ПЕПТИД, СТИМУЛИРУЮЩИЙ РЕГЕНЕРАЦИЮ НЕЙРОНОВ ЦЕНТРАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ЕГО ОСНОВЕ И СПОСОБ ЕЕ ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2007 года по МПК A61K38/06 A61P25/28 

Изобретение относится к лекарственным средствам для лечения заболеваний, травм, а также последствий травм центральной нервной системы и может быть использовано как средство, стимулирующее регенерацию нейронов.

Известны препараты, оказывающие влияние на метаболизм и интегративные функции мозга: церебролизин, пирацетам, энцефалолизад; обеспечивающие нормализацию мозгового и системного кровообращения: стугерон, кавинтон; направленные на купирование психопатологических проявлений: меридин, амитриптилин; обладающие способностью изменять биоэлектрическую активность головного мозга: фенобарбитал, конвулекс; воздействующие на ликвородинамические нарушения: верошпирон, фуросемид (Большая Российская Энциклопедия лекарственных средств, М.: Издательство Ремедиум, т.2, 2002).

Известен синтетический пептидный препарат, стимулирующий функциональную активность нейронов (патент РФ №2155063, 1999 г.).

Известные средства, обладают только функциональным воздействием, а именно улучшают метаболические процессы в структурах нервной системы и повышают ее устойчивость к патогенным воздействиям.

Необходимо отметить, что средства, обладающие свойством воздействовать на процесс регенерации нейронов, в уровне техники не обнаружены.

В настоящее время продолжает увеличиваться число пациентов с различными заболеваниями головного мозга, травмами, а также последствиями травм центральной нервной системы, поэтому актуальна разработка новых групп препаратов, в том числе биологически активных пептидных соединений, обладающих свойством регенерировать нейроны.

Структурных аналогов, представленных в уровне техники, предлагаемый пептид не имеет.

Настоящим изобретением поставлена и решена задача получения пептида, который обладает биологической активностью, проявляющейся в стимулировании регенерации нейронов и фармацевтической композиции, содержащей этот пептид в качестве активного начала, а также способа ее применения.

Технический результат изобретения заключается в создании пептида, стимулирующего регенерацию нейронов, а также фармацевтической композиции, содержащей этот пептид в качестве активного начала, использование которой стимулирует регенерацию нейронов за счет восстановления синтеза тканеспецифических белков, антиоксидантного действия, нормализации метаболизма и биоэлектрической активности нейронов.

Для решения поставленной задачи и достижения указанного технического результата предложена группа изобретений, объединенных общим изобретательским замыслом.

Одним из объектов предложенной группы изобретений является фармацевтическая композиция, стимулирующая регенерацию нейронов, содержащая в качестве активного начала эффективное количество пептида глутамил-аспартил-аргинин общей формулы: H-Glu-Asp-Arg-OH последовательности 1 [SEQ ID NO:1] и фармацевтически приемлемый носитель.

При этом фармацевтическая композиция находится в форме, подходящей для парентерального введения.

Другой аспект настоящего изобретения касается пептида глутамил-аспартил-аргинин общей формулы: H-Glu-Asp-Arg-OH последовательности 1 [SEQ ID NO:1].

Обнаружено, что пептид глутамил-аспартил-аргинин общей формулы: H-Glu-Asp-Arg-OH последовательности 1 [SEQ ID NO:1] обладает способностью стимулировать регенерацию нейронов. Предлагается применение пептида глутамил-аспартил-аргинин общей формулы: H-Glu-Asp-Arg-OH последовательности 1 [SEQ ID NO:1] для приготовления лекарственного средства, стимулирующего регенерацию нейронов.

Следующий аспект настоящего изобретения касается способа стимулирования регенерации нейронов, заключающегося во введении пациенту фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного начала пептид глутамил-аспартил-аргинин общей формулы: H-Glu-Asp-Arg-OH последовательности 1 [SEQ ID NO:1] в дозе 0,01-100 мкг/кг массы тела, по крайней мере, один раз в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта.

При этом введение осуществляют парентерально.

Пептид глутамил-аспартил-аргинин общей формулы: H-Glu-Asp-Arg-OH получают классическим методом пептидного синтеза в растворе.

Возможность объективного проявления технического результата при использовании изобретения подтверждена достоверными данными, приведенными в примерах, содержащих сведения экспериментального характера, полученные в процессе проведения исследований по методикам, принятым в данной области.

Стимулирующее действие пептида H-Glu-Asp-Arg-OH на регенерацию и интегративные функции нейронов выявлено при его экспериментальном изучении. Изучение биологической активности пептида проводили на эксплантатах коры головного мозга, в экспериментальных моделях травматического повреждения головного и спинного мозга, гипоксии и у больных с отдаленными последствиями черепно-мозговой травмы.

Понятие «фармацевтическая композиция» подразумевает различные лекарственные формы, содержащие пептид H-Glu-Asp-Arg-OH, которые могут найти лечебное применение в медицине в качестве средства, стимулирующего регенерацию нейронов.

Для получения фармацевтических композиций, отвечающих изобретению, эффективное количество пептида H-Glu-Asp-Arg-OH как активное начало смешивают с фармацевтически приемлемым носителем согласно принятым в фармацевтике способам компаундирования.

Понятие "эффективное количество" подразумевает использование такого количества активного начала, которое в соответствии с его количественными показателями активности и токсичности, а также на основании знаний специалиста должно быть эффективным в данной лекарственной форме.

Носитель может иметь различные формы, которые зависят от лекарственной формы препарата, желаемой для введения в организм.

Для парентерального введения носитель обычно включает физиологический раствор или стерильную воду, хотя могут быть включены другие ингредиенты, способствующие стабильности или для сохранения стерильности.

Сущность изобретения поясняется фигурой и таблицами.

В Таблице 1 представлено влияние пептида H-Glu-Asp-Arg-OH на морфологические и биохимические показатели периферической крови морских свинок при изучении токсичности.

