СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ШТАММОВ Mycobacterium tuberculosis К ФТОРХИНОЛОНАМ ПО ГЕНУ gyr B Российский патент 2012 года по МПК C12Q1/68 C12R1/32 

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, в частности к способу диагностики чувствительности М.tuberculosis (МБТ) к фторхинолонам. Данный способ позволяет обнаружить мутации в гене gyrB, обусловливающие устойчивость МБТ к этим препаратам, путем амплификации соответствующих последовательностей ДНК исследуемого гена МБТ с последующим анализом полученных ампликонов на наличие мутаций после их денатурации и электрофоретического разделения в полиакриламидном геле.

В настоящее время наряду с распространением штаммов МБТ с множественной лекарственной устойчивостью (МБТ-МЛУ) стали регистрировать случаи выделения больными штаммов с так называемой широкой лекарственной устойчивостью (extensively drag resistance - XDR), т.е. МБТ-МЛУ устойчивые к фторхинолонам и одному, двум препаратам из группы аминогликозидов. Таких больных становится все больше (по разным регионам России от 4,9 до 20% от всех выявленных больных с МБТ-МЛУ, В.В.Пунга и соавт., (2009 г.)) и они формируют новый опасный «резервуар» туберкулезной инфекции, устойчивой ко всем основным противотуберкулезным препаратам (ПТП).

Препараты фторхинолонового ряда (офлоксацин, ципрофлоксацин, левофлоксацин и др.) в настоящее время широко используют для лечения туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью в составе резервного ряда ПТП. Наиболее перспективными из них являются фторхинолоны четвертого поколения, а именно моксифлоксацин и гатифлоксацин, которые в исследованиях in vivo и in vitro показали высокую фармококинетическую активность в отношении, в частности ципрофлоксацин-устойчивых штаммов МБТ-МЛУ (Zhao В., Pine R. et al. Fluoroquinolone action against clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis: effects of a C-8 Methoxyl Group on survival in liquid media and in human macrophages // Antimicr. Agents and Chemother. - 1999, - p.661-666).

Эффективность лечения в первую очередь зависит от сроков начала терапии, поэтому быстрое определение лекарственной чувствительности МБТ к этим препаратам является приоритетным для выбора терапии туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью. На сегодняшний день микробиологическое определение лекарственной чувствительности МБТ к фторхинолонам проводят с использованием плотных сред Левенштейна-Йенсена. Время получения результата занимает в среднем 2-3 месяца, кроме того, к новым препаратам, таким как гатифлоксацин и спарфлоксацин, не известны критические концентрации, позволяющие определить устойчивость к ним штаммов МБТ.

Использование жидких питательных сред в современных автоматизированных системах ВАСТЕС MGIT 960 может позволить сократить время получения культуры МБТ до 10-18 дней. Однако в настоящее время для анализа чувствительности МБТ к фторхинолонам зарегистрированных (сертифицированных) культуральных тестов на жидких питательных средах в мире нет.

Технологии на основе молекулярно-генетических методов для определения лекарственной чувствительности МБТ к ПТП значительно сокращают время до двух суток получения результатов, обладая при этом высокой чувствительностью и специфичностью.

