СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ШТАММОВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS К ФТОРХИНОЛОНАМ Российский патент 2009 года по МПК C12Q1/68 C12R1/32 

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, в частности к способу диагностики чувствительности M.tuberculosis (МБТ) к фторхинолонам. Данный способ позволяет обнаружить мутации в гене gyrA, обусловливающие резистентность МБТ к этим препаратам, путем клонирования соответствующих последовательностей ДНК исследуемого гена МБТ с последующим анализом полученных ампликонов на наличие мутаций после их денатурации и электрофоретического разделения в полиакриламидном геле.

В последние годы на фоне неблагоприятной эпидемиологической обстановки по туберкулезу растет число больных, у которых выявляются МБТ с признаками множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ), т.е одновременно устойчивые к рифампицину (Р) и изониазиду (И). Такие больные среди впервые выявленных в Москве составляют 6-8% и до 20% среди пациентов с хроническим течением туберкулеза. (В.И.Литвинов и др. Эпидемиологическая ситуация по туберкулезу и организация противотуберкулезной помощи населению Москвы (2003 г.) // Москва 2004 г.). По некоторым данным в Российской Федерации процент больных с МЛУ значительно выше (М.И.Перельман и др. Оптимизация комплексной химиотерапии туберкулеза при использовании моксифлоксацина // Антибиотики и химиотерапия. - 2004. - №5. - стр.19-23). Лечение больных, у которых выявляются МЛУ-МБТ представляет большие трудности, так как добиться положительных результатов можно только с помощью так называемых «резервных» противотуберкулезных препаратов, которых немного и которые далеко не всегда являются эффективными.

В связи с этим возрос интерес к препаратам фторхинолонового ряда, особенно к левовращающим (моксифлоксацин, левофлоксацин и др.), которые показали высокую активность в отношении МЛУ-микобактерий туберкулезного комплекса (Chan E.D et al. Treatment and outcome analysis of 205 patients with multidrug-resistant tuberculosis // AJRCCM Articles in Press. - 2004. - P.26).

В настоящее время, учитывая, что вышеназванные препараты не так давно используют во фтизиатрической клинике, сертифицированных методов определения чувствительности к ним очень мало. По существу, можно назвать только культуральный метод определения чувствительности к фторхинолонам на плотных средах с помощью наборов фирмы Himedia (Индия). Но он длителен и занимает 2-3 месяца. В результате полученные данные становятся не актуальными для назначения пациенту адекватного лечения.

Использование молекулярно-биологических методов для определения лекарственной чувствительности к противотуберкулезным препаратам (ПТП), значительно сокращает сроки получения результатов (до 1-2 суток). Кроме того, они обладают высокой чувствительностью и специфичностью.

Известно, что мишенью действия фторхинолонов в МБТ является бактериальная АТФ-зависимая ДНК-топоизомераза II типа (ДНК-гираза), которая катализирует образование суперспирали ДНК (Blanchard J. S. Molecular mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis // Annu. Rev. Biochem. - 1996. - V.65. - P.215-239). Резистентность МБТ к фторхинолонам связана, главным образом, с мутациями, сосредоточенными в узкой области гена gyrA, который является структурным геном субъединицы гиразы А и содержит пять полиморфных кодона - позиции 88, 90, 91, 94 и 95. По данным секвенирования кодон 95 содержит естественно-обусловленный полиморфизм либо Ser (AGC) (в штаммах M.tuberculosis H37Rv и H37Ra) либо Thr (ACC) (в M.tuberculosis Erdman, M.bovis BCG, M.africanum) и не отвечает за резистентность к фторхинолонам (Takiff H.E et al. Cloning and nucleotide sequence of Mycobacterium tuberculosis gyrA and gyrB genes and detected of quinolone resistance mutations // Antimicrob. Agents a Chemotherapy. - 1994. - V.38. - P.773-780).

По литературным данным отмечены случаи первичной устойчивости МБТ к препаратам фторхинолоного ряда (Delgado M.B., Telenti A. In: Selected PCR protocols for Emerging Infectious Diseases / Persing D.H, ed., Washington, 1996), что подчеркивает актуальность своевременного определения резистентности МБТ к данной группе препаратов, особенно до начала лечения.