На чертеже показано влияние пептида H-Glu-Asp-Arg-OH на развитие эксплантатов коры головного мозга.

В Таблице 2 представлено влияние пептида H-Glu-Asp-Arg-OH на процессы перекисного окисления липидов и пероксидации белков в коре головного мозга крыс при гипоксии.

В Таблице 3 представлено влияние пептида H-Glu-Asp-Arg-OH на продолжительность жизни изолированных нейронов речного рака.

В Таблице 4 представлено влияние пептида H-Glu-Asp-Arg-OH на показатели выполнения больными корректурной пробы.

В Таблице 5 представлено влияние пептида H-Glu-Asp-Arg-OH на изменение у больных альфа-индекса ЭЭГ.

Изобретение иллюстрируется примером синтеза пептида глутамил-аспартил-аргинин общей формулы: H-Glu-Asp-Arg-OH (пример 1), примерами изучения токсичности и испытания биологической активности пептида (примеры 2, 3, 4, 5, 6 и 7), а также примером результатов клинического применения пептида, демонстрирующим его фармакологические свойства и подтверждающим возможность достижения лечебного эффекта (пример 8).

Пример 1. Синтез пептида H-Glu-Asp-Arg-OH

1. Название соединения: глутамил-аспартил-аргинин.

2. Структурная формула:

3. Брутто-формула без противоиона: C₁₅H₂₆N₆О₈.

4. Молекулярный вес без противоиона: 418,40.

5. Противоион: ацетат.

6. Внешний вид: белый аморфный порошок без запаха.

7. Способ синтеза: пептид получен классическим методом синтеза в растворе по схеме:

ВОС - трет.бутилоксикарбонильная группа,

OSu - N-оксисукцинимидный эфир,

DCC - N,N'-дициклогексилкарбодиимид,

OBzl - бензиловый эфир,

TFA - трифторуксусная кислота,

HOBt - N-оксибензотриазол,

Z - бензилоксикарбонильная группа.

6. Характеристики готового препарата:

- содержание основного вещества: 98,01% (по ВЭЖХ, 220 нм),

- ТСХ - индивидуален, R_f=0,65 (ацетонитрил-вода 1:3),

- содержание влаги: 6%,

- рН 0,01% раствора: 4,88,

- Удельное оптическое вращение: [α]_D ²²:-33° (с=1, Н₂О), "Polamat A", Carl Zeiss Jena.

Пример синтеза:

1) BOC-Glu(OBzl)-OSu, N-оксисукцинимидный эфир N-трет.бутилоксикарбонил-(γ-бензил)глутаминовой кислоты (I).

N-трет.бутилоксикарбонил-(γ-бензил)глутаминовую кислоту BOC-Glu(OBzl)-OH (33,7 г, 0,1 моль) растворяли в 50 мл N,N'-диметилформамида, охлаждали до температуры -10°С, добавляли при перемешивании охлажденные (4-6°С) растворы N,N'-дициклогексилкарбодиимида (23,0 г, 0,11 моль) в 30 мл N,N'-диметилформамида и N-гидроксисукцинимида (13,0 г, 0,11 моль) в 20 мл N,N'-диметилформамида. Реакционную смесь перемешивали в течение 12 ч при охлаждении льдом и далее в течение 1 суток при комнатной температуре. Выпавшую N,N'-дициклогексилмочевину отфильтровывали и полученный раствор активированного эфира использовали без выделения на следующей стадии.

2) BOC-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-OH, N-трет.бутилоксикарбонил-(γ-бензил)глутамил-(β-бензил)аспартат (II).

(β-Бензил)аспарагиновую кислоту H-Asp(OBzl)-OH (28,0 г, 0,12 моль) и 36 мл (0,12 моль) триэтиламина суспендировали в 50 мл N,N'-диметилформамида и перемешивали в течение 1 ч. Затем добавили порциями раствор активированного эфира BOC-Glu(OBzl)-OSu (I), полученный на предыдущей стадии. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 суток. Затем подкисляли 0,5 н. серной кислотой до рН 2-3 и экстрагировали этилацетатом 4×50 мл. Вытяжки объединяли и последовательно промывали 0,5 н. H₂SO₄ 3×50 мл, водой 2×50 мл, 5% раствором NaHCO₃ 2×50 мл, водой 2×50 мл, насыщенным раствором NaCl 2×50 мл. Органический слой сушили над Na₂SO₄, упаривали растворитель в вакууме, остаток кристаллизовали под гексаном. Получено 50 г продукта (92%). R_f=0,34 (бензол-ацетон 2:1).

3) BOC-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Arg-OH (III), N-трет.бутилоксикарбонил-(γ-бензил)глутамил-(β-бензил)аспартиларгинин (III).

2,4 г (10 ммоль) гидрохлорида аргинина HCl H-Arg-OH суспендировали в 10 мл диметилформамида и перемешивали в течение 24 ч. Отдельно 2,4 г (4,4 ммоль) защищенного пептида (II) и 0,8 г (6 ммоль) оксибензотриазола растворяли в 10 мл диметилформамида и охлаждали до температуры -10°С. Затем добавляли охлажденный до этой же температуры раствор 1,25 г (6 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 5 мл диметилформамида. Активированный эфир получали в течение 20 мин, далее к полученному реагенту прибавляли суспензию аргинина и перемешивали в течение 2 суток при комнатной температуре. Выпавшую дициклогексилмочевину отфильтровывали, фильтрат подкисляли 0,5 н. серной кислотой до рН 3. Экстрагировали 3×20 мл н-бутиловым спиртом, насыщенным водой. Объединенные вытяжки промывали водой и органический растворитель упаривали в вакууме. Остаток кристаллизовали под эфиром. Перекристаллизация из изопропилового спирта, сушили в вакууме над КОН. Получено 800 мг продукта (26%). R_f=0,87 (н-бутанол-вода-уксусная к-та 4:1:1).

