составляет 80 мкм. Внесение в среду культивирования предлагаемой композиции, включающей сульфат цинка и глицин до концентраций 1 мМ и 20 мМ соответственно, приводило к изменению массовых соотношений субпопуляций в полиморфной культуре М. tuberculosis и перераспределению биомассы в сторону образования фагоцитируемых одиночных форм с максимумом массового распределения около 4-8 мкм: 90% биомассы после инкубации в среде Сатона с сульфатом цинка и глицина принадлежит палочковидным формам. Кроме снижения более чем в 10 раз концентрации колониальных полицеллюлярных форм, происходило также практически полное исчезновение ультрамелких форм.

Эти данные подтверждают, что заявляемая композиция обладает выраженным влиянием на процессы формообразования при развитии культуры микобактерий туберкулеза в сторону образования фагоцитируемых форм.

Пример 2. На кроликах породы Шиншилла массой 3,0-3,5 кг (25 голов) было показано влияние как самой изучаемой фармацевтической композиции, так и ее составляющих (сульфата цинка и глицина) на активность естественных киллеров (ЕК), являющихся одним из факторов клеточного иммунитета. Они опосредуют один из основных цитотоксических эффекторных механизмов, направленных на элиминирование антигенно измененных клеток.

Опытные группы кроликов получали по 150 мл в течение пяти суток фармацевтическую композицию (1 мМ ZnSO₄ + 20 мМ глицин) или один из ее компонентов: 1 мМ ZnSO₄, или 20 мМ глицин перорально. Контрольная группа животных не получала препаратов. Через 5 суток у опытных и контрольных кроликов отбирали пробы крови по 20 мл и определяли активность ЕК согласно стандартной методике [Рыкова М.П. и др. Новая высокочувствительная техника тестирования нормальных киллеров. // Иммунология. - 1981. - №3. - С.88-90].

В качестве мишеней использовали монослойно-суспензионную клональную сублинию перевиваемых клеток почки эмбриона свиньи ППК-66-б (4×10⁴ клеток в 0,2 мл). Клетки метили ³H-уридином (конечная концентрация 5 мккюри/мл) и проводили реакцию в течение четырех часов с лейкоцитами крови кроликов (эффекторы). Эффекторы добавляли к мишеням в объеме 0,05 мл при соотношениях 25:1 и вносили 0,05 мл панкреатической РНК-зы с конечной концентрацией 40 мг/мл. После инкубирования в атмосфере 5% двуокиси углерода при 37°С в течение 18 часов содержимое проб отмывали на ультрафильтрах физиологическим раствором, холодной 5% трихлоруксусной кислотой и этанолом. Радиоактивность фильтров измеряли в сцинтилляционном счетчике. Активность ЕК оценивали по индексам цитотоксичности, рассчитанным как отношение радиоактивности надосадка пробы, содержащей клетки-мишени и клетки-эффекторы, к радиоактивности надосадка пробы, содержащей только клетки-мишени.

Этими исследованиями было показано, что прием изучаемой композиции приводит к увеличению активности ЕК в 2,5 раза, в то время как употребление только раствора сульфата цинка приводило к увеличению активности ЕК в 2,0, а глицина - в 1,4 раза. Таким образом, фармацевтическая композиция более эффективна, чем каждый из компонентов в отдельности, и обладает выраженным иммуностимулирующим действием.

Пример 3. Исследования синергетического действия фармацевтической композиции проводили на клеточном биосенсоре Spirostomum ambigua, которое выражалось в усилении выживаемости S. ambigua, проявляющемся в десятикратном увеличением продолжительности жизни клеток. Использование воды, обогащенной дейтерием, приводило к смещению максимума выживаемости в сторону более низких температур (от 30 до 27°С), означающее усиление триггерной активации неспецифической резистентности эукариотической клетки.

Пример 4. Противотуберкулезное действие заявляемой композиции изучали на 40 белых мышах стадного разведения обоего пола массой 19-24 г, которые были разделены на две группы. Первая - была заражена М. tuberculosis. Вторая была заражена М. tuberculosis и получала (с момента инфицирования) содержащую цинк и глицин композицию в количестве 1 мл в сутки. Для заражения отбирали культуру М. tuberculosis в конце логарифмической фазы роста при концентрации клеток 10⁸ кл./мл, которую вводили мышам внутрибрюшинно в количестве 0,1 см³.

На 30-й день с момента заражения мышей декапитировали и отбирали кровь, печень и легкие для исследований. Для выявления и идентификации М. tuberculosis в тканях животных применяли метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), использовали тест-систему с использованием внутренних и внешних праймеров. Полученные данные показывают, что заявляемая композиция обладает профилактическими свойствами, препятствуя развитию микобактерий туберкулеза при инфицировании животных. Так, в крови и легких инфицированных мышей возбудитель М. tuberculosis определяли соответственно у 60% и 10% животных. У мышей, получавших заявляемую композицию, М. tuberculosis в крови и органах не обнаружили.

Кроме того, было отмечено, что инфицирование животных микобактериями туберкулеза приводит к резкому снижению марганца (по данным атомно-абсорбционной спектрометрии с электротермической атомизацией и зеемановской коррекцией фона) в крови и легких. Так, у здоровых мышей содержание марганца в крови составляло 0,29±0,12 мкг на г ткани, а в легких - 0,33±0,01 мкг на г ткани. У мышей, инфицированных микобактериями туберкулеза, содержание марганца в крови и легких было менее 0,005 мкг на г ткани. У животных, принимавших заявляемую фармацевтическую композицию, демонстрировали содержание марганца в крови и легких, которое было такое же, как и у здоровых. Таким образом, заявляемая фармацевтическая композиция препятствует изменению микроэлементного статуса при инфицировании микобактериями туберкулеза.

Изобретение относится к медицине и представляет собой фармацевтическую композицию для перорального применения для профилактики и дополнительной химиотерапии туберкулеза, состоящую из водного раствора сульфата цинка и глицина. Данная композиция является высокоэффективной, нетоксичной, без побочных эффектов, обладающей действием как по предотвращению образования нефагоцитируемых колониальных и ультрамелких форм микробактерий туберкулеза, так и стимулирующей функции иммунной системы.

Фармацевтическая композиция для перорального применения для профилактики и дополнительной химиотерапии туберкулеза, состоящая из водного раствора сульфата цинка и глицина при следующем соотношении, мм:

Сульфат цинка0,75-1,25Глицин15-25