Существует широкий спектр молекулярно-биологических методов для выявления бактериальных мутаций, в которых первым этапом является полимеразная цепная реакция исследуемых участков с последующим использованием методов: анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, аллель-специфической ПЦР, секвенирования, метода денатурирующего градиентного гель-электрофореза, метода конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов. Все они обладают как достоинствами, так и недостатками, но используются, в основном, для научно-исследовательских целей и требуют хорошо оснащенных лабораторий (Victor T.C, Jordan A.M. Detection of mutation in drug resistance genes of M.tuberculosis by a dot-blot hibridization strategy // Int. J.Tubercle and Lung Disease. - 1999. - V.2. - P.346-349; Ramaswamy S, Musser J.Molecular genetic basis of antimicrobial agent resistance in M.tuberculosis // Tubercle and Lung Disease. - 1998 - V.79 - P.3-29).

Среди перечисленных методов нами все же был выбран метод конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов, преимущества которого по сравнению с другими методами состояли в том, что он менее сложен в исполнении, обладает достаточной чувствительностью (80% обнаружения мутаций) и не требует дорогостоящего оборудования.

Аналогом данного изобретения является способ определения мутаций с помощью метода конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов в генах ДНК МВТ, ответственных за резистентность к фторхинолонам у больных туберкулезом (Alangaden G.J., Manavathu E.K. Characterization of fluoroquinolone-resistant mutant strains of M.tuberculosis selected in the laboratory and isolated from patients. Antimicrob. Agents a Chemotherapy. - 1995. - V.39. - P.1700-1703; Cheng A.F, Yew W.W. Multiplex PCR amplimer conformation analysis for rapid detection of gyrA mutations in fluoroquinolone-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates // Antimicrob. Agents a Chemotherapy. - 2004. - V.48. - P.596-601).

Прототипом данного изобретения является работа Takiff H.E. et al. Cloning and nucleotide sequence of Mycobacterium tuberculosis gyrA and gyrB genes and detected of quinolone resistance mutations // Antimicrob. Agents a Chemotherapy. - 1994. - V. 38. - P.773-780. Авторами использовался метод, состоящий из нескольких этапов:

1. Исследуемую последовательность ДНК клонировали методом ПЦР с использованием изотопной метки (³²Р).

2. ПЦР-продукт подвергали термической денатурации в присутствии агентов, дестабилизирующих двойную спираль, и переносили на лед.

3. Затем данную смесь наносили на полиакриламидный гель и разделяли с помощью высоковольтного электрофореза. Анализируемые однонитевые ДНК-последовательности, одинаковые по величине, но различающиеся по пространственной организации молекул вследствие замен, имеют различную электрофоретическую подвижность. Полученные электрофоретические профили специфичны для исследуемой последовательности, и в случае замены одного нуклеотида в цепи исследуемые участки ДНК расходятся на разное расстояние друг от друга.

4. Степень расхождения денатурированных нитей определяли с помощью радиометрического анализа. Данный способ является высокоразрешающим, но требует специально оборудованного помещения и соблюдения осторожности в работе с изотопом ³²Р, поскольку он является источником жесткого β-излучения. Кроме того, время проведения данного анализа требует дополнительных 12 часов.

Таким образом, данный способ анализа мутаций, прежде всего по условиям проведения этапов, связанных с применением изотопов, не может быть применен во фтизиатрических клиниках, даже имеющих специализированную молекулярно-диагностическую лабораторию.

Отличия предлагаемого нами способа состоят в следующем. Для выявления мутаций в гене gyrA были подобраны: собственная пара праймеров, программа амплификации, и главное - был изменен способ изучения конформационного полиморфизма одноцепочечных ампликонов - без применения изотопов.

Важным явилось также то, что исследования проводили не только на ДНК, выделенной из выросших культур МБТ, но также выделенной непосредственно из биологических секретов (мокрота, БАЛ) полученных от больных разными формами туберкулеза, находящихся на лечении в МНПЦ БТ.

В результате разработанный способ является безопасным, достаточно доступным в условиях специализированной лаборатории и занимает 2 дня, что быстрее по сравнению с вышеописанным методом, а также с микробиологическими методами исследования.

Для решения проблемы впервые были разработаны условия для каждого из этапов метода:

1. Для синтеза ДНК МБТ гена gyrA были выбраны праймеры с использованием компьютерной программы "OLIGO 6" и "BioEdit":

1-й 5' СТА TGC ААТ GTT CGA TTC CGG СТТ С 3',

2-й 5' ACT GTC TCC TCG TCG ATT TCC CT 3'.

Для оценки специфичности выбранных праймеров проводили сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей с базой данных GenBank с помощью программы BLAST. Было установлено отсутствие перекрестных реакций при использовании этих праймеров с ДНК других видов микроорганизмов и человека.

2. Был подобран состав реакционного буфера, в котором важными составляющими являются тип буфера, концентрация трифосфатов, концентрация ионов магния.