4) H-Glu-Asp-Arg-OH (IV), глутамил-аспартил-аргинин.

Защищенный трипептид BOC-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Arg-OH (III) (0,80 г) растворяли в смеси метиловый спирт - вода (4:1) и гидрировали над катализатором Pd/C (5%) в течение 4 ч. Катализатор отфильтровывали, растворитель упаривали в вакууме, остаток сушили в вакууме над КОН и P₂O₅. Далее продукт растворяли в 2 мл смеси хлористый метилен-трифторуксусная кислота (5:1) и выдерживали при комнатной температуре в течение 2 ч. Полноту прохождения реакции деблокирования контролировали по ТСХ в системе ацетонитрил-вода (1:3). Растворитель упаривали в вакууме, остаток сушили в вакууме над КОН.

Для очистки 300 мг препарата растворяли в 4 мл 0,01% трифторуксусной кислоты и подвергали высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке с обращенной фазой 50×250 мм Diasorb-130-C16T, 7mkm. Хроматограф Beckman System Gold, 126 Solvent Module, 168 Diode Array Detector Module. Условия хроматографирования: А: 0,1% TFA; В: MeCN/0,1% TFA, градиент В 0 → 50% за 100 мин. Объем пробы 5 мл, детекция при 215 нм, сканирование 190-600 нм, скорость потока 10 мл/мин. Отбирали фракцию 37,0-42,0 мин. Растворитель упаривали в вакууме при температуре не выше 40°С, упаривание многократно (5 раз) повторяли с 10 мл 10% раствора уксусной кислоты. Окончательно остаток растворяли в 20 мл деионизованной воды и лиофилизовывали.

Получено 120 мг очищенного препарата в виде аморфного белого порошка без запаха.

5) Анализ готового препарата.

- Содержание основного вещества определяли методом ВЭЖХ на колонке Phenomenex С 18 LUNA 4,6×150 mm. A: 0,1% TFA, В: MeCN; grad.B 0-100% in 10 min. Скорость потока 1 мл/ мин. Детекция при 220 нм, сканирование 190-600 нм, проба 20μl. Содержание основного вещества 98,01%.

- ТСХ: индивидуален, R_f=0,65 (ацетонитрил-вода 1:3, пластинки ПТСХ-П-В-УФ Sorbfil, силикагель СТХ-1ВЭ 8-12 мкм, проявление хлор/бензидин).

- Содержание влаги: 6% (гравиметрически по потере массы при сушке 20 мг при 100°С).

- рН 0,01% раствора: 4,88 (потенциометрически).

- Удельное оптическое вращение: [α]_D ²²:-33° (с=1, H₂O), "Polamat A", Carl Zeiss Jena.

Пример 2. Изучение токсичности пептида H-Glu-Asp-Arg-OH

Общетоксическое действие пептида H-Glu-Asp-Arg-OH исследовали в соответствии с требованиями «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2000): острой токсичности при однократном введении препарата, а также подострой и хронической токсичности при длительном введении пептида.

Исследование по изучению острой токсичности проведено на 72 белых беспородных мышах-самцах с массой тела 20-22 г. Животные были рандомизированно разделены на 6 равных групп. Препарат вводили животным однократно внутримышечно в дозах 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг в 0,25 мл стерильного 0,9% раствора Nad. Животным контрольной группы в том же объеме вводили 0,9% раствор NaCl.

Исследования по изучению подострой токсичности проведено на 65 белых беспородных крысах-самцах с массой тела 160-210 г. Ежедневно однократно животным подопытных групп вводили препарат внутримышечно в течение 90 дней в дозах 1 мкг/кг, 0,1 мг/кг, 1 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,9% раствора NaCl. Животным контрольной группы вводили в том же объеме стерильный 0,9% раствор NaCl. До введения препарата, на 30, 60 и 90 сутки после начала введения препарата у животных исследовали морфологический состав и свойства периферической крови. При завершении эксперимента исследовали биохимические и коагулологические показатели крови.

Исследования по изучению хронической токсичности проводили в течении 6 месяцев, исходя из длительности рекомендуемого клинического назначения препарата, на 84 морских свинках-самцах массой 270-310 г. Животные подопытных групп получали ежедневно однократно внутримышечно пептид в течение 6 мес. в дозах 1 мкг/кг, 0,1 мг/кг, 1 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,9% раствора NaCl. В контрольной группе животным вводили по аналогичной схеме стерильный 0,9% раствор NaCl в том же объеме. У животных в периферической крови общепринятыми методами определяли количество эритроцитов, гемоглобина, ретикулоцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, лейкоцитарную формулу, скорость оседания эритроцитов (СОЭ), резистентность эритроцитов. Наряду с этим определяли содержание в сыворотке крови общего белка по методу Лоури, калия и натрия методом плазменной спектрофотометрии. После завершения эксперимента проводили патоморфологическое исследование головного и спинного мозга, спинномозговых ганглиев, щитовидной железы, паращитовидных желез, надпочечников, семенников, гипофиза, сердца, легких, аорты, печени, почки, мочевого пузыря, поджелудочной железы, желудка, тонкой кишки, толстой кишки, тимуса, селезенки, лимфатических узлов, костного мозга.

При изучении острой токсичности установлено, что однократное введение исследуемого пептида животным в дозе, превышающей терапевтическую, рекомендованную для клинического применения, более чем в 5000 раз, не вызывает токсических реакций, что свидетельствует о большой терапевтической широте препарата.

Изучение подострой и хронической токсичности пептида свидетельствует об отсутствии побочных эффектов при длительном применении препарата в дозах, превышающих терапевтическую в 100-1000 раз. При исследовании влияния пептида на морфологический состав и биохимические показатели периферической крови морских свинок через 3 и 6 месяцев после начала введения препарата достоверного изменения показателей не выявлено (Таблица 1).

