ШТАММ БАКТЕРИЙ BRUCELLA ABORTUS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ БИОПРЕПАРАТОВ ПРОТИВ БРУЦЕЛЛЕЗА ЖИВОТНЫХ Российский патент 2000 года по МПК C12N1/20 A61K39/10 G01N33/569 

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и представляет собой новый штамм бактерий Brucella abortus используемого для изготовления диагностических и профилактических биопрепаратов против бруцеллеза животных.

Комплекс мер борьбы с бруцеллезом животных предполагает своевременную диагностику и специфическую профилактику заболевания.

Известно, что для изготовления живой вакцины против бруцеллеза животных и антигенов для серологической диагностики заболевания (в РА, РСК, РДСК, РБП, КР с молоком) используют культуру вакцинного штамма Brucella abortus 19 (1).

Для изготовления живой противобруцеллезной вакцины и препаратов для диагностики бруцеллеза можно использовать штамм Brucella abortus 104М. Живая вакцина из данного штамма превосходит по специфической эффективности аналогичный препарат из штамма Brucella abortus 19, а диагностикумы из штамма 104М отличаются большей чувствительностью и специфичностью (2). Однако недостатком данного штамма, как и всех других штаммов бруцелл, используемых для изготовления диагностических и профилактических препаратов против бруцеллеза животных, является то, что при его культивировании в промышленных условиях бактериальная масса, являющаяся сырьем для изготовления вакцин и диагностикумов часто контаминируется посторонней микрофлорой, что приводит к существенным потерям сырья (10-15%), нанося значительный экономический ущерб биопредприятиям.

Целью настоящего изобретения является получение штамма бруцелл, предназначенного для изготовления биопрепаратов для диагностики и профилактики бруцеллеза животных, способного стабильно репродуцироваться на питательных средах, содержащих ингибитор роста посторонней микрофлоры, обладающего высокой иммуногенностью, выраженными агглютинабельными и антигенными свойствами, характерными для бруцелл в S-форме, непатогенного для животных и человека.

Штамм Brucella abortus получен в результате целенаправленной селекции по культуральным, морфологическим, биохимическим, агглютинабельным, антигенным и иммуногенным свойствам из вакцинного штамма Brucella abortus 104М.

Штамм назван Brucella abortus KB 13/100, депонирован в коллекции микроорганизмов Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) и имеет регистрационный номер KB 13/100 ДЕП.

Штамм Brucella abortus ВГНКИ N KB 13/100 характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки.

Бруцеллы штамма - короткие грамотрицательные палочки с закругленными концами, расположенные изолированно, попарно, реже в виде коротких цепочек, без спор и капсулы. Размер 1,0-1,2 мкм, шириной 0,5-0,6 мкм.

Культуральные свойства.

Культура штамма хорошо растет в аэробных условиях на плотных и жидких питательных средах: мясо-пептонном печеночном глюкозо-глицериновом агаре (МППГГА), печеночно-мартеновском агаре (ПМА), печеночно-мартеновском агаре с переваром Хоттингера (ПМАХ), картофельном агаре с переваром Хоттингера (КАХ), мясо-пептонном печеночном глюкозо-глицериновом бульоне (МППГГБ), печеночном глюкозо-глицериновом бульоне (ПГГБ), а также на этих и других средах, предназначенных для культивирования бруцелл с добавлением 0,001% бис-трифенилангидрокарбинола оксалата.

На МППГГА, МПХА и других плотных питательных средах, предназначенных для культивирования бруцелл (4-5 сутки инкубирования при (37-38^oC) растет в виде круглых, выпуклых, гладких, с четко контурированным краем, прозрачных колоний с диаметром 2,0-2,5 мм. При окрашивании раствором кристаллического фиолетового 1/2000 (по Уайт-Вилсону) 100% колоний окрашивается как S-форма: светло-желтый центр и темно-фиолетовый тонкий ободок. При культивировании на плотных средах, содержащих бис-трифенилангидрокарбинола оксалат колонии зеленого цвета.

На МППГГБ и других жидких питательных средах, предназначенных для культивирования бруцелл на 4-5 сутки инкубирования при 37-38^oC рост бактерий характеризуется легкой опалесценцией среды и тонким пристеночным кольцом голубоватого цвета.

