Настоящее изобретение относится к области иммунологии. В частности, настоящее изобретение относится к пептидам и их фармацевтическим композициям, способным модулировать иммунные ответы.
Предпосылки создания изобретения
Известно применение пептидов для лечения заболеваний и в качестве фармацевтических композиций. Например, в патенте США 6191113 описан пептид, который обладает ингибирующей активностью для роста клеток гладкой мускулатуры и таким образом может использоваться для профилактики и лечения патологических состояний, связанных с ростом клеток гладкой мускулатуры, таких как атеросклероз, рестеноз после ангиопластики, сужение просвета после трансплантации кровеносных сосудов и саркома гладких мускулатуры. В патенте США 6184208 описан другой пептид, который, как установлено, модулирует физиологические процессы, такие как активность прироста веса зоны эпителиального роста и рост волос.
Краткое изложение сущности изобретения
Таким образом, объектом настоящего изобретения является идентификация биологически активных полипептидов. Стандартными химическими методами было синтезировано множество пептидов и проведен скрининг их биологической активности. Пептидам присвоены коды, имеющие буквы CMS с последующим номером. Всего было выявлено 30 пептидов, обладающих биологической активностью in vivo. Последовательности и соответствующие идентификационные номера (ID) таких биологически активных пептидов приведены в таблице А.
Соответственно один из аспектов настоящего изобретения относится к по существу чистым пептидам, имеющим последовательности, идентифицированные как последовательности SEQ ID No:1-30. Таким образом, настоящее изобретение также относится к по существу чистым пептидам, включающим аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No:1-30. Оно также относится к по существу чистому пептиду, состоящему главным образом из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No:1-30. В конкретном варианте осуществления пептиды могут модулировать, но не ограничиваются модулированием, одно или более из следующего: иммунную активность; инфекцию гепатита, включая, но не ограничиваясь, инфекцию гепатита В; нефрит; рост раковой опухоли, включая, но не ограничиваясь этим, саркому, рак печени, лейкоз и меланому; и вес тела.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к по существу чистым пептидам, которые являются функциональными производными пептидов, имеющим последовательности, идентифицированные как последовательности с ID No:1-30. Таким образом, настоящее изобретение также относится по существу к чистому пептиду, включающему аминокислотную последовательность, которая является функциональной производной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No:1-30. Оно также относится к по существу чистому пептиду, состоящему главным образом из аминокислотной последовательности, которая представляет собой функциональное производное аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No:1-30. В конкретном варианте осуществления пептиды, которые являются функциональными производными, могут модулировать, но не ограничиваются модулированием, одно или несколько из следующего: иммунную активность; инфекцию гепатита, включая, но не ограничиваясь, инфекцию гепатита В; нефрит; рост раковой опухоли, включая, но не ограничиваясь этим, саркому, рак печени, лейкоз и меланому; и вес тела.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, которые имеют последовательности, кодирующие пептиды, идентифицированные выше как последовательности SEQ ID No:1-30. Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к векторам экспрессии, которые содержат последовательности нуклеиновых кислот пептидов, показанные ниже как последовательности SEQ ID No:1-30. Таким образом, данный аспект настоящего изобретения также относится к генетическому вектору, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID No:1-30. Оно также относится к генетическому вектору, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид, состоящий главным образом из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No:1-30. Изобретение также относится к генетическому вектору, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид, включающий функциональное производное биологически активной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No:1-30. Оно также относится к генетическому вектору, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид, состоящий главным образом из функциональной аминокислотной последовательности, которая представляет собой функциональное производное биологически активной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No:1-30.
Еще один аспект настоящего изобретения относится к гибридным пептидам, содержащим лидерный или сигнальный пептид, смежный с пептидом, при этом пептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No:1-30. Настоящее изобретение также относится к гибридным пептидам, содержащим лидерный пептид, смежный с пептидом, при этом пептид включает функциональное производное пептида, имеющего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No:1-30.
Настоящее изобретение также относится к генетическому вектору, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид, включающий лидерную аминокислотную последовательность, смежную с пептидом, включающим функциональную аминокислотную последовательность, которая представляет собой функциональное производное биологически активной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID No:1-30. Оно также относится к генетическому вектору, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид, включающий лидерную аминокислотную последовательность, смежную с пептидом, состоящим главным образом из функциональной аминокислотной последовательности, которая представляет собой функциональное производное биологически активной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No:1-30.