При оценке общего состояния животных, морфологических и биохимических показателей периферической крови, морфологического состояния внутренних органов, состояния сердечно-сосудистой и дыхательной систем, функции печени и почек патологические изменения в организме не обнаружены.

Отсутствие общетоксического действия позволяет рекомендовать фармацевтическую композицию, содержащую в качестве активного начала пептид Н-Glu-Asp-Arg-OH, для проведения клинических испытаний.

Пример 3. Влияние пептида H-Glu-Asp-Arg-OH на развитие эксплантатов коры головного мозга

Эксперименты проведены на 32 фрагментах коры головного мозга крыс линии «Wistar», массой тела 150-200 г. Питательная среда для культивирования эксплантатов состояла из 35% раствора Игла, 25% фетальной сыворотки теленка, 35% раствора Хенкса, 5% куриного эмбрионального экстракта, в среду добавляли глюкозу (0,6%), инсулин (0,5 ед./мл), пенициллин (100 ед./мл), глютамин (2мМ). Фрагменты коры головного мозга помещали в эту среду и культивировали в чашках Петри в термостате при температуре 36,7 С в течение 2 суток. В экспериментальную среду добавляли пептид H-Glu-Asp-Arg-OH до конечных концентраций 1, 10 и 100 нг/мл.

Критерием биологической активности служил индекс площади (ИП) - соотношение площади всего эксплантата вместе с зоной роста к исходящей площади фрагмента коры головного мозга. Достоверность различия сравниваемых средних значений ИП оценивали с помощью t-критерия Стъюдента. Значения ИП выражали в процентах, контрольное значение ИП принималось за 100%.

Зону роста контрольных эксплантатов коры составляли короткие нейриты, а также выселяющиеся клетки глии и фибробластоподобные клетки.

На чертеже показано влияние пептида H-Glu-Asp-Arg-OH на развитие эксплантатов коры головного мозга.

Установлено, что через 1 сутки культивирования происходило распластывание эксплантатов на коллагеновой подложке и начиналось выселение пролиферирующих и мигрирующих клеток по периферии эксплантата. На 3-и сутки культивирования при концентрации пептида H-Glu-Asp-Arg-OH 10 нг/мл наблюдалось достоверное повышение ИП эксплантатов на 37% по сравнению с контрольными значениями ИП. При исследовании эксплантатов коры на более длительных сроках культивирования - 7 дней - выявились те же эффекты нейрит-стимулирующего действия, в тех же концентрациях. Иногда наблюдалось статистически не достоверное уменьшение ИП эксплантатов, видимо, за счет ретракции нервных волокон при увеличении сроков культивирования.

Полученные результаты свидетельствуют о нейритстимулирующем действии пептида H-Glu-Asp-Arg-OH.

Пример 4. Влияние пептида H-Glu-Asp-Arg-OH на репаративные процессы в головном мозге крыс после черепно-мозговой травмы

Влияние пептида H-Glu-Asp-Arg-OH на репаративные процессы в головном мозге оценивали в модели острой тяжелой черепно-мозговой травмы. Динамику восстановления функций центральной нервной системы определяли путем тестирования координации движений и мышечного тонуса животных, а также их способности к обучению и воспроизведения условно-рефлекторного навыка.

У 24 белых беспородных крыс вызывали тяжелую компрессионную черепно-мозговую травму падающим свинцовым грузом. Через 1, 12, 48 и 96 часов 15 животным подопытной группы вводили внутримышечно пептид H-Glu-Asp-Arg-OH в дозе 10 мкг/кг в 0,5 мл стерильного физиологического 0,9% раствора NaCl. Животным контрольной группы по аналогичной схеме вводили стерильный физиологический раствор в том же объеме.

Оценку способности крыс к обучению и воспроизведению навыков проводили с помощью теста условного рефлекса активного избегания (УРАИ). Для оценки мышечного тонуса и координации движений крыс вращали на стержне с возрастающей скоростью и измеряли время удерживания.

Через 48 часов после травмы все выжившие животные не были способны к обучению. Через 96 часов после травмы в группе крыс, получавших пептид H-Glu-Asp-Arg-OH, способных к обучению животных было в 2 раза больше, чем в контрольной группе. Через 30 суток показатели обучаемости у крыс, которым вводили пептид H-Glu-Asp-Arg-OH, были также выше, чем в контроле.

Тяжелая черепно-мозговая травма вызывала у животных выраженный астеноневротический синдром, снижение координации и мышечного тонуса. Исследование по методу "вращающегося стержня" показало, что пептид H-Glu-Asp-Arg-OH способствовал восстановлению координации движений и мышечного тонуса через 48 часов после травмы (время удерживания на стержне было более чем в 2 раза выше, чем в контрольной группе).

Таким образом, применение исследуемого пептида H-Glu-Asp-Arg-OH приводило к значительному улучшению способности животных к обучению и воспроизведению условно-рефлекторного навыка, а также к нормализации мышечного тонуса и координации движений.

Свойство пептида H-Glu-Asp-Arg-OH, проявляющееся в стимулировании регенерации нейронов, отмечалось уже на 5 сутки после травмы, а к 14 суткам показатели обучаемости животных были близки к нормальным величинам.

При острой тяжелой черепно-мозговой травме происходит повреждение и гибель популяций нейронов серого вещества головного мозга. Ускоренное восстановление функций центральной нервной системы в раннем посттравматическом периоде под действием пептида H-Glu-Asp-Arg-OH свидетельствует о том, что пептид вызывает стимуляцию репаративных процессов в головном мозге.

Пример 5. Влияние H-Glu-Asp-Arg-OH на морфологические изменения в центральной нервной системе крыс при травме спинного мозга

Исследование проведено на взрослых крысах «Wistar» обоего пола, с массой тела 180-200 г. У животных подопытной группы, состоящей из 27 крыс, была воспроизведена модель травмы спинного мозга.