Известно, что устойчивость ко всей группе фторхинолонов носит перекрестный характер и развивается посредством появления мутаций (одиночных нуклеотидных замен) в генах-мишенях gyrA (320 п.н) и реже в gyrB (375 п.н), кодирующих бактериальную АТФ-зависимую ДНК-топоизомеразу II типа (ДНК-гиразу), состоящую из одноименных субъединиц (Ginsburg A., Grosset H., Bishai W. Fluoroquinolones, tuberculosis and resistance // The Lancet. - 2003. - v.3. - p.432-442). У 42-85% клинических штаммов устойчивость к данным препаратам связана с мутациями в QRDR области гена gyrA (Yew W. et al. Genotypic and phenotypic resistance of M.tuberculosis to rifampicins and fluoroquinolones // Int J Tuberc Lung Dis - 2002. - v.6. - p.936-937, Sulivan E. et al. Emergence of fluoroquinolone-resistant tuberculosis in New York City. Lancet - 1995. - v.345. - p.1148-1150). Еще примерно у 7% штаммов МБТ устойчивость связана с мутациями в гене gyrB (Wang J et al. Fluoroquinolone resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates: associated genetic mutations and relationship to antimicrobial exposure // J. Antimicr. Chemotherapy. - 2007. - v.59. - p.860-865). В настоящее время описаны следующие нуклеотидные замены в QRDR области гена gyrB R485H, S486F, N538T, N538D, Т539Р, D500A, D500H, D500N, G509A, E540V, E540D (An D. et al. Beijing genotype of M.tuberculosis is significantly associated with high-level fluoroquinolone resistance in Vietnam // Antimicrobial agents and chemotherapy. - 2009. - p.4835-4839). Данные замены встречаются как самостоятельно в gyrB, так и в сочетании с мутациями в gyrA (Groll A et al. Fluoroquinolone resistance in Mycobacterium tuberculosis and mutations in gyrA and gyrB // Antimicr. Agents and Chemother. - 2009. - p.4498-4500). Поэтому, с нашей точки зрения, одновременное выявление мутаций в двух генах gyrA (предыдущее изобретение №2343197 «Способ диагностики чувствительности штаммов Mycobacterium tuberculosis к фторхинолонам») и gyrB может дать дополнительную информацию по исследуемому штамму и повысить корреляцию с микробиологическими результатами анализа лекарственной чувствительности МБТ к данным препаратам.

Для обнаружения бактериальных мутаций существует ряд молекулярных методов, главным этапом которых является накопление исследуемого участка ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). От качества проведения амплификации ДНК (ПЦР) зависит специфичность последующих этапов. Непосредственно для выявления нуклеотидных замен используют следующие методы: аллель-специфическая ПЦР, анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, секвенирование, метод денатурирующего градиентного гель-электрофореза, метод конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов (SSCP) и др. Каждый из перечисленных методов обладает как достоинствами, так и недостатками и в основном их используют для научно-исследовательских целей (Victor Т., Jordan A. Detection of mutation in drug resistance genes of M.tuberculosis by a dot-blot hibridization strategy // Int. J. Tubercle and Lung Disease. - 1999. - v.2. - p.346-349; Ramaswamy S. Musser J. Molecular genetic basis of antimicrobial agent resistance in M.tuberculosis // Tubercle and Lung Disease. - 1998. - v.79. - p.3-29).

Аналогом данного изобретения является способ определения мутаций с помощью метода конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов в генах ДНК МБТ, ответственных за резистентность к фторхинолонам у больных туберкулезом. (Cheng A., Yew W. Multiplex PCR amplimer conformation analysis for rapid detection of gyrA mutations in fluoroquinolone-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates // Antimicrob. Agents a Chemotherapy. - 2004. - v.48. - p.596-601).

Прототипом данного изобретения является ранее предложенный нами комплекс, включающий полимеразную цепную реакцию с дальнейшим анализом ампликонов методом SSCP для определения мутаций в гене gyrA МБТ, ответственный за устойчивость к фторхинолонам (предыдущее изобретение №2343197).

Данный комплекс методов состоит из нескольких этапов:

1. Исследуемую последовательность ДНК изучаемого гена амплифицируют методом ПЦР.

2. ПЦР-продукт подвергают термической денатурации в присутствии дестабилизирующих двойную спираль агентов, например формамида, переносят на лед.