В конкретном варианте осуществления пептиды, продуцируемые в любом из вышеуказанных генетических векторов, могут модулировать, но не ограничиваются модулированием, одно или более из следующего: иммунную активность; инфекцию гепатита, включая, но не ограничиваясь, инфекцию гепатита В; нефрит; рост раковой опухоли, включая, но не ограничиваясь этим, саркому, рак печени, лейкоз и меланому; и вес тела.
Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к микроорганизму, геном которого включает нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No:1-30. Оно также относится к микроорганизму, геном которого включает нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид, состоящий главным образом из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No:1-30.
Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к микроорганизму с генетическим материалом, который включает нуклеотидную последовательность, кодирующую экзогенный пептид, включающий функциональную аминокислотную последовательность, которая представляет собой функциональное производное биологически активной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No:1-30. Оно также относится к микроорганизму с генетическим составом, включающим нуклеотидную последовательность, которая кодирует экзогенный пептид, состоящий главным образом из функциональной аминокислотной последовательности, которая представляет собой функциональное производное биологически активной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No:1-30. Термин «экзогенный пептид», как использовано в данном описании, относится к пептиду, имеющему аминокислотную последовательность, которая отличается от любого другого пептида, обычно экспрессируемого микроорганизмом в своей природной немодифицированной форме.
Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к микроорганизму с генетическим составом, включающим нуклеотидную последовательность, которая кодирует экзогенный гибридный пептид, включающий лидерную аминокислотную последовательность, смежную с пептидом, пептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No:1-30. Оно также относится к микроорганизму, геном которого включает нуклеотидную последовательность, кодирующую гибридный пептид, включающий лидерную аминокислотную последовательность, смежную с пептидом, состоящим главным образом из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No:1-30.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к микроорганизму с генетическим составом, включающим нуклеотидную последовательность, которая кодирует экзогенный гибридный пептид, включающий лидерную аминокислотную последовательность, смежную с пептидом, при этом пептид включает функциональную аминокислотную последовательность, которая представляет собой функциональное производное биологически активной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No:1-30. Оно также относится к микроорганизму с генетическим составом, включающим нуклеотидную последовательность, которая кодирует экзогенный гибридный пептид, включающий лидерную аминокислотную последовательность, смежную с пептидом, состоящим главным образом из функциональной аминокислотной последовательности, которая представляет собой функциональное производное биологически активной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No:1-30.
В конкретном варианте осуществления пептиды, продуцируемые любым из вышеуказанных микроорганизмов, могут модулировать, но не ограничиваются модулированием, одно или более из следующего: иммунную активность; инфекцию гепатита, включая, но не ограничиваясь, инфекцию гепатита В; нефрит; рост раковой опухоли, включая, но не ограничиваясь этим, саркому, рак печени, лейкоз и меланому; и вес тела.
В следующем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей по существу чистый пептид, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No:1-30. Изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей по существу чистый пептид, состоящий главным образом из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No:1-30.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей по существу чистый пептид, включающий функциональное производное аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No:1-30. Оно также относится к фармацевтической композиции, включающей по существу чистый пептид, состоящий главным образом из функционального производного аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No:1-30. Кроме того, изобретение относится к фармацевтической композиции, состоящей из по существу чистого пептида, состоящего главным образом из функционального производного аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No:1-30.
В конкретном варианте осуществления пептиды в составе любой из вышеуказанных фармацевтических композиций могут модулировать, но не ограничиваются модулированием, одно или более из следующего: иммунную активность; инфекцию гепатита, включая, но не ограничиваясь, инфекцию гепатита В; нефрит; рост раковой опухоли, включая, но не ограничиваясь этим, саркому, рак печени, лейкоз и меланому; и вес тела.
В следующем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения фармацевтической композиции, включающему получение по существу чистого пептида, включающего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No:1-30, и смешивание указанного по существу чистого пептида с фармацевтически приемлемым носителем. Оно также относится к способу получения фармацевтической композиции, включающему получение по существу чистого пептида, состоящего главным образом из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No:1-30.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения фармацевтической композиции, включающему получение по существу чистого пептида, включающего аминокислотную последовательность, которая является функциональным производным аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No:1-30; и смешивание указанного по существу чистого пептида с фармацевтически приемлемым носителем.