Биохимические свойства.

Культура штамма растет на дифференциальных питательных средах (на основе МППГГА и других плотных питательных сред), содержащих фуксин в концентрации 1: 50 000, бис-трифенилангидрокарбинола оксалат в концентрации 1:100 000 (маркер), 5 мкг/см³ стрептомицина сульфат и не растет на средах, содержащих тионин в концентрации 1:50 000, пенициллин 5 ЕД/см³, эритритол 1 мг/см³.

Не продуцирует H₂S.

Лизируется фагом Тб.

Агглютинабельные свойства.

Культура штамма агглютинирунтся S-антибруцеллезной сывороткой и не агглютинируется R-антибруцеллезной сывороткой. Штамм обладает типоспецифической агглютинабельностью: агглютинируется А монорецепторной сывороткой до ее титра и не агглютинируется М сывороткой в разведении 1:10.

Антигенные свойства.

При введении морским свинкам в дозе 1•10⁹ микробных клеток и кроликам в дозе 7•10⁹ микробных клеток у животных вырабатываются только S-антитела: агглютинины от 100 до 1000 МЕ/см³ и комплементсвязывающие антитела в титрах от 1:20 до 1:160.

Сыворотка крови животных в разведении 1:10 не дает положительной реакции с R-бруцеллезными антигенами.

Безвредность.

Штамм KB 13/100 безвреден. При введении мышам 250 млн. микробных клеток и морским свинкам 2 млрд. микробных клеток не вызывает патолого-анатомических изменений, характерных для бруцеллеза. Бруцеллы штамма не мигрируют от вакцинированных животных к интактным.

Штамм неконтагиозный. При совместном содержании в течении 90 дней интактных морских свинок с морскими свинками, иммунизированными штаммом KB 13/100 в дозе 2 млрд. микробных клеток, последующим бактериологическим исследованием бруцеллы штамма KB 13/100 из лимфатических узлов и внутренних органов (10 объектов) невакцинированных животных не выделяются.

Вирулентность.

Остаточная вирулентность штамма KB 13/100 такая же, как у исходного вакцинного штамма B. abortus 104М. При внутрибрюшинном введении культуры штамма мышам линии C₅₇Блек/6 и убое животных с последующим бактериологическим исследованием селезенки ИД₅₀ штамма KB 13/100 оставляет 250-1000 микробных клеток (р=005).

Иммуногенные свойства.

Культура штамма, введенная морским свинкам под кожу в дозе 1•10⁹ микробных клеток защищает 100% иммунизированных животных от экспериментального заражения вирулентным штаммом бруцелл в дозе 10-15 ИД₅₀ через три месяца после вакцинации.

Стабильность основных свойств штамма при пассировании.

Штамм стабилен в отношении основных свойств на протяжении 10 пассажей на плотных и жидких питательных средах и 5 пассажей на морских свинках (срок наблюдения).

Штамм B.abortus ВГНКИ N KB 13/100 используют при изготовлении биопрепаратов для диагностики и профилактики бруцеллеза животных.

Пример 1.

Сравнивают культуральные свойства вакцинных штаммов B.abortus KB 13/100, B.abortus 19 и B.abortus 104М.

Двухсуточные агаровые культуры бруцелл вакцинных штаммов суспендируют в стерильном физиологическом растворе и высевают в чашки Петри и пробирки с плотными и жидкими питательными средами с 0,001% бис- трифенилангидрокарбинола оксалатом и без него. Посевы инкубируют при 37-38^oC в течение 4-5 суток. Учитывают наличие роста бруцелл и подсчитывают количество колоний. Результаты исследований приведены в табл. 1
Результаты учета роста бруцелл, как следует из таблицы 1, показывают, что вакцинный штамм B.abortus KB 13/100 одинаково стабильно репродуцируется на средах с бис-трифенилангидрокарбинола оксалатом и без него. В то время как культуры штаммов 19 и 104M не растут на средах, содержащих ингибитор роста посторонней микрофлоры.

Пример 2.

Штамм B. abortus KB 13/100 культивируют на МППГГА, содержащем 0,001% бис-трифенилангидрокарбинола оксалат. Культуру бруцелл смывают забуференным физиологическим раствором и готовят антиген для реакций агглютинации и связывания комплемента известным способом.

Одновременно изготавливают аналогичные антигены из бакмассы штаммов B. abortus 19 и 104М, выращенных на МППТТА без ингибитора. Разводят антигены фенолизированным физиологическим раствором до концентрации 2•10⁹ микробных клеток. Антигены испытывают в реакции агглютинации (РА) и реакции связывания комплемента (РСК) с национальной антибруцеллезной сывороткой (1000 МЕ/см³).

Результаты определения активности антигенов представлены в табл. 2 и 3.

Результаты учета реакций показывают, что антиген из штамма B.abortus KB 13/100 превосходит по активности аналогичные препараты из штаммов B.abortus 19 и 104M.

Пример 3.

Штамм B. abortus KB 13/100 культивируют на МПХА, ПГГА, и в МППГГБ с добавлением 0,001% бис-трифенилангидрокарбинола оксалата. Штаммы B.abortus 19 и 104M культивируют на тех же средах без ингибитора. По известной методике из полученной бактериальной массы каждого из трех штаммов готовят живые сухие вакцины (по три серии из каждого штамма). Иммуногенность вакцин проверяют в тесте активной защиты на морских свинках. Морских свинок иммунизируют в дозах 1•10⁷, 1•10⁸, 1•10⁹ микробных клеток. Вакцины вводят под кожу в область паха. Через 90 дней после иммунизации животных заражают стандартной культурой контрольного вирулентного штамма B.abortus 54/М ВГНКИ в дозе 20 ИД₅₀. Спустя 32-35 дней после заражения животных убивают и проводят бактериологическое исследование лимфатических узлов и внутренних органов по принятой методике. Критерием оценки эффективности вакцины служит процент защиты - отношение количества незаразившихся бруцеллезом животных к общему количеству морских свинок в группе. Дополнительным показателем эффективности вакцин служит индекс инфицированности - среднее по группе отношение количества выделенных культур бруцелл к количеству исследованных объектов, умноженное на 100. Результаты определения иммуногенности противобруцеллезных вакцин приведены в табл. 4.

В результате проведенных исследований установлено, что вакцина из штамма B. abortus KB 13/100 превосходит по специфической эффективности аналогичные препараты из штаммов B.abortus 19 и 104М.

Применение штамма B.abortus KB 13/100 для изготовления биопрепаратов для диагностики и профилактики бруцеллеза животных позволит значительно сократить потери сырья, повысить чувствительность диагностических препаратов и специфическую эффективность противобруцеллезных вакцин.

Литература
1. Ветеринарные препараты. Справочник. Под ред. Д.Ф. Осидзе - М.: Колос. 1981, с. 176-188.

2. Шумилов К.В., Альбертян М.П., Клочков А.А., Ромахов В.А. Вакцины против бруцеллеза крупного рогатого скота. Ветеринария. - 1984, N12, с. 26-29.

Изобретение предназначено для изготовления биопрепаратов для диагностики и профилактики бруцеллеза животных. Новый штамм Brucell abortus N КВ 13/100 способен стабильно репродуцироваться на питательных средах, содержащих ингибитор роста посторонней микрофлоры. В качестве ингибитора роста используют биcтрифенилангидрокарбинола оксалат в концентрации 0,001%. Штамм обладает высокой иммуногенностью, выраженными агглютинабельными и антигенными свойствами, характерными для бруцелл в S-форме. Непатогенен для животных и человека. Штамм Brucella abortus депонирован в коллекции микроорганизмов Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) и имеет регистрационный номер КВ 13/100 ДЕП. Полученный из штамма B.abortus ВГНКИ N КВ 13/100 диагностический антиген является высокоспецифичным и высокоактивным биопрепаратом, а изготовленная вакцина обладает более высокой иммуногенной активностью. 4 табл.

Штамм бактерий Brucella abortus ВГНКИ КВ 13/100 ДЕП, используемый для изготовления биологических препаратов для диагностики и профилактики бруцеллеза сельскохозяйственных животных.