3. Варьируя температурами отжига праймеров, временем каждого цикла и количеством циклов был подобран оптимальный режим амплификации. Выбранные условия представляют собой следующее: 1-й этап - 95° - 4 мин; 2-й этап - 95° - 30 сек, 65° - 40 сек, 72° - 40 сек (40 циклов); 3-й этап: 72° - 4 мин; 10° - хранение.

4. Были подобраны условия для электрофоретического разделения одноцепочечных фрагментов, полученных на предыдущем этапе. Это условия денатурации полученных ампликонов (соотношение ампликонов и денатурирующего раствора, время денатурации), состав полиакриламидного геля (процентное содержание полиакриламида, глицерина и состав буфера), условия разделения (напряжение, время электрофореза, температура), позволяющие повысить эффективность разделения одноцепочечных исследуемых ампликонов. Подобранные условия следующие: для денатурации смешивают 4 мкл образца с 6 мкл денатурирующего раствора и проводят денатурацию при 95° - 10 мин, разделение денатурированных ампликонов проводят в 8% полиакриламидном геле с 5% глицерином при напряжении 400 вольт в течение 5 часов при температуре 8° С в ТВЕ-буфере.

5. Окраску электрофореграмм проводили красителем Sybr Green 2, применение которого допускается в обычных ПЦР-лабораториях согласно рекомендациям фирмы производителя данного реагента.

Детекция результатов. После окраски гель помещали на трансиллюминатор и подвергали воздействию УФ-лучами с длиной волны 254 нм. Для определения мутаций в гене, наряду с ампликонами исследуемого образца исследовали и ампликоны ДНК чувствительных штаммов МБТ. В случае, когда анализируемый штамм МБТ был резистентен к фторхинолонам, расстояние между денатурированными нитями амплифицированных фрагментов ДНК достоверно отличалось от расстояния между нитями амплифицированных фрагментов ДНК чувствительного штамма.

Способ по изобретению включает клонирование исследуемой последовательности в гене gyrA ДНК М. tuberculosis (МБТ) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), с дальнейшей денатурацией ПЦР-продукта в присутствии денатурирующего раствора для получения одноцепочечных фрагментов ДНК. Далее выявляют в них мутации путем разделения данных фрагментов в полиакриламидном геле. Для проведения ПЦР была подобрана пара праймеров: 5' СТА TGC ААТ GTT CGA ТТС CGG СТТ С 3' и 5' ACT GTC TCC TCG TCG ATT TCC CT 3', и режимы амплификации (1-й этап - 95° - 4 мин; 2-й этап - 95° - 30 сек, 65° - 40 сек, 72° - 40 сек (40 циклов); 3-й этап: 72° - 4 мин; 10° - хранение), позволяющие клонировать ДНК М. tuberculosis не только из выросших культур, но и непосредственно из биологических секретов (мокрота, БАЛ). Денатурацию полученных ампликонов проводят в денатурирующем растворе, дестабилизирующем двойную спираль при нагревании. Электрофоретическое разделение полученных одноцепочечных фрагментов ДНК проводят в 8% полиакриламидном геле с 5% глицерином при напряжении 400 вольт в течение 5 час. при 8°С. Наличие мутаций в исследуемом гене определяют путем сравнения степени расхождения денатурированных нитей ДНК исследуемого и чувствительного штаммов М tuberculosis к фторхинолонам. Способ позволяет проводить определения в более короткие сроки (2 дня), он доступен и безопасен.

Способ диагностики чувствительности Mycobacterium tuberculosis (МБТ) к фторхинолонам путем постановки полимеразной цепной реакции, основанной на амплификации ДНК исследуемого и чувствительного штаммов МБТ, с последующей денатурацией ДНК, электрофорезом в полиакриламидном геле, сравнением результатов электрофореза и определением чувствительности MET по степени расхождения одноцепочечных нитей ДНК в исследуемом и чувствительном штаммах, отличающийся тем, что амплификацию ДНК Mycobacterium tuberculosis проводят с парой праймеров: 5' СТА TGC ААТ GTT CGA ТТС CGG СТТ С 3' и 5' ACT GTC TCC TCG TCG ATT TCC CT 3', в режиме амплификации 1-й этап - 95° - 4 мин, 2-й этап - 95° - 30 с, 65° - 40 с, 72° - 40 с (40 циклов), 3-й этап - 72° - 4 мин, 10° - хранение, а разделение продуктов амплификации электрофорезом проводят в 8% полиакриламидном геле с 5% глицерином при напряжении 400 В в течение 5 ч при 8°С без применения изотопов.