СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ БОЛЬНЫХ БРУЦЕЛЛЕЗОМ ЖИВОТНЫХ ОТ ВАКЦИНИРОВАННЫХ Российский патент 1995 года по МПК G01N33/53 A61K38/10 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к ветеринарной иммунологии, а именно к методам дифференциальной диагностики бруцеллеза.

Известен способ дифференциальной диагностики больных бруцеллезом животных от вакцинированных (см. Расулов Г.О. и Шарипов К.О. О дифференциации реакций у больного бруцеллезом и иммунизированного крупного рогатого скота шт.19. Сборник научных трудов. Том VIII. Махачкала: Дагестанское книжное издательство, 1976, с. 34), заключающийся в отборе крови животного, отстаивании сыворотки, постановке РСК с единым бруцеллезным антигеном, выявлении первичных титров антител, инактивации этой сыворотки при 70^оС, повторной постановке РСК с выявлением вторичных титров антител и сравнении первичных и вторичных титров.

Однако эффективность дифференциации невысока, поскольку способ требует неоднократного применения, тем самым удлиняя сроки диагностики.

Известен также способ дифференциальной диагностики больных бруцеллезом животных от вакцинированных (см. Аскерова М.А. Дифференциальная диагностика больных и вакцинированных против бруцеллеза животных. Бюллетень ВИЭВ. Вып. 57. М. 1985, с. 12), заключающийся в отборе крови животного, отстаивании сыворотки, постановке РСК с использованием единого бруцеллезного антигена, выявлении первичных титров антител, постановке РРИД с polyВ-антигеном, полученным из штамма Br.melitensis B 115, выявлении соответствующих антител и сравнении результатов исследования.

Однако точность и эффективность дифференциации этого способа также низка ввиду различной видоспецифичности антигена (Br.melitensis B 115) и вакцинного штамма. Кроме этого, антиген готовят из особо опасного вида бруцелл, что создает дополнительные трудности в его применении. При этом способ подразумевает постановку реакции радиальной иммунодиф- фузии, что также усложняет процесс диагностики.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности является способ дифференциальной диагностики больных бруцеллезом животных от вакцинированных (Лим А. А. Применение меркаптоэтаноловой пробы для дифференциации вакцинированных против бруцеллеза животных от больных. Ветеринария, 1989, N 4, с. 30), заключающийся в отборе крови животного, отстаивании сыворотки, постановке РА с использованием единого бруцеллезного антигена, выявлении количеств антител IgM, проведении меркаптоэтанолового теста, выявлении количеств антител IgG. При этом по наличию IgM выявляют вакцинированных животных, а по наличию IgG больных.

Однако эффективность способа невысока, так как способ трудно реализуем на практике ввиду высокотоксичного действия раствора 2-меркаптоэтанола. Метод, кроме того, трудоемок и неэкономичен из-за дороговизны препарата и постановки малого количества проб.

Целью изобретения является повышение точности и эффективности дифференциации вакцинированных против бруцеллеза животных от больных.

Поставленная цель достигается тем, что в способе дифференциальной диагностики больных бруцеллезом животных от вакцинированных, заключающемся в выявлении в сыворотке крови основных титров антител с использованием единого бруцеллезного антигена, полученного из штамма Brucella abortus в S-форме, выявление основных титров антител осуществляют по РСК, дополнительно проводят РСК с антигеном, полученным из штамма Brucella abortus 82 в RS-форме, выявляют дополнительные титры антител, при превышении основных титров антител с использованием единого бруцеллезного антигена над дополнительными титрами антител с использованием антигена из штамма Brucella abortus 82 в RS-форме в 2 раза и более дифференцируют больных бруцеллезом животных от вакцинированных.

Дифференциация диагностики основана на следующих положениях. У здоровых животных после введения вакцины из слабоагглютиногенного штамма 82 синтез S-антител, выявляемых единым бруцеллез- ным антигеном, непродолжительный и их титр невысокий. При правильном применении вакцины из штамма 82 животные должны реагировать через 6 мес отрицательно с S-антигеном. Нарушение применения вакцины (отсутствие интервала и срока применения) приводит к серопозитивности более длительное время с S-антигеном. R-антитела у здоровых животных образуются также длительное время после вакцинации, но такие животные реагируют отрицательно с S-антигеном, однако их можно выявить в РСК с RS-антигеном. У больных бруцеллезом животных (не привитых вакциной из штамма 82) синтезируются только S-антитела, улавливаемые в РСК как с биофабричным S-антигеном, так и RS-антигеном, но титр S-антител у них выше титра RS-антител. При прорыве иммунитета у привитого скота в сыворотке крови обнаруживаются S- и RS-антитела, но, как правило, титр S-антител у них выше титра RS-антител. При выделении положительно или сомнительно реагирующих животных по реакции агглютинации или РСК сыворотку крови необходимо переисследовать в РСК с RS-антигеном для определения характера реакции (поствакци- нальная или постинфекционная). Животное следует считать больным, если оно при переисследовании реагирует в низком титре реакций с RS-антигеном при высоком титре реакций с S-антигеном. Животное также считают больным при положительной реакции РСК с S-антигеном и отрицательной реакции с RS-антигеном. Животное следует считать здоровым, если оно реагирует в низшем титре реакции с S-антигеном при высшем титре РСК с RS-антигеном или только с RS-антигеном. В случае невозможности определения характера реакции (положительная РСК в равных титрах с обоими антигенами) при однократном исследовании животное необходимо изолировать и провести его комплексную проверку по РА, РСК с S-антигеном и РСK c RS-антигеном через 25-30 дн после предыдущего исследования.

