СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К ОНКОЛОГИЧЕСКИМ ЗАБОЛЕВАНИЯМ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ НАБОР ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Российский патент 2007 года по МПК G01N33/50 C12Q1/68 

Изобретение имеет отношение к медицине, молекулярно-биологическим исследованиям предрасположенности в области диагностики онкологических заболеваний.

Одним из наиболее перспективных и успешно развивающихся направлений мировой науки являются молекулярно-биологические технологии - основа для проведения опосредованного медико-генетического анализа. Данные технологии представляют собой широкий спектр методов, предназначенных для исследования и анализа генома организмов (от бактерии до человека), выявления и идентификации вариаций в структуре исследуемого участка нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) вплоть до расшифровки и установления первичной последовательности его оснований. Основой молекулярно-биологических методов диагностики являются различной степени сложности технологические манипуляции с нуклеиновыми кислотами, предварительно выделенными из клеток и тканей организма.

Расшифровка генома человека, идентификация тысяч новых генов и их полиморфизмов послужили концептуальной и методической основой молекулярной медицины, характерные особенности которой - профилактическая направленность и индивидуальный подход к человеку. Последний заключается, прежде всего, в выборе специфических молекулярных маркеров, необходимых для анализа аллельных вариантов набора генов (генной сети), вовлеченных в ту или иную патологию. В практической реализации такого подхода большое значение имеет совершенствование и упрощение методов анализа биологического материала. С этой целью создаются специальные диагностические наборы, опирающиеся на современные технологии и направленные на максимальное упрощение и автоматизацию молекулярных исследований без потери качества и точности анализа (http://www.clinlab.ru/win/LIBRARY/JOURNLAB/lab4/j4ct1.htm).

Стандартный способ диагностики предрасположенности к онкозаболеваниям включает выделение ДНК из лимфоцитов периферической крови, проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР), ферментативного гидролиза эндонуклеазами, электрофорез. Температурный режим ПЦР состоит из следующих этапов: начальное плавление, ряд последовательных циклов из плавления, отжига и синтеза, а также финального синтеза. Используются следующие реагенты: 67 мМ трис-HCl, рН 8.8 при 25°С; 16.6 мМ (NH₄)₂SO₄; 6.7 мМ MgCl₂; 6.7 мкм ЭДТА; 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 170 мкг БСА, смесь четырех dNTP в концентрации 1.0 мМ каждого и термостабильная ДНК-полимераза 0,2 ед./мкл (Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1989, p.5.3-5.31, 6.36-6.45, 9.14-9.23, 14.14-14.19).

Недостатком этого способа является то, что с помощью его можно анализировать только одну мутацию или полиморфизм. Он не позволяет осуществить одновременный анализ сразу нескольких генов, что приводит к замедлению процесса диагностики, увеличению трудозатрат и усложнению рабочего протокола.

В основу изобретения положена задача создания универсального диагностического набора (ДН) для проведения медико-генетического анализа сразу нескольких мутаций (полиморфизмов) разных генов, в том числе генов, ассоциированных с некоторыми частыми мультифакториальными заболеваниями. Вследствие использования стандартных компонент смеси и стандартных олигопраймеров, оптимизации условий постановки полимеразной цепной реакции и анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) скорость анализа сокращается до 2-3 дней, поэтому применение способа определения предрасположенности к онкологическим заболеваниям и диагностического набора приводит к упрощению, удешевлению анализа и делает его пригодным для проведения молекулярных исследований как в специализированных центрах, так и в лабораториях широкого спектра.

Решение этих технических задач обеспечивается описанной ниже модификацией общепринятого способа диагностики мультифакториальных заболеваний. После выделения ДНК проводят одну мультиплексную и одну стандартную полимеразную цепную реакцию с использованием 3 пар праймеров для мультиплексной ПЦР. Далее проводится гидролиз продуктов полимеразной цепной реакции эндонуклеазами рестрикции Hindll (для мультиплексной ПЦР) и BstFNI (для стандартной ПЦР) и электрофорез продуктов гидролиза в 6% полиакриламидном геле до выхода маркера из геля (в качестве маркера используют бромфенол).

В диагностическом наборе, включающем компоненты 67 мМ трис-HCl, рН 8.8 при 25°С; 16.6 мМ (NH₄)₂SO₄; 6.7 мМ MgCl₂; 6.7 мкм ЭДТА; 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 170 мкг БСА, смесь четырех основных dNTP в концентрации 1.0 мМ каждого и термостабильную ДНК-полимеразу 0,2 ед./мкл, все компоненты для проведения мультиплексной полимеразной цепной реакции (за исключением ДНК-полимеразы) смешаны в одном объеме, все компоненты для проведения стандартной полимеразной цепной реакции (за исключением ДНК-полимеразы) и энзиматической рестрикции смешаны в других объемах, а в набор дополнительно включены ДНК для проведения положительного контроля полимеразной цепной реакции и энзиматической рестрикции, вода ампулированная и олигопраймеры.