Изобретение далее относится к способу получения фармацевтической композиции, включающему получение по существу чистого пептида, состоящего главным образом из аминокислотной последовательности, которая является функциональным производным аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No:1-30.
В связи с любым из вышеуказанных способов пептид может модулировать, но не ограничиваются модулированием, одно или более из следующего: иммунную активность; инфекцию гепатита, включая, но не ограничиваясь, инфекцию гепатита В; нефрит; рост раковой опухоли, включая, но не ограничиваясь этим, саркому, рак печени, лейкоз и меланому; и вес тела.
Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения человека, включающему введение человеку фармацевтически эффективной дозы по существу чистого пептида, включающего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No:1-30. Оно также относится к способу лечения человека, включающему введение человеку фармацевтически эффективной дозы по существу чистого пептида, включающего аминокислотную последовательность, которая представляет собой функциональное производное аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No:1-30.
В конкретном варианте осуществления описанные выше пептиды, используемые для лечения человека, могут использоваться для модулирования, но не ограничиваются модулированием, одного или более из следующих состояний человека: иммунной активности; инфекции гепатита, включая, но не ограничиваясь, инфекцию гепатита В; нефрита; роста раковой опухоли, включая, но не ограничиваясь этим, саркому, рак печени, лейкоз и меланому; и веса тела.
В связи с любыми вышеописанными последовательностями нуклеиновых кислот, пептиды и/или гибридные пептиды, экспрессируемые из данных последовательностей нуклеиновых кислот могут модулировать, но не ограничиваются модулированием, следующее: иммунную активность; инфекцию гепатита, включая, но не ограничиваясь, инфекцию гепатита В; нефрит; рост раковой опухоли, включая, но не ограничиваясь этим, саркому, рак печени, лейкоз и меланому; и вес тела.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу лечения заболеваний, включающему введение фармацевтически эффективной дозы по существу чистого пептида, с последовательностью SEQ ID No:1 - SEQ ID No:30. В конкретном варианте осуществления вводимые таким образом пептиды могут модулировать, но не ограничиваются модулированием, следующее: иммунную активность; инфекцию гепатита, включая, но не ограничиваясь, инфекцию гепатита В; нефрит; рост раковой опухоли, включая, но не ограничиваясь этим, саркому, рак печени, лейкоз и меланому; и вес тела.
Как описано выше, другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой пептид или полипептид, состоящий главным образом из пептидов по настоящему изобретению. Как использовано в данном описании, термин «состоящий главным образом из» относится к пептиду или полипептиду, который включает аминокислотную последовательность пептидов по настоящему изобретению наряду с дополнительными аминокислотами на карбоксильном и/или аминном концах, и который поддерживает активность представленных здесь пептидов по настоящему изобретению. Таким образом, в качестве неограничивающего примера, когда активность пептида по настоящему изобретению заключается в модулировании иммунной активности, пептид или полипетид, «состоящий главным образом» из пептида по настоящему изобретению, будет обладать активностью модулирования иммунной активности, как представлено здесь относительно пептида, и не будет обладать какими-либо характеристиками, которые значительно снижают способность пептида или полипептида модулировать иммунную активность, или которые вносят значимое изменение в основные и новые характеристики пептида в качестве модулятора иммунной активности. Таким образом, в приведенном выше примере полноразмерный природный полипептид, который обладает первичной активностью, отличающейся от модулирования иммунной активности, и который где-нибудь в себе содержит аминокислотную последовательность пептида по настоящему изобретению, не будет представлять собой пептид или полипетид «состоящий главным образом» из пептида по настоящему изобретению. Аналогичным образом, в вышеуказанном примере генетически сконструированный пептид или полипептид, который обладает первичной активностью, отличающейся от модулирования иммунной активности, но включает где-нибудь в себе аминокислотную последовательность пептида по настоящему изобретению, не будет представлять собой пептид или полипептид, «состоящий главным образом» из пептида по настоящему изобретению.
Помимо использованного выше примера модулирования иммунной активности, приведенное выше определение также относится ко всем пептидам настоящего изобретения в отношении видов активности, которыми обладают такие пептиды. В частности, приведенное выше определение относится к пептидам изобретения, обладающим активностью модулирования степени вирусного инфицирования, модулирования степени инфекции гепатита, модулирования степени нефрита, модулирования роста раковой опухоли или модулирования веса тела, как указано ниже в подробном описании.