Способ осуществляется следующим образом.

Отбирают кровь животного, отстаивают сыворотку, инактивируют ее на водяной бане при 60-65^оС в течение 30 мин, после чего ставят РСК с единым бруцеллезным антигеном и RS-антигеном в рабочих титрах 1:75. Постановку РСК проводят согласно "Наставлению по диагностике бруцеллеза животных", утвержденному Главным управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР от 30.12.82. М. Агропромиздат, 1985 г. При этом в качестве комплемента используют раствор биофабричного комплемента, полученного разведением сухого вещества в физиологическом растворе в соотношении объемов 1:20. Гемолитическую сыворотку используют в удвоенном титре. Эритроциты барана в концентрации 2,5% Для приготовления гемолитической системы смешивают гемолитическую сыворотку в равных объемах с эритроцитами, вливая сыворотку во взвесь эритроцитов. Реакцию проводят на водяной бане при температуре 37-38^оС при соотношении объемов компонентов: 0,2 мл сыворотки, 0,2 мл антигена, 0,2 мл гемолизина, 0,2 мл эритроцитов, 0,2 мл комплемента.

Перед постановкой реакции проводят титрование комплемента на положительных сыворотках. Каждую сыворотку разводят в соотношении объемов к физраствору 1: 5, инактивируют на водяной бане при 60-65^оС и разливают по 0,2 мл в пробирки (2 ряда по 10 пробирок). В пробирку каждого ряда вносят комплемент в дозах от 0,02 до 0,2 мл, добавляют антиген в рабочем титре 1:75 по 0,2 мл. Во второй ряд пробирок добавляют 0,2 мл физраствора. Все пробирки помещают в водяную баню при 37-38^оС и выдерживают 20 мин, затем добавляют по 0,4 мл гемолитической системы и опять выдерживают на водяной бане в течение 20 мин при той же температуре, после чего учитывают результат.

RS-антиген получают следующим образом.

В качестве бруцелл используют вакцину из штамма Brucella abortus 82. Бруцеллы культивируют в питательной среде и отделяют биомассу, затем биомассу инактивируют при 80-90^оС в течение 20-30 мин, после чего фильтруют, помещают биомассу на водяную баню при 65^оС и добавляют расплавленный фенол при соотношении объемов фенола к фильтрату 1:1, тщательно перемешивая. Полученную белую густую массу выдерживают в течение 30 мин при той же температуре, после чего добавляют дистиллированную воду при соотношении объемов 1: 20. Раствор фильтруют через бумагу, остужают и подвергают диализу.

Примеры осуществления способа дифференциации на основе сравнения титров антител представлены в таблице.

П р и м е р 1. Исследовалась сыворотка крови от коровы (см. инв. N 2 таблицы) из неблагополучного хозяйства совхоз "Перелюбский" Перелюбского района Саратовской области. Животное реагировало в РСК с S-антигеном в титре 1:40, а с RS-антигеном реагировало отрицательно. Соотношение титров составило 40:0, что говорит о заболеваемости животного.

П р и м е р 2. Исследовалась сыворотка крови от коровы (см. инв. N 14 таблицы) из благополучного хозяйства совхоз "Коммунист" Екатериновского района Саратовской области. Животное реагировало в РСК с S-антигеном в титре 1: 20, а с RS-антигеном отрицательно. Соотношение титров составило 20:0, что говорит о заболеваемости животного.

П р и м е р 3. Исследовалась сыворотка крови от коровы (см. инв. N 22 таблицы) из благополучного хозяйства колхоз им. Крупской Аркадакского района Саратовской области. Животное реагировало в РСК с S-антигеном 1:10, а с RS-антигеном 1:20. Соотношение титров составило 1:2, что говорит о поствакцинальной реакции.

Таким образом, осуществление предлагаемого способа дифференциации диагностики позволило своевременно и точно выявить больных бруцеллезом животных, тем самым предохранить людей от заражения и дальнейшего распространения особо опасной инфекции.

Использование: биотехнология, ветеринарная иммунология. Сущность изобретения: отбирают кровь животного, отстаивают сыворотку, ставят реакцию связывания комплемента с единым бруцеллезным антигеном, полученным из штамма Brucella abortus в S-форме, и с антигеном, полученным из штамма Brucella abortus 82 в RS-форме. Выявляют титры антител и сравнивают их. По превышении титров антител, выявленных антигенами из штамма Brucella abortus в S-форме, над титрами антител, выявленных антигенами из штамма Brucella abortus 82 в RS-форме, не менее чем в 2 раза дифференцируют больных бруцеллезом животных от вакцинированных. 1 табл.

СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ БОЛЬНЫХ БРУЦЕЛЛЕЗОМ ЖИВОТНЫХ ОТ ВАКЦИНИРОВАННЫХ, предусматривающий отбор крови животного, отстаивание сыворотки крови, выявление в ней основных титров антител с использованием единого бруцеллезного антигена, полученного из штамма Brucella abortus в S-форме, выявление дополнительных титров антител и дифференциацию больных бруцеллезом животных от вакцинированных по результатам анализа титров, отличающийся тем, что выявление основных титров антител осуществляют в реакции связывания комплемента, а дополнительные титры антител выявляют в реакции связывания комплемента с антигеном, полученным из штамма Brucella abortus 82 в RS-форме, и при превышении основного титра антител над дополнительным не менее чем в 2 раза дифференцируют больных бруцеллезом животных от вакцинированных.