Наличие смеси компонент, дополнительное введение ДНК для проведения положительного контроля полимеразной цепной реакции и энзиматической рестрикции, воды ампулированной и олигопраймеров в диагностический набор позволяет значительно ускорить процесс анализа, удешевить процедуру диагностики, сделать ее более доступной независимо от условий проведения.

Предложенные условия проведения анализа позволяют с помощью диагностического набора быстро, дешево и точно осуществить диагностику предрасположенности к онкологическим заболеваниям.

Состав набора можно представить в виде следующей схемы, которая показана на чертеже. В состав набора входит 1 - упаковочная коробка для набора; 2 - комплект №1 для проведения ПЦР и энзиматической реакции (смесь для мультиплексной ПЦР, термостабильная ДНК полимераза, буфер для эндонуклеазы рестрикции, эндонуклеаза рестрикции Hindll и контроль для ПЦР и энзиматической реакции); 3 - комплект №2 для проведения ПЦР и энзиматической реакции (смесь для стандартной ПЦР, термостабильная ДНК полимераза, буфер для эндонуклеазы рестрикции, эндонуклеаза рестрикции BstFNI и контроль для ПЦР и энзиматической реакции); 4 - вода ампулированная.

В заявляемом изобретении предлагается новый модифицированный вариант идентификации аллелей генов, ассоциированных с онкозаболеваниями, путем использования набора олигопраймеров и температурного режима, позволяющих проводить мультиплексную полимеразную цепную реакцию и стандартную полимеразную реакцию для определения сразу 2-х полиморфизмов одного гена, причем модифицированную таким образом, что появляется возможность проводить анализ гаплотипов по данному гену (ген р53).

Варианты генов и последовательности олигопраймеров приведены в таблице 1.

Способ состоит из 8 этапов и осуществляется следующим образом.

Этап I. Выделение ДНК по стандартному протоколу.

Этап II. Проведение мультиплексной полимеразной цепной реакции с использованием 3 пар праймеров с помощью диагностического набора. При этом начальное плавление проводят в течение 4-7 минут при температуре 95°С, далее проводят цикл от 28 до 32 раз, включающий плавление при 94-96°С в течение от 40 секунд до 1 минуты, отжиг при температуре от 60 до 62°С в течение от 40 секунд до 1 минуты, синтез при температуре 72°С в течение от 40 секунд до 1 минуты, финальный синтез в течение 3-5 минут при температуре 72°С (Таблица 2). Для амплификации использовали программируемый термоциклер фирмы «Perkin Elmer» (USA).

Этап III. Проведение стандартной полимеразной цепной реакции с помощью диагностического набора. При этом начальное плавление проводят в течение 4-7 минут при температуре 94°С, далее проводят цикл от 30 до 35 раз, включающий плавление при 94-96°С в течение от 40 секунд до 1 минуты, отжиг при температуре от 53 до 56°С в течение от 40 секунд до 1 минуты, синтез при температуре 72°С в течение от 40 секунд до 1 минуты, финальный синтез в течение 5-7 минут при температуре 72°С (Таблица 2). Для амплификации использовали программируемый термоциклер фирмы «Perkin Elmer» (USA).

Этап IV. Проверка специфичности амплификации и количества амплификата (после окончания ПЦР) методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) по стандартному протоколу.

Этап V. Гидролиз амплифицированных фрагментов ДНК эндонуклеазами рестрикции Hindll (для мультиплексной ПЦР) и BstFNI (для стандартной ПЦР) по стандартному протоколу.

Таблица 2.Условия проведения ПЦР.Начальное плавлениеПлавлениеОтжигСинтезФинальный синтезСтандартная ПЦР 30-35 циклов 94°С 4-7 мин94-96°С 40 с - 1 мин53-56°С 40 с - 1 мин72°С 40 с - 1 мин72°С 5-7 минМультиплексная ПЦР 28-32 цикла 95°С 4-7 мин94-96°С 40 с - 1 мин60-62°С 40 с - 1 мин72°С 40 с - 1 мин72°С 3-5 мин

