Способ консервирования лейкоцитов Советский патент 1981 года по МПК A61K35/14 

(54) СПОСОБ КОНСЕРВИРОВАНИЯ ЛЕЙКОЦИТОВ

1

Изобретение относится к медицине, а именно гематологии.

Известен способ консервирования лейкоцитов путем замораживания в присутствии полиэтилено1 сида

Однако известный способ не обеспечивает высокой жизнеспособности лейкоцитов.

Цель изобретения - повышение жизнеспособности лейкоцитов.

Указанная цель достигается тем, что консервируют лейкоциты путем замораживания в присутствии полиэтиленоксида, лейкоциты смешивают с 4,5-5,0°/о-ным полиэтиленоксидом, обрабатывают ультразвуком частбтой 800-900 кГц и мощностью 0,2-0,4 Вт/см в течение 50-70 с и выдерживают с криопротектором в течение 7-11 мин.

Способ осуществляют следующим образом.

К подготовленной лейкомассе добавляют 4,5-5 /о-ный криопротектор ПЭО-400 и затем обрабатывают ультразвуком частотой 800-900 кГц мощностью 0,2-0,4 Вт/см в течение 50-70 с при 20-22°С. После этого осуществляют эквилибрацию с криопротектором в течение мин.

Обработанную таким образом лейкомассу разливают в контейнеры и замораживают до -196°С по двухэтапной программе; на 1 этапе со скоростью 1-2°С/мин от +20°С до температуры первичной кристаллизации с последующей выдержкой на плато в течение 5-7 мин, а на 2 этапе - от точки кристаллизации до -196°С погружением в жидкий азот.

Отогревают на водяной бане при 40-42°С.

Пример. Подготовленную лейкомассу разделяют на три части. Первую порцию оставляют нативной, ко второй приливают 4,6°/о-ный криопротектор ПЭО-400, а к третьей добавляют 4,6%-ный ПЭО-400, а затем обрабатывают ультразвуком частотой 800 кГц, мощностью 0,4 Вт/см в течение 65 с при 22°С. Эквилибрация с криопротектором во 2 и 3 порциях составляет 8 мин.

Обработанную таким образом лейкомассу разливают в металлические контейнеры объемом 50 мл и полиэтиленовые ампулы по 1 -1,5 мл и замораживают по двухэтапной программе: на 1 этапе - со скоростью 2°С/мин от 20°С до температуры первичной кристаллизации с последующей выдержкой на плато в течение 5 мин, на 2 этапе - от точки кристаллизации до -196° с погружением в жидкий азот. Материал хранят в жидком азоте в течение 10 суток, отогревают на водяной бане при 42°С. Для определения жизнеспособности и функциональной активности клеток лейкоцитов до замораживания, а также после хранения их при низкой температуре (-196°С) используют следующие методы: подсчет ядросодержащих клеток в камере Горяева; супровитальное окрашивание 10/о-ным водным раствором эозина по Шреку; подсчет лейкограмм, качественная оценка мазков; исследование электрокинетических свойств клеток после консервации; изучение фагоцитарной активности нейтрофилов; исследование миграционной активности лейкоцитов; исследование дыхательной функции лейкоцитов на распирометре автоматизированном универсальном. Клетки, обработанные ультразвуком, сохраняют миграционную активность и способность к фагоцитозу на уровне контрольных образцов. Потребление кислорода после низкотемпературного консервирования составляет 25-3,9 (контроль-нативные клетки 27,1+4,9), после замораживания с 4,6%-ным ПЭО-400 14,0-ь 2,6. Процент жизнеспособных клеток составляет 93,7 + 2,3 (контроль - клетки с ПЭО-400 без озвучивания 7-9,8-4,6). При анализе лейкограмм отмечают сохранение всех клеточных форм лейкоконцентрата. Предлагаемый способ позволяет повысить качество размороженного материала и количество сохранившихся клеток после низкотемпературного консервирования на 13,9/о и может быть использован для повышения эффективности низкотемпературного консер вирования ядросодержащих клеток крови с меньшей концентрацией криопротектора. Формула изобретения Способ консервирования лейкоцитов путем замораживания в присутствии полиэтиленоксида, отличающийся тем, что, с целью повыщения жизнеспособности целевого продукта, лейкоциты смешивают с 4,5-5,0%полиэтиленкосидом, обрабатывают ультразвуком частотой 800-900 кГц и мощностью 0,2 0,4 Вт/см в течение 50-70 с. и выдерживают с криопротектором в течение 7-11 мин.