Животным наносилась травма в поясничном отделе спинного мозга по следующей методике. Анестезированной крысе на уровне последнего ребра через кожные покровы проводилось кратковременное сжатие боковых поверхностей позвонков корнцангом с силой на рабочих браншах 15 кг. Через 24 ч после нанесения травмы среди выживших крыс выделялось 2 группы.

Животным первой группы вводили внутримышечно ежедневно однократно пептид H-Glu-Asp-Arg-OH в дозе 10 мкг/кг в 0,5 мл стерильного физиологического 0,9% раствора NaCl в течение 10 дней, крысам второй (контрольной) группы по такой же схеме вводили стерильный физиологический раствор в том же объеме.

Животным обеих групп на 30 сутки проводились нейрогистологические исследования. Для исследования были взяты спинномозговые ганглии на уровне и выше уровня поражения, поясничные и шейные сегменты спинного мозга, участки моторной коры и пирамидных путей головного мозга. Нейрогистологическое исследование проводилось методами электронной и световой микроскопии.

Материал, взятый для изучения с помощью световой микроскопии, фиксировали в 96% спирте и 10% формалине, затем заливали в целлоидин с последующей окраской гематоксилин-эозином, а также методами Ниссля, Ван-Гизон, Вейгерта, Шпильмейера. Фиксацию и резку производили в соответствии с условиями применявшихся методов гистологической обработки и окраски материала.

Материал для электронно-микроскопических исследований фиксировали 2% осмиевой кислотой с какодилатным буфером, заливали в эпон-812 и контрастировали в азотнокислом свинце по Рейнольдсу. Предварительную оценку материала проводили на полутонких срезах. Ультратонкие срезы изучали на электронном микроскопе УЕМ-100СХ.

У всех крыс с травмой спинного мозга обнаруживались патоморфологические изменения нейронов в очаге поражения. Степень выраженности этих изменений была различной. У части нейронов определялась картина аксональной реакции. При этом клетки набухали, контуры их сглаживались. Нисслевские глыбки выглядели измельченными вплоть до пылевидных, с бледным прокрашиванием основными красителями. Определялось просветление кариоплазмы, ядро было сдвинуто к периферии. Значительная часть нейронов находилась в состоянии сморщивания. При этом клетки приобретали удлиненно-суженную форму с резкими угловатыми очертаниями. Глыбки хроматина, как и ядро, интенсивно прокрашивались. Были едва заметны ядрышки. Часть нервных клеток находилась в состоянии ишемических изменений. В них определялось значительное обеднение цитоплазмы тигроидным веществом, гиперхроматическое, слегка уменьшенное ядро, распавшееся в некоторых клетках на отдельные глыбки. Иногда по периферии нейрона, возле тела и отростков обнаруживались частицы в виде интенсивно окрашенных мелких зерен (перицеллюлярная инкрустация сетей Гольджи). В большинстве случаев обнаруживались нейроны в состоянии отечных изменений. Нисслевское вещество в них просматривалось в виде узкого ободка по периферии цитоплазмы. Контуры тел клеток выглядели размытыми. Вокруг ядра определялись участки расплавления цитоплазмы в виде светлых ободков. Отдельные нейроны находились в состоянии тяжелых изменений. Тела клеток выглядели набухшими с неравномерным хроматолизом. Отростки нейронов прокрашивались на большом протяжении. Некоторые клетки были как бы «изъедены». В них выявлялись неокрашенные участки в виде вакуолей неравномерной величины и неправильной формы. Реже в нейронах обнаруживались гипертрофированные глиальные элементы, что свидетельствовало о явлениях нейронофагии. Для данного типа изменений было характерно поражение ядра, которое уменьшалось в размерах, с резким гиперхроматозом, из-за которого практически не удавалось различить ядрышки. Обнаруживались изменения нейронов по типу острого набухания. При этом тела клеток выглядели набухшими. Определялось увеличение ядер с диффузным их прокрашиванием. В цитоплазме отмечалась мелкая зернистость, гомогенно окрашенная в светло-синий цвет. В отдельных зонах очага поражения определялась картина тяжелого деструктивного процесса, что выражалось в разреженности клеточных элементов, наличии очажков выпадения нервных клеток, особенно в передних рогах спинного мозга, где достаточно часто обнаруживались мелкие полости. В некоторых местах исчезновения нейронов отмечалось разрастание глиальной ткани. В большей степени сохранялись нервные клетки задних рогов спинного мозга. В вентральной части задних и в переднебоковых столбах спинного мозга наблюдались признаки диффузной демиелинизации нервных волокон, встречались очаги спонгиозности в виде отека белого вещества.

Описанная морфологическая картина наблюдалась у крыс обеих экспериментальных групп. Однако у животных контрольной группы значительно чаще встречались «тяжелые» и ишемические изменения нейронов в отличие от крыс, получавших инъекции пептида H-Glu-Asp-Arg-OH, в спинном мозге которых в основном обнаруживались клетки в состоянии «первичного раздражения».

У всех животных наблюдалась активная пролиферативная реакция астроцитарной глии, особенно фиброзных астроцитов. Клетки были деформированы, с пикноморфными ядрами и гомогенизированной цитоплазмой, лишенной отростков. У животных подопытной группы отмечалась более активная гиперплазия олигодендроглии. Среди ее клеток имелось множество отечных форм. Элементы микроглии находились в стадии умеренной пролиферации с явлениями фрагментации глиальных отростков.

В вышележащих отделах спинного мозга, в головном мозге животных контрольной группы выявлялись клеточные изменения по типу аксональной дегенерации.