Этап VI. Разделение продуктов гидролиза в 7,5% полиакриламидном геле, приготовленном на трис-боратном буфере (ТБЕ) в аппарате для вертикального электрофореза с длиной стекла 20 см. Для получения 30% раствора акриламида смешивали 29 г акриламида с 1 г N,N-метилен-бис-акриламида и растворяли смесь в 100 мл дистиллированной воды, 10-кратный раствор ТБЕ готовили, растворяя 54 г триса, 27,5 г борной кислоты и 20 мл 0,5 М ЭДТА (рН 8,0) в 0,5 л дистиллированной воды. Для приготовления 40 мл 7,5% полиакриламидного геля смешивали 10 мл 30% акриламида, 4 мл 10-кратного ТБЕ, 26 мл дистиллированной воды, 400 мкл 10% раствора персульфата аммония и 50 мкл тетраметилэтилендиамина. Перед заливкой раствор тщательно перемешивали. Пробы (образцы) наносили в гель в полном полученном после рестрикции объеме для каждого продукта гидролиза в отдельную лунку. Электрофорез проводили в 1-кратном ТБЕ при напряжении электрического поля 100 В, пока образцы не входили в гель и не проходили около 1 см от лунок. После этого напряжение увеличивали до 180-200 В. Останавливали электрофоретическое разделение после выхода бромфенола из геля.

Этап VII. Окрашивание геля водным раствором бромистого этидия (0,5 мкг/мл), просмотр в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе и фотографирование на системе видео-гель-документации.

Этап VIII. Анализ полученных результатов по заданному протоколу.

Использование данного подхода и диагностического набора начато в НИИ Цитологии РАН. Данный способ позволил существенно ускорить и удешевить тестирование заявленных генов более чем в 3 раза.

Предлагаемое изобретение может найти применение в диагностике различных онкологических заболеваний, таких как рак легких, рак груди, рак толстого кишечника, рак мочевого пузыря, рак желудка и некоторых других, связанных с исследованием ДНК.

Изобретение относится к медицине, молекулярно-биологическим исследованиям в области диагностики онкологических заболеваний. Заявленный способ и универсальный диагностический набор (ДН) предназначены для проведения медико-генетического анализа сразу нескольких мутаций (полиморфизмов) разных генов, в том числе генов, ассоциированных с некоторыми частыми мультифакториальными заболеваниями. Вследствие использования стандартных компонент смеси и стандартных олигопраймеров, оптимизации условий постановки полимеразной цепной реакции и анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) скорость анализа сокращается до 2-3 дней. Изобретение обеспечивает упрощение, удешевление анализа и делает его пригодным для проведения молекулярных исследований как в специализированных центрах, так и в лабораториях широкого спектра. 2 н.п. ф-лы, 2 табл., 1 ил.

1. Способ определения наследственной предрасположенности к онкологическим заболеваниям, включающий выделение ДНК; проведение полимеразной цепной реакции для определения мутаций и/или полиморфизма гена, состоящей из начального плавления, ряда циклов из плавления, отжига и синтеза и финального синтеза; проведение гидролиза продуктов полимеразной цепной реакции эндонуклеазами рестрикции Hindi I и BstFNI, а также электрофорез в полиакриламидном геле, отличающийся тем, что проводят мультиплексную полимеразную цепную реакцию с использованием 3 пар праймеров при следующих условиях:

начальное плавление проводят в течение 4-7 мин при температуре 95°С, далее проводят цикл от 28 до 32 раз, включающий плавление при 94-96°С в течение от 40 с до 1 мин, отжиг при температуре от 60 до 62°С в течение от 40 с до 1 мин, синтез при температуре 72°С в течение от 40 с до 1 мин, финальный синтез в течение 3-5 мин при температуре 72°С;

затем проводят модифицированную полимеразную цепную реакцию при следующих условиях:

начальное плавление проводят в течение 4-7 мин при температуре 94°С, далее проводят цикл от 30 до 35 раз, включающий плавление при 94-96°C в течение от 40 с до 1 мин, отжиг при температуре от 53 до 56°С в течение от 40 с до 1 мин, синтез при температуре 72°С в течение от 40 с до 1 мин, финальный синтез в течение 5-7 мин при температуре 72°С, а электрофорез продуктов гидролиза проводят в 7,5%-ном полиакриламидном геле до выхода маркера из геля.

F:5'-CGTTCTGGTAAGGACAAGGGTTGG-3'

R:5'-CGTAGCTGCCCTGGTAGGTTT-3'

F:5'-TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC-3'

R:5'-TCACCGGATCATGGCCAGCA-3'

F:5'-GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC-3'

R:5'-GTTGGGCTCAAATATACGGTGG-3'

F:5'-GAACTGCCACTTCAGCTGTCT-3'

R:5'-GAAAGACCTCCCAGCGGTCA-3'