Специалисты в данной области легко смогут определить, состоит или не состоит пептид или полипептид главным образом из пептида по настоящему изобретению в рамках приведенных выше определений, с помощью измерения активности пептида или полипептида с использованием анализов модулирования иммунной активности, модулирования степени вирусного инфицирования, модулирования степени инфекции гепатита, модулирования степени нефрита, модулирования роста раковой опухоли или модулирования веса тела, которые обеспечиваются здесь для конкретных пептидов по настоящему изобретению.
В предпочтительном варианте осуществления термин «состоящий главным образом из» относится к пептидам или полипетидам, которые имеют меньше 20 аминокислотных остатков в дополнение к пептиду согласно настоящему изобретению. В более предпочтительном варианте осуществления та же терминология относится к пептидам, имеющим менее 15 аминокислотных остатков в дополнение к пептиду согласно настоящему изобретению. В еще более предпочтительном варианте осуществления та же терминология относится к пептидам, имеющим менее 10 аминокислотных остатков в дополнение к пептиду согласно настоящему изобретению. Еще в одном предпочтительном варианте осуществления та же терминология относится к пептидам или полипептидам, имеющим менее 6 аминокислотных остатков в дополнение к одному из пептидов согласно настоящему изобретению. В другом предпочтительном варианте осуществления та же терминология относится к пептидам или полипептидам, имеющим менее 4 аминокислотных остатков в дополнение к одному из пептидов согласно настоящему изобретению. В наиболее предпочтительном варианте осуществления та же терминология относится к пептидам или полипептидам, имеющим менее 2 аминокислотных остатков в дополнение к одному из пептидов согласно настоящему изобретению.
Подробное описание
Пептиды легко могут быть синтезированы стандартными синтетическими способами из L-аминокислот, а также могут быть синтезированы методами генной инженерии с использованием нуклеиновых кислот, имеющих последовательности, кодирующие конкретные пептиды.
I. Биологическая активность
Для исследования возможной биологической активности пептидов изучали иммунологическое действие пептидов на животной модели с помощью методик, соответствующих «Принципам доклинического исследования новых лекарственных средств», выпущенным Министерством Здравоохранения Народной республики Китай[1].
Для обнаружения какого-либо возможного влияния пептидов на специфическую клеточную иммунную функцию использовали тест трансформации Т-лимфоцитов, тест цитотоксической активности NK клеток и тест секреции Т лимфоцитами IL-2 и IFN-γ. Тест очистки частицами угля использовали для обнаружения какого-либо возможного влияния пептидов на неспецифическую клеточную иммунную функцию. Гемолиз овечьих эритроцитов (SRBC) использовали для обнаружения какого-либо возможного влияния пептидов на гуморальную иммунную функцию. Тест со взвешиванием иммунного органа использовали для обнаружения какого-либо возможного влияния пептидов на органном уровне.
В таком исследовании группу, получающую физиологический раствор, использовали в качестве отрицательного контроля, тогда как группы, получающие IL-2 и IFN-γ, использовали в качестве положительных контролей, поскольку IL-2 и IFN-γ представляют собой хорошо известные иммуностимуляторы[10]. В таком исследовании использовали четыре произвольных концентрации образцов пептидов для того, чтобы перекрыть 1000-кратный диапазон дозировки. Из-за внутренней сложности иммунологического ответа in vivo и отсутствия предшествующих данных по ответной реакции в зависимости от дозировки, в качестве положительной биологической активности рассматривали любое статистически значимое различие относительно отрицательного контроля в любой из групп дозировки.
Результаты данного исследования были следующими:
1. Установлено, что пептиды СМS001, СМS002, СМS003, СМS007, СМS008, СМS009, СМS010, СМS011, СМS012, СМS015, СМS019, СМS021, СМS029 и СМS034 способны усиливать трансформацию Т-лимфоцитов, проявляя статистически значимое различие при сравнении с нормальной контрольной группой, получающей физиологический раствор. Также установлено, что пептиды СМS014 и СМS036 способны ингибировать трансформацию Т лимфоцитов, проявляя статистически значимое различие при сравнении с нормальной контрольной группой, получающей физиологический раствор.
2. Установлено, что пептиды СМS001, СМS002, СМS003, СМS008, СМS009, СМS010, СМS011, СМS012, СМS013, СМS015, СМS016, СМS020, СМS021, СМS022, СМS023, СМS024, СМS026, СМS027, СМS028, СМS029, СