СПОСОБ ФИКСАЦИИ АЛЬГИНАТНОГО ГЕЛЯ НА ТВЕРДОЙ ФАЗЕ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КЛЕТОЧНОГО МИКРОЧИПА НА ЕГО ОСНОВЕ И КЛЕТОЧНЫЙ МИКРОЧИП Российский патент 2007 года по МПК B32B7/00 C08B37/04 C08J3/75 C08J5/12 C12Q1/02 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биоорганической химии и касается способа фиксации альгинатного геля на твердой фазе. Изобретение также относится к технологии изготовления клеточных микрочипов, находящих применение в молекулярной биологии, и клеточным микрочипам.

Предшествующий уровень техники

В последние 15 лет в молекулярной биологии широкое распространение получил метод биологических микрочипов. Одним из наиболее удачных технологических решений для изготовления таких микрочипов является использование микрокапель гидрогеля, фиксированных на твердой фазе. В микрокаплях геля иммобилизуют исследуемые объекты: олигонуклеотиды, белки, живые клетки [3]. Биологическая сохранность иммобилизуемых объектов зависит от свойств геля и условий полимеризации. К настоящему моменту разработана технология изготовления микрочипов (включающая способ фиксации геля на твердой фазе [4]) для полиакриламида и этот гель широко используется для получения олигонуклеотидных и белковых микрочипов. Однако условия полимеризации акрилатов и сами акрилаты весьма токсичны для живых клеток [7], вследствие чего в гелевых элементах микрочипа может быть иммобилизовано ограниченное число видов микроорганизмов, устойчивых к указанным неблагоприятным факторам. В связи с этим для получения клеточных микрочипов целесообразно применять менее токсичные гели, например альгинатный, широко использующийся для иммобилизации не только прокариот, но и животных клеток [1]. Кроме того, гель на основе альгината является высокопористым [2], что является значительным преимуществом, при использовании его в производстве олигонуклеотидных и белковых микрочипов.

Обычно для иммобилизации в альгинатах суспензию клеток перемешивают с альгинатом натрия и капают с высоты 10-20 см в сосуд с раствором соли двухвалентного металла (например, CaCl₂). При соприкосновении с этим раствором натрий в карбоксильных группах альгината замещается на двухвалентный металл (например, кальций) и это приводит к поперечной сшивке полимерных цепей альгината. Для получения клеточных микрочипов необходима прочная фиксация геля на твердой фазе, однако на данный момент способов фиксации альгинатного геля на поверхности твердой фазы не описано. Указанные недостатки решаются настоящим изобретением.

Краткое описание изобретения

Первым объектом защиты настоящего изобретения является способ фиксации альгинатного геля на твердой фазе, включающий:

а) модификация поверхности твердой фазы металлами с координационным числом 2 и более;

б) нанесение гелеобразующего раствора, содержащего соль альгиновой кислоты и одновалентного металла;

в) контактирование гелеобразующего раствора с раствором кросс-сшивающего реагента, представляющего собой раствор соли металла с координационным числом 2 и более.

В качестве металла, модифицирующего поверхность твердой фазы, используют титан, серебро, кобальт, цирконий, никель и прочие [3]. В одном из вариантов способа согласно изобретению модификацию поверхности проводят Mn в виде раствора KMnO₄. В другом варианте способа согласно изобретению модификацию поверхности проводят в растворе, содержащем KMnO₄ и кислоту. В качестве кислоты используют H₂SO₄. В одном из вариантов способа согласно изобретению поверхность модифицируют путем напыления оксида титана.

В качестве кросс-сшивающего реагента для полимеризации альгинатного геля используют солевой раствор, например раствор солей Са, Ва, Fe, Ni, Co, Zn. В одном из вариантов способа согласно изобретению в качестве солевого раствора используют CaCl₂.

В одном из вариантов способа согласно изобретению для усиления прочности фиксации используют полиамин, который дополнительно добавляют в солевой раствор, вызывающий гелеобразование альгиновой кислоты. В качестве полиамина согласно изобретению можно использовать, например, полиэтиленимин или полилизин.

В качестве твердой фазы, на которой фиксируют альгинатный гель, используют полимер, например полиэтилентерифталат, полибутилентерифталат, полистирол, поликарбонат, полипропилен, поливинилхлорид, оргстекло, стекло, металл, композитный материал.

В одном из вариантов способа согласно изобретению твердая фаза имеет форму пластины.

В одном из вариантов способа согласно изобретению гелеобразующий раствор наносят в виде капель.

Вторым объектом защиты настоящего изобретения является способ изготовления клеточного микрочипа, включающий нанесение на твердую фазу капель гелеобразующего раствора и их гелеобразование с формированием микроячеек геля, в котором в качестве геля используют альгинатный гель, который фиксируют на поверхности твердой фазы согласно способу по изобретению.

Третьим объектом защиты настоящего изобретения является клеточный микрочип, полученный согласно способу по изобретению.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение предусматривает способ фиксации альгинатного геля на твердой фазе. Принцип предложенного способа основан на следующем.

Молекулы альгиновой кислоты несут карбоксильные группы обеспечивающие возможность полимеризации в присутствии солей металлов с валентностью (II), (III) и более [6]. Способ согласно изобретению предусматривает модификацию полимерных материалов и стекла таким образом, что на их поверхности формируется слой оксидов металла со свободными валентностями. В частности, широко известны способы получения тонких пленок металлов (например, серебра, кобальта, циркония, никеля и пр.) и их соединений на различных поверхностях [3]. Например, в случае применения поверхности с напылением TiO₂ карбоксильные группы альгината связываются со свободной валентностью титана, чем достигается фиксация геля к подложке. При нанесении гелеобразующего раствора, содержащего соль моновалентного металла альгиновой кислоты, последняя путем замещения одновалентного металла на экспонированный на поверхности поливалентный связывается с поверхностью твердой фазы. После этого экспозиция гелеобразующего раствора в полимеризующем растворе приводит к формированию геля, фиксированного к поверхности твердой фазы. С целью увеличения прочности фиксации геля в полимеризующий раствор можно включить полиамин, например полилизин, полиэтиленимин. Положительно заряженный полиамин связывается с отрицательно заряженной поверхностью микрокапель альгината, металлами, модифицирующими поверхность твердой фазы, и, являясь высокомолекулярным полимером, образует пористую пленку на поверхности и укрепляет связь микрокапель с твердой фазой.

Способ согласно изобретению предусматривает использование:

в качестве твердой фазы:

а) полимерные материалы, например полиэтилентерифталат (ПЭТ), полибутилентерифталат, полистирол, поликарбонат, полипропилен, поливинилхлорид, оргстекло;

б) стекло;

в) металл;

г) композитные материалы.

в качестве модификатора поверхности используют металлы с координационным числом 2 и более, например Sn, Ag, Mo, Mn, Ti, Al;

в качестве кросс-сшивающего реагента используют соли металлов с координационным числом 2 и более, например CaCl₂, BaCl₂, ZnCl₂, FeNH₄(SO₄)₂, NiSO₄, CoSO₄;

для формирования упрочняющей пленки используют полиамин(ы), например полиэтиленимин, полилизин.

Способ фиксации альгинатного геля на твердой фазе осуществляют следующим образом. Пластины отмывают раствором любого детергента, например 7х, Tween и пр., для удаления существующих загрязнений (возникших при производстве, транспортировке и т.д.). Отмывку следует проводить при температуре, не влияющей на структуру материала и не приводящей к изменению его формы, например при комнатной температуре. Модифицируют поверхность металлом, например путем напыления Ag, Ti. Другой способ - путем обработки в KMnO₄, предпочтительно в кислой среде, при любой температуре, не влияющей на структуру материала и не приводящей к изменению его формы, например при комнатной температуре, т.к. это позволяет точнее контролировать степень обработки и упрощает методику. Готовят гелеобразующий раствор, содержащий моновалентную соль альгиновой кислоты. При необходимости гелеобразующий раствор может содержать дополнительные компоненты, например гигроскопичный(ые) агент(ы), такие как глицерин, гиалуроновая кислота, препятствующие высыханию, буферные агенты для поддержания рН. При изготовлении клеточных микрочипов гелеобразующий раствор также содержит иммобилизуемые клетки. Для гелеобразования капли на поверхности подложки приводят в соприкосновение с кросс-сшивающим агентом, роль которого могут выполнять соли металлов с координационным числом 2 и более, например CaCl₂, BaCl₂, ZnCl₂, FeNH₄(SO₄)₂, NiSO₄, CoSO₄. Хотя кросс-сшивка происходит в течение нескольких секунд, для упрочнения геля контактирование с кросс-сшивающим агентом проводят в течение 5-30 мин, предпочтительно 10-15 мин. Кросс-сшивку также можно проводить при комнатной температуре, хотя ее можно проводить и при других температурах.

Способ изготовления клеточного микрочипа заключается в следующем. На пластины, обработанные, как указано выше, при температуре от 0 до 37°С, предпочтительно при комнатной температуре в определенном порядке наносят капли гелеобразующего раствора, содержащего иммобилизуемые клетки. Гелеобразующий раствор дополнительно включает гигроскопичный агент, например глицерин в количестве 10-50% или гиалуроновую кислоту в количестве 0.5-20%, и буферный агент, например 50 мМ HEPES или 10-20 mM Tris или др. Нанесение может осуществляться как вручную, так и посредством соответствующей робототехники. При нанесении следует поддерживать микроклимат с относительной влажностью, препятствующей гибели клеток от высыхания. Например, при 50%-ном содержании глицерина в гелеобразующем растворе относительная влажность должна быть порядка 50-65%. Для гелеобразования капли, нанесенные на подложку, приводят в контакт с раствором соли двухвалентного металла, например, путем погружения в 0,1М раствор CaCl₂. Инкубируют 5-30 мин, предпочтительно 10-15 мин, при комнатной температуре. Далее хранят или сразу используют в экспериментальной работе.

Источники и публикации, перечисленные в описании, являются неотъемлемой его частью, как если бы все их содержание было включено в описание.

Приведенные далее примеры являются предпочтительными, предназначены лишь для подтверждения возможности осуществления изобретения и не должны стать основанием для ограничения объема притязаний заявителя. Специалист в данной области техники без труда найдет возможности иных воплощений изобретения, безусловно, подпадающих под притязания заявителя, отраженные в формуле изобретения, приводимой ниже.

Примеры

Пример 1. Фиксация альгинатного геля на твердой фазе, модифицированной водным раствором KMnO₄.

Отмытую детергентом пластину полибутилентерифталата (ПЭТ) обрабатывали в течение 1 часа при температуре 23°С раствором 5% KMnO₄. После промывки дистиллированной водой на подложку наносили микрокапли гелеобразующего раствора, содержащего 1,5% альгинат натрия (тип «low viscosity»; Sigma, США), 30% глицерин, 50 мМ HEPES (pH 7.5) и 0.85% NaCl. Затем образец помещали в 0,1М раствор CaCl₂ с 0,9% NaCl на 15 мин, после чего оценивали прочность фиксации микрокапель к подложкам. Микрокапли геля прочно пришились к подложке.

Пример 2. Фиксация альгинатного геля на твердой фазе, модифицированной водным раствором KMnO₄ в присутствии кислоты.

Пластину ПЭТ размером 25×25 мм помещали в водный раствор детергента "7х" на 30 мин, после чего промывали дистиллированной водой. Затем помещали пластину в водный раствор 5% KMnO₄, 1,2N H₂SO₄ на 16 мин при t°=60°C. Промывали дистиллированной водой.

Для подтверждения эффективности процедуры модификации проводили следующий эксперимент. На модифицированную подложку ПЭТ наносили микрокапли гелеобразующего раствора, содержащего 1,5% альгинат натрия (тип «low viscosity»; Sigma, США), 30% глицерин, 50 мМ HEPES (pH 7.5), 0.85% NaCl. Для полимеризации альгината натрия наносили поверх микрокапель 100 мкл 0,1М водного раствора CaCl₂, выдерживали 10 мин.

Для проверки прочности фиксации микрокапель к поверхности твердой фазы образец подвергали механическому и тепловому воздействию. А именно помещали пластину со сформировавшимися на ней микрокаплями альгинатного геля в 50-миллилитровую пробирку с 30 мл дистиллированной воды, плотно закручивали крышку и размещали пробирку в горизонтальном положении на качалке при скорости 100 об/мин на 10 часов при 37°С. Микрокапли геля прочно пришились к подложке.

Пример 3. Фиксация альгинатного геля на твердой фазе в присутствии полиамина.

На четыре пластины ПЭТ, модифицированные согласно Примеру 2, наносили микрокапли гелеобразующего раствора, содержащего 1,5% альгинат натрия (тип «low viscosity»; Sigma, США), 30% глицерин, 50 мМ HEPES (pH 7.5), 0.85% NaCl и суспензию клеток Е.coli. Диаметр микрокапель 100-400 мкм. Для полимеризации альгината натрия поверх микрокапель нанесли 100 мкл водного раствора, содержащего:

для двух пластин А: 0,1М CaCl₂, 0,5M полиэтиленимин;

для двух пластин Б: 0,1М CaCl₂.

Выдерживали 10 мин.

Для проверки прочности фиксации микрокапель к подложке при механическом, тепловом и химическом воздействии пластины А и Б со сформировавшимися на ней микрокаплями альгинатного геля помещали в 50-мл пробирку с 30 мл:

1) дистиллированной воды,

2) среды LB [5],

плотно закручивали крышки и размещали пробирки в горизонтальном положении на качалке при скорости 100 об/мин на 10 часов при 37°С. После чего регистрировали наличие микрокапель геля на подложке (таблица 1). В микрокаплях геля на пластине А, инкубировавшейся в среде LB, при микроскопии регистрируются бактериальные микроколонии.

Таблица 1
Прочность фиксации микрокапель альгинатного геля при химико-механическом воздействии Дистиллированная водаСреда LBПластина А++Пластина Б+-«+» - микрокапли присутствуют,
«-» - микрокапли отсутствуют.

Пример 4. Фиксация альгинатного геля на твердой фазе с использованием растворов различных кросс-сшивающих реагентов.

Шесть пластин ПЭТ модифицировали согласно Примеру 2. Микрокапли гелеобразующего раствора, содержащего 1,5% альгинат натрия (тип «low viscosity»; Sigma, США), 30% глицерин, 50 мМ HEPES (рН 7.5), 0.85% NaCl наносили на модифицированные подложки ПЭТ. Для полимеризации альгината натрия на каждую из пластин наносили поверх микрокапель один из следующих 0,1М водных растворов:

1. CaCl₂

2. FeNH₄(SO₄)₂

3. ZnCl₂

4. NiSO₄

5. CoSO₄

6. BaCl₂

Выдерживали 10 мин. Для проверки прочности фиксации микрокапель к подложкам образцы подвергали механическому и тепловому воздействию. А именно помещали подложки со сформировавшимися на них микрокаплями альгинатного геля в 50-миллилитровую пробирку с 30 мл дистиллированной воды, плотно закручивали крышку и размещали пробирку в горизонтальном положении на качалке при скорости 100 об/мин на 10 часов при 37°С. На всех шести образцах микрокапли геля прочно пришились к подложке.

Пример 5. Фиксация альгинатного геля с использованием в качестве твердой фазы пластин полибутилентерфталата, полистирола, стекла и алюминия.

Отмытые детергентом пластины полибутилентерфталата, полистирола, стекла и алюминия обрабатывали в течение 1 часа при температуре 23°С раствором 5% KMnO₄ в 1,2N H₂SO₄. После промывки дистиллированной водой на подложки наносили микрокапли гелеобразующего раствора, содержащего 1,5% альгинат натрия (тип «low viscosity»; Sigma, США), 30% глицерин, 50 мМ HEPES (pH 7.5) и 0.85% NaCl. Затем образцы помещали в 0,1М раствор CaCl₂ с 0,9% NaCl на 15 мин, после чего оценивали прочность фиксации микрокапель к подложкам. Во всех случаях микрокапли геля прочно пришились к подложкам.

Пример 6. Изготовление клеточных микрочипов.

Клетки E.coli центрифугировали и однократно промывали в 0.85% NaCl. Измеряли оптическую плотность суспензии на спектрофотометре и приводили к 1.5-2.0 (λ=600 нм). Использовали гелеобразующий раствор следующего состава: 1.5% альгинат натрия («Sigma», США), 30% глицерин, 50 мМ HEPES (pH 7.5), 0.85% NaCl и 10% (по объему) клеточной суспензии. Раствор (20 мкл) переносили в плашку и хранили при 4°С до 3 ч перед нанесением. Гель из плашки наносили в виде микрокапель на подготовленную подложку с помощью робота QArray («Genetix», Великобритания), снабженного пином диаметром 300 мкм. Относительную влажность в камере нанесения поддерживали в диапазоне 65-75% при Т_возд=22°С. Для полимеризации микрокапель клеточный микрочип помещали в раствор 0.1М CaCl₂ с 0,5М полиэтиленимином и 0.85% NaCl на 15-20 мин, после чего промывали 0.85% NaCl для удаления свободных клеток и реагентов. Готовые микрочипы хранили в среде LB_Ca при 4°С либо сразу использовали в экспериментальной работе. Ячейки полученного микрочипа прочно фиксированы на подложке и содержали физиологически активные клетки Е.coli.

Литература

1. Aoyagi H., Tanaka H. Development of simple methods for preparation of yeast and plant protoplasts immobilized in alginate gel beads. Biotechnology Techniques 1999. 13: 253-258.

2. Eiselt P., Yeh J., Latvala R.K., Shea L.D., Mooney D.J. Porous carriers for biomedical applications based on alginate hydrogels. Biomaterials 2000. 21: 1921-1927.

3. E-MRS Spring Meeting 2002, June 18-21, 2002, SYMPOSIUM J, "Growth and Evolution of Ultrathin Films: Surface and Interface Geometric and Electronic Structure", Strasbourg.

4. Khrapko K.R., Lysov Yu P., Khorlin A.A., Ivanov I.B., Yershov G.M. et al. A method for DNA sequencing by hybridization with oligonucleotide matrix. DNA Seq 1991. 1: 375-388.

5. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. 1989. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory.

6. Smidsrod O., Skjak-Braek G. Alginate as immobilization matrix for cells. Trends Biotechnol 1990. 8: 71-78.

7. Вдовина Н.В., Бухар М.И., Кощеенко К.А. Влияние условий полимеризации на трансформационную активность культуры Tieghemella orchidis. Прикладная биохимия и микробиология 1980. 16: 309-314.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биоорганической химии и может быть использовано для изготовления клеточных микрочипов. Согласно предложенному способу формирования альгинатного геля с одновременной фиксацией его на поверхности твердой фазы альгинатный гель формируют на поверхности твердой фазы, содержащей слой оксида металла со свободными валентностями, в присутствии полиаминного соединения. Данный способ применяют в способе изготовления клеточного микрочипа. Клеточный микрочип получают путем формирования и фиксации микроячеек геля, содержащих иммобилизуемые клетки, на поверхности твердой фазы. Применение изобретения позволяет получить альгинатный гель, прочно зафиксированный на поверхности твердой фазы. 3 н. и 13 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ формирования альгинатного геля с одновременной фиксацией его на поверхности твердой фазы, включающий модификацию поверхности твердой фазы таким образом, чтобы она связывалась с альгиновой кислотой при нанесении на нее раствора, содержащего соль альгиновой кислоты и одновалентного металла; нанесение гелеобразующего раствора, содержащего соль альгиновой кислоты и одновалентного металла; и контактирование гелеобразующего раствора с раствором кросс-сшивающего реагента, представляющего собой раствор соли металла с координационным числом 2 и более, отличающийся тем, что поверхность твердой фазы модифицируют путем формирования на ней слоя оксида металла со свободными валентностями; и используют раствор кросс-сшивающего реагента, содержащий, по крайней мере, одно полиаминное соединение.2. Способ по п.1, в котором поверхность твердой фазы модифицируют путем формирования на ней слоя оксида металла с координационным числом 2 и более.3. Способ по п.2, в котором формируют слой оксида металла, выбираемого из группы, состоящей из оксидов Mn, Sn, Ag, Mo, Ti, Al.4. Способ по п.1, в котором поверхность твердой фазы модифицируют путем формирования на ней слоя оксида Mn.5. Способ по п.4, в котором слой оксида Mn формируют при помощи раствора KMnO₄.6. Способ по п.5, в котором раствор KMnO₄ содержит кислоту.7. Способ по п.6, в котором в качестве кислоты используют H₂SO₄.8. Способ по п.1, в котором в качестве кросс-сшивающего реагента используют раствор соли металла с координационным числом 2 и более, в частности, соли Са, Ва, Fe, Ni, Co, Zn, содержащий, по крайней мере, одно полиаминное соединение.9. Способ по п.8, в котором в качестве солевого раствора используют CaCl₂, содержащий, по крайней мере, одно полиаминное соединение.10. Способ по п.1, в котором в качестве полиаминного соединения используют полиэтиленимин и/или полилизин.11. Способ по п.1, в котором твердая фаза представляет собой полимер, стекло, металл, композитный материал.12. Способ по п.11, в котором полимер представляет собой полиэтилентерифталат, полибутилентерефталат, полистирол, поликарбонат, полипропилен, поливинилхлорид, оргстекло.13. Способ по п.1, в котором твердая фаза имеет форму пластины.14. Способ по любому из пп.1-14, в котором гелеобразующий раствор наносят в виде капель.15. Способ изготовления клеточного микрочипа, включающий нанесение на твердую фазу капель гелеобразующего раствора, содержащего иммобилизуемые клетки, с последующим формированием и фиксацией микроячеек геля на поверхности твердой фазы, отличающийся тем, что формирование и фиксацию микроячеек геля на поверхности твердой фазы проводят согласно способу по любому из пп.1-14.16. Клеточный микрочип, полученный согласно способу по п.15.