3. Смесь наносят на полиакриламидный гель и разделяют с помощью высоковольтного электофореза. Анализируемые однонитевые ДНК-последовательности, одинаковые по величине, но различающиеся по пространственной организации молекул вследствие замен, имеют различную электрофоретическую подвижность. Полученные электрофоретические профили специфичны для исследуемой последовательности и в случае замены одного нуклеотида в цепи исследуемые участки ДНК расходятся на разное расстояние друг от друга.

4. Степень расхождения денатурированных нитей выявляется с помощью окрашивания геля с помощью красителя азотнокислого серебра или Sybr Green 2.

Таким образом, данный метод является достаточно доступным (метод ПЦР, методику электрофореза применяют сейчас во многих лабораториях), специфичным (работу проводят непосредственно с ДНК микобактерий) и достаточно чувствительным (с помощью метода ПЦР можно выявить ДНК единичных клеток).

Отличия предлагаемого нами способа от предыдущего состоит в следующем. Исследование чувствительности МБТ к фторхинолонам проводят еще по одному гену gyrB, также участвующему в развитии устойчивости к данным препаратам. Для этого подобраны две пары праймеров («внешние» и «внутренние») и программа амплификации для последовательного проведения ПЦР («Нестед»-ПЦР), которая позволяет выявлять МБТ непосредственно из респираторного материала. После проведенного электрофореза на электрофореграмме можно выявить мутации в гене gyrB. Таким образом, в течение двух суток можно определить чувствительность к фторхинолонам по двум генам и тем самым обеспечить вероятность выявления мутаций, ответственных за устойчивость МБТ к этим препаратам, дополнительно еще в 7-10% случаях.

Были разработаны условия для каждого из этапов метода:

1. для синтеза ДНК МБТ гена gyrB из нескольких пар праймеров были выбраны следующие:

«внешние»: F 1 - 5'AGAGTTGGTGCGGCGTAAGA3'

R 1 - 5'AACACATGCCCGTTCTCGAT3'

«внутренние»: F 2 - 5'TAAGAGCGCCACCGACATCG3'

R 2 - 5'GCATGAACCGGAACAACAAC3'

Для оценки специфичности выбранных праймеров проводили сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей с базой данных GenBank с помощью программы BLAST. Было установлено отсутствие перекрестных реакций при использовании этих праймеров с ДНК других видов микроорганизмов и человека.

2. Для проведения ПЦР с «внешними» и «внутренними» праймерами был подобран состав реакционного буфера, где важными составляющими были тип буфера, концентрация трифосфатов, концентрация ионов магния. Для предотвращения контаминации в первую реакционную смесь добавляли урацилгликозилазу.

3. Изменяя параметры температуры отжига праймеров, времени каждого цикла и количество циклов, был подобран единый оптимальный режим амплификации для проведения первой и второй ПЦР, увеличивающий чувствительность метода для выявления ДНК МБТ из респираторного материала больного. Выбранные условия представляют собой следующее: 1-ый этап - 94° - 4 мин; 2-ой этап - 94° - 30 сек, 59° - 40 сек, 72° - 40 сек (25 циклов); 3-ий этап: 72° - 4 мин; 10° - хранение;

4. Для электрофоретического разделения одноцепочечных фрагментов ДНК были подобраны условия денатурации полученных ампликонов (соотношение ампликонов и денатурирующего раствора, время денатурации), состав полиакриламидного геля (процентное содержание полиакриламида, глицерина и состав буфера), условия разделения (напряжение, время электрофореза, температура), позволяющие повысить эффективность разделения одноцепочечных исследуемых ампликонов. Выбранные условия совпадали с условиями проведения электрофоретического разделения ДНК МБТ гена gyrA (предыдущее изобретение №2343197), что значительно упрощало работу по изучению конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов одновременно в двух генах. Выбранные условия представляют собой следующее: для денатурации смешивают 4 мкл образца с 6 мкл денатурирующего раствора и проводят денатурацию при 95° - 10 мин, разделение денатурированных ампликонов проводят в 8% полиакриламидном геле с 5% глицерином, при напряжении 400 вольт в течение 5 часов при температуре 8°С в ТВЕ буфере.

5. Для визуализации результатов электрофореза окраску геля проводили с помощью азотнокислого серебра.

Детекция результатов.

После окраски гель оценивали при белом свете (визуально) без специального оборудования. Окрашенные денатурированные ампликоны представляют собой полоски для каждого образца. Для определения мутаций в гене, наряду с ампликонами исследуемого образца исследовали ампликоны ДНК чувствительных штаммов МБТ. На чертеже представлена фотография электрофоретических профилей образцов ДНК МБТ устойчивым к фторхинолонам - дорожки 3-6, 8, чувствительных штаммов - дорожки 1, 2, 7.

Изобретение относится к биотехнологии. Способ по изобретению включает клонирование исследуемой последовательности в гене gyrB ДНК М.tuberculosis (МБТ) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), с дальнейшей денатурацией ПЦР-продукта в присутствии денатурирующего раствора для получения одноцепочечных фрагментов ДНК. Далее выявляют в них мутации путем разделения данных фрагментов в полиакриламидном геле. Для проведения ПЦР была подобрана пара праймеров: «внешние» F1 - 5'AGAGTTGGTGCGGCGTAAGA3', R1 - 5'AACACATGCCCGTTCTCGAT3' и «внутренние» F2 - 5'TAAGAGCGCCACCGACATCG3', R2 - 5'GCATGAACCGGAACAACAAC3', и режимы амплификации (1-й этап - 94° - 4 мин; 2-й этап - 94° - 30 сек, 59° - 40 сек, 72° - 40 сек (25 циклов); 3-й этап: 72° - 4 мин; 10° - хранение), позволяющие клонировать ДНК М.tuberculosis не только из выросших культур, но и непосредственно из биологических секретов (мокрота, БАЛ). Денатурацию полученных ампликонов проводят в денатурирующем растворе, дестабилизирующем двойную спираль при нагревании. Электрофоретическое разделение полученных одноцепочечных фрагментов ДНК проводят в 8% полиакриламидном геле с 5% глицерином при напряжении 400 вольт в течение 5 ч при 8°С. Наличие мутаций в исследуемом гене определяют путем сравнения степени расхождения денатурированных нитей ДНК исследуемого и чувствительного штаммов М.tuberculosis к фторхинолонам. Способ позволяет определять чувствительность МБТ к фторхинолонам в более короткие сроки (2 дня), он доступен и безопасен. 1 ил.

Способ диагностики чувствительности Mycobacterium tuberculosis (МБТ) к фторхинолонам путем постановки полимеразной цепной реакции, основанной на амплификации ДНК исследуемого и чувствительного штаммов МБТ, с последующей денатурацией ДНК, электрофорезом в полиакриламидном геле, сравнением результатов электрофореза и определением чувствительности МБТ по степени расхождения одноцепочечных нитей ДНК в исследуемом и чувствительном штаммах, отличающийся тем, что амплификацию ДНК Mycobacterium tuberculosis последовательно проводят с подобранными двумя парами праймеров: «внешними» F1 - 5'AGAGTTGGTGCGGCGTAAGA3', R1 - 5'AACАСАTGCCCGTTCTCGAT3' и «внутренними» F2 - 5'TAAGAGCGCCACCGACATCG3', R2 - 5'GCATGAACCGGAАСААСААС3', в режиме амплификации 1-й этап - 94° - 4 мин; 2-й этап - 94° - 30 с, 59° - 40 с, 72° - 40 с (25 циклов); 3-й этап: 72° - 4 мин; 10° - хранение, разделение продуктов амплификации в соотношении 4 мкл образца и 6 мкл денатурирующего раствора проводят электрофорезом в 8%-ном полиакриламидном геле с 5%-ным глицерином при напряжении 400 В в течение 5 ч при 8°С, окраску геля проводят с помощью азотнокислого серебра.