При электронно-микроскопическом исследовании у крыс с травмой спинного мозга наблюдались выраженные изменения нейронов, их отростков, глиальных элементов и сосудов. В цитоплазме нейронов определялось уменьшение числа канальцев эндоплазматической сети, набухание цистерн аппарата Гольджи, большое количество окаймленных пузырьков, мелких и крупных лизосом. Характерным было наличие темных митохондрий с плотным матриксом, в котором не различались кристы. По периферии тел нервных клеток наблюдались крупные темные липиды с полосатой исчерченностью и значительных размеров вакуоли, представляющие собой мультивезикулярные тельца, образованные, вероятно, из набухших, потерявших рибосомы канальцев гранулярной эндоплазматической сети. В ядрах некоторых нейронов определялась дезинтеграция хроматина, который образовывал скопления причудливой формы, расположенные у плотной ядерной мембраны. У крыс, получавших пептид H-Glu-Asp-Arg-OH, в цитоплазме нейрональных клеток отмечались признаки восстановления. Наблюдалось появление большого количества свободных рибосом и полирибосом, коротких профилей цистерн гранулярной эндоплазматической сети. Определялось увеличение числа мелких цистерн аппарата Гольджи с отсутствием в нем признаков набухания. По периферии клеток встречались лишь единичные прозрачные вакуоли и темные тельца.

У всех животных обнаруживались значительные изменения миелиновых волокон. Так, выявлялось расщепление миелина, его искривление, сжатие внутренних осевых цилиндров и появление вследствие этого светлых пространств большого размера. У крыс опытной группы структура миелина части волокон восстанавливала свою гомогенность.

Обнаруживаемые изменения в синапсах проявлялись в филаментозной дегенерации постсинаптических образований. У крыс подопытной группы значительно чаще наблюдались синапсы обычной структуры (дендро-дендритические).

В вышележащих отделах у животных экспериментальных групп обнаруживались сходные изменения нервных клеток и их отростков. В нейронах определялись признаки функционального напряжения. В цитоплазме клеток отмечалось значительное количество лизосом, у части митохондрий не обнаруживались кристы. Наблюдалось умеренное набухание аппарата Гольджи. Выявлялось уплотнение кариоплазмы вследствие слишком компактного расположения хроматина в ядрах клеток. В нервных волокнах обнаруживалось умеренно выраженное расслоение миелина, сжатие осевых цилиндров.

У крыс после применения пептида H-Glu-Asp-Arg-OH описанные изменения проявлялись в меньшей степени. Кариоплазма имела обычный вид, более упорядочены были цистерны аппарата Гольджи. Канальцы эндоплазматической сети образовывали крупные вакуоли, содержащие остатки отработанных органоидов, для их утилизации. Однако в цитоплазме клеток по-прежнему обнаруживалось избыточное количество лизосом, определялись набухшие митохондрии с беспорядочно расположенными кристами. Миелиновые волокна гораздо чаще имели нормальный вид.

Таким образом, применение пептида H-Glu-Asp-Arg-OH животным с травмой спинного мозга оказывало стимулирующее действие на регенерацию нейронов спинного мозга.

Пример 6. Влияние пептида H-Glu-Asp-Arg-OH на интенсивность реакций свободнорадикального окисления в коре головного мозга крыс при гипоксии

Исследование проведено на 18 белых беспородных крысах. Пептид H-Glu-Asp-Arg-OH вводили животным внутрибрюшинно в дозе 1 мкг в 1,0 мл стерильного физиологического 0,9% раствора NaCl однократно ежедневно в течение 10 дней. Через 24 часа после окончания введения пептида животные подвергались воздействию гипоксической гипоксии. Гипоксию вызывали в барокамере проточно-вытяжного типа при атмосферном давлении в барокамере 0,029 МПа, что соответствует подъему на высоту 9000 м над уровнем моря. Скорость компрессии и декомпрессии составляла 0,005 Мпа в минуту. В барокамеру помещали поглотитель углекислоты и влаги. Животные находились в барокамере в условиях свободного поведения под постоянным наблюдением в течение 3 часов.

Об интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ) судили по уровню содержания начальных продуктов ПОЛ - диеновых конъюгатов и конечных продуктов - оснований Шиффа, играющих существенную роль в повреждении нейронов. Уровень пероксидации белков оценивали по содержанию карбонилпроизводных аминокислот в белках после взаимодействия с 2,4-динитрофенилгидразином.

Установлено, что пептид H-Glu-Asp-Arg-OH подавлял образование продуктов ПОЛ в коре головного мозга. Под влиянием пептида статистически достоверно снижалось содержание диеновых конъюгатов и наблюдалась тенденция к снижению оснований Шиффа. Применение пептида также ингибировало наряду с ПОЛ и пероксидацию белков (Таблица 2).

Полученные данные свидетельствуют о том, что применение пептида H-Glu-Asp-Arg-OH у животных при воздействии гипоксии подавляет образование продуктов перекисного окисления липидов и пероксидации белков в коре головного мозга.

Пример 7. Влияние пептида H-Glu-Asp-Arg-OH на продолжительность жизни изолированных нейронов речного рака Astacus leptodactilus

Для изучения in vitro влияния пептида H-Glu-Asp-Arg-OH на продолжительность жизни изолированных нейронов речного рака Astacus leptodactilus последние выделяли путем аксотомии, поскольку принято считать, что такое выделение является моделью гибели клеток путем апоптоза.

Нейроны рецептора растяжения речного рака по своим электрофизиологическим, биологическим и структурным свойствам очень близки к центральным нейронам позвоночных. Они генерируют спайки с почти постоянной скоростью в течение 10-15 часов. Два симметричных нейрона (контроль и опыт), изолированных из абдоминального сегмента, помещали в камеры объемом 2 мл, наполненные раствором Harreveld's. Потенциалы действия нейронов регистрировались экстраклеточно с аксонов присасывающимися стеклянными пипеточными электродами, усиливались и записывались с помощью самописца Н-338. Одновременно с помощью двухканального аналогового частотомера и самописцев Н-339 регистрировалась частота потенциалов действия. В начале эксперимента частота импульсации экспериментальных и контрольных нейронов была установлена на отметке 10-15 Гц путем натяжения мышцы. После 1 часа стабильной генерации спайков с постоянной скоростью в экспериментальную емкость добавляли пептид H-Glu-Asp-Arg-OH в концентрации 10 мкг/мл. Активность нейронов непрерывно записывалась до спонтанного прекращения генерации спайков. Время жизни нейронов сравнивалось в каждой паре. Всего использовали 10 пар нейронов. При спонтанном прекращении импульсации изолированного нейрона после 8-10 часов сравнительно стабильной работы с заданной частотой появлялись сначала небольшие флуктуации частоты длительностью несколько секунд, потом появлялись более медленные ритмы с периодом в несколько минут. Средняя частота потенциалов действия снижалась, затем начиналось выпадение отдельных импульсов, импульсация приобретала хаотический характер и быстро затухала. Установлено, что пептид H-Glu-Asp-Arg-OH удлинял продолжительность жизни изолированных нейронов на 15%, в среднем с 11,9 до 13,7 часов (Таблица 3). Замедление гибели нейронов под воздействием пептида H-Glu-Asp-Arg-OH свидетельствует о нейропротекторном эффекте пептида, связанном с его влиянием на электрофизиологические мембранные процессы и внутриклеточный метаболизм в нейронах.

Пример 8. Эффективность применения пептида H-Glu-Asp-Arg-OH у больных с отдаленными последствиями черепно-мозговой травмы

Исследование проведено с участием 25 больных в возрасте 31-60 лет с последствиями черепно-мозговой травмы, разделенных на 2 группы методом рандомизации. Давность перенесенных больными черепно-мозговых травм составляла от 1 до 10 лет. Больных основной группы разделили на 3 подгруппы по степени выраженности последствий черепно-мозговой травмы. Больным основной группы с наиболее выраженными последствиями черепно-мозговой травмы вводили фармацевтическую композицию, содержащую пептид H-Glu-Asp-Arg-OH, ежедневно однократно внутримышечно в дозе 5,0 мг в 1 мл стерильного физиологического 0,9% раствора NaCl в течение 10 дней. Больным основной группы с последствиями черепно-мозговой травмы средней степени тяжести вводили фармацевтическую композицию, содержащую пептид H-Glu-Asp-Arg-OH, ежедневно однократно внутримышечно в дозе 10,0 мкг в 1 мл стерильного физиологического 0,9% раствора NaCl в течение 10 дней. Больным основной группы с отдаленными последствиями черепно-мозговой травмы легкой степени тяжести вводили фармацевтическую композицию, содержащую пептид H-Glu-Asp-Arg-OH, ежедневно однократно внутримышечно в дозе 1,0 мкг в 1 мл стерильного физиологического 0,9% раствора NaCl в течение 10 дней. Больным контрольной группы по аналогичной схеме вводили в том же объеме стерильный физиологический 0,9% раствор NaCl. После применения фармацевтической композиции, содержащей пептид H-Glu-Asp-Arg-OH, у больных хороший клинический результат наблюдался в 59,4% случаев, удовлетворительный - в 31,9%, отсутствие положительного эффекта - 8,7%. Отрицательного влияния фармацевтической композиции, содержащей пептид H-Glu-Asp-Arg-OH, на состояние больных не отмечено. Больные отмечали улучшение памяти, уменьшение интенсивности и длительности головных болей, появление эмоциональной уравновешенности, чувства отдыха после ночного сна. Оценка влияния фармацевтической композиции, содержащей пептид H-Glu-Asp-Arg-OH, на интегральную функцию головного мозга - внимание и на биоэлектрическую активность головного мозга исследовались с помощью корректурной пробы и электроэнцефалографии. У больных основных групп после лечения с применением фармацевтической композиции, содержащей пептид H-Glu-Asp-Arg-OH в разных дозировках, достоверно возросло количество просмотренных знаков и уменьшилось количество ошибок при выполнении корректурной пробы (Таблица 4). В группах больных, получавших лечение с применением фармацевтической композиции, содержащей пептид H-Glu-Asp-Arg-OH в разных дозировках, получены лучшие результаты при анализе динамики выполнения корректурной пробы до и после лечения по сравнению с контрольной группой. Это выражалось в отсутствии резких колебаний в количестве просмотренных знаков за равные отрезки времени, наличии периода "врабатываемости" к середине выполнения задания и постепенном снижении кривой к концу задания, что свидетельствует о большей устойчивости внимания у больных основных групп. Для оценки влияния фармацевтической композиции, содержащей пептид H-Glu-Asp-Arg-OH, на биоэлектрическую активность головного мозга проводился расчет альфа-индекса до и после лечения. Наиболее выраженные изменения биоэлектрической активности головного мозга наблюдались у больных основных групп после лечения с применением фармацевтической композиции, содержащей пептид Н-Glu-Asp-Arg-OH: у них под влиянием лечения произошло достоверное увеличение альфа-индекса (Таблица 5). Таким образом, результаты проведенного исследования свидетельствуют о воздействии фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного начала эффективное количество пептида H-Glu-Asp-Arg-OH, на интегративную функцию клеток головного мозга у больных после перенесенной черепно-мозговой травмы за счет стимуляции регенерации нейронов.

Таблица 1Пептид, стимулирующий регенерацию нейронов центральной нервной системы, фармацевтическая композиция на его основе и способ ее примененияПоказательВведение пептида H-Glu-Asp-Arg-OH (1 мкг/кг)3 месяца6 месяцевКонтроль (n=24)Пептид (n=24)Контроль (n=24)Пептид (n=24)Эритроциты, ×10¹²/л5,3±0,65,4±0,45,4±0,35,3±0,6Гемоглобин, г/л14,2±1,414,3±1,614,5±1,314,5±1,7Ретикулоциты, %1,3±0,071,3±0,11,1±0,051,2±0,04Тромбоциты, ×10⁹/л143,7±7,9145,1±7,8144,5±8,6145,2±8,3Лейкоциты, ×10⁹/л9,4±0,510,0±0,59,6±0,59,4±0,8Нейтрофилы палочкоядерные, %0,31±0,040,32±0,050,33±0,040,34±0,07Нейтрофилы сегментоядерные, %45,8±2,146,4±2,146,2±3,544,7±2,7Эозинофилы, %0,69±0,050,71±0,060,72±0,040,68±0,05Базофилы, %0,61 ±0,040,65±0,070,72±0,030,67±0,08Моноциты, %2,5±0,022,4±0,072,6±0,062,4±0,03Лимфоциты, %48,9±2,551,4±2,151,3±2,750,5±1,9СОЭ, мм/ч1,69±0,052,07±0,042,01±0,051,88±0,03Резистентность эритроцитов, % NaCl    - максимальная0,41±0,020,43±0,060,42±0,040,42±0,03- минимальная0,32±0,050,30±0,010,34±0,040,31 ±0,05Общий белок в сыворотке крови, г/л72,9±3,171,4±2,673,1±3,472,6±3,2Натрий в сыворотке крови, ммоль/л153,9±5,7155,2±5,9155,5±6,2153,2±7,4Калий в сыворотке крови, ммоль/л5,1±2,35,1±2,45,2±2,15,3±1,8

Таблица 2Пептид, стимулирующий регенерацию нейронов центральной нервной системы, фармацевтическая композиция на его основе и способ ее примененияПоказательГруппа животныхКонтроль(гипоксия)Пептид H-Glu-Asp-Arg-OH + гипоксияДиеновые конъюгаты (нмоль/г ткани)42,15±2,3528,57±1,84*Основания Шиффа (у.ед./г ткани)317,0±24,7255,4±26,8Уровень пероксидации белков (мкмоль/мг белка)9,69±0,324,68±0,07** - Р<0,01 по сравнению с контролем.Таблица 3Продолжительность жизни изолированных нейронов речного рака (ч)КонтрольПептид H-Glu-Asp-Arg-OH11,9±0,313,7±0,2** - Р<0,05 по сравнению с контролем.

Таблица 4Пептид, стимулирующий регенерацию нейронов центральной нервной системы, фармацевтическая композиция на его основе и способ ее примененияГруппа больныхКоличество просмотренных знаковКоличество ошибокЗдоровые2874,6±93,42,7±0,3Больные до лечения1519,1±141,712,6+1,3Больные после лечения с применением общепринятых средств1967,5+122,4*9,7+1,2*Больные основных групп после лечения с применением пептида H-Glu-Asp-Arg-OH2429,6±105,3*#6,4+1,1*#* - Р<0,05 по сравнению с показателем у больных до лечения;
# - Р<0,05 по сравнению с показателями у больных после лечения с применением общепринятых средств.Таблица 5Группа больныхАльфа-индексЗдоровые52,9±3,2Больные до лечения35,7±1,6Больные после лечения с применением общепринятых средств42,4+2,8*Больные основных групп после лечения с применением пептида H-Glu-Asp-Arg-OH47,9±3,1*#* - Р<0,01 по сравнению с показателями у больных до лечения.
# - Р<0,05 по сравнению с показателями у больных после лечения с применением общепринятых средств.

Группа изобретений относится к лекарственным средствам для лечения заболеваний, травм, а также последствий травм центральной нервной системы и может быть использовано как средство, стимулирующее регенерацию нейронов. Предлагается фармацевтическая композиция, стимулирующая регенерацию нейронов, содержащая в качестве активного начала эффективное количество пептида глутамил-аспартил-аргинин общей формулы: H-Glu-Asp-Arg-OH последовательности 1 [SEQ ID NO:1] и фармацевтически приемлемый носитель. Предлагается пептид глутамил-аспартил-аргинин общей формулы: H-Glu-Asp-Arg-OH последовательности 1 [SEQ ID NO:1], обладающий способностью стимулировать регенерацию нейронов. Предлагается способ стимулирования регенерации нейронов, заключающийся во введении пациенту фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного начала пептид глутамил-аспартил-аргинин общей формулы: H-Glu-Asp-Arg-OH последовательности 1 [SEQ ID NO:1] в дозе 0,01-100 мкг/кг массы тела, по крайней мере, один раз в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта. Изобретение обеспечивает создание пептида, стимулирующего регенерацию нейронов, а также фармацевтической композиции, содержащей этот пептид в качестве активного начала, использование которой стимулирует регенерацию нейронов за счет восстановления синтеза тканеспецифических белков, антиоксидантного действия, нормализации метаболизма и биоэлектрической активности нейронов. 4 н. и 3 з.п. ф-лы, 5 табл., 1 ил.

1. Фармацевтическая композиция, стимулирующая регенерацию нейронов, характеризующаяся тем, что в качестве активного начала содержит эффективное количество пептида глутамил-аспартил-аргинин общей формулы: H-Glu-Asp-Arg-ОН последовательности 1 [SEQ ID NO:1] и фармацевтически приемлемый носитель.2. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что она находится в форме, подходящей для парентерального введения.3. Пептид глутамил-аспартил-аргинин общей формулы: H-Glu-Asp-Arg-OH последовательности 1 [SEQ ID NO:1].4. Пептид глутамил-аспартил-аргинин общей формулы: H-Glu-Asp-Arg-OH последовательности 1 [SEQ ID NO:1], обладающий способностью стимулировать регенерацию нейронов.5. Пептид по п.4 для приготовления лекарственного средства, стимулирующего регенерацию нейронов.6. Способ стимулирования регенерации нейронов центральной нервной системы, заключающийся во введении пациенту фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного начала пептид глутамил-аспартил-аргинин общей формулы H-Glu-Asp-Arg-OH последовательности 1 [SEQ ID NO:1] в дозе 0,01-100 мкг/кг массы тела, по крайней мере, один раз в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта.7. Способ по п.6, отличающийся тем, что введение осуществляют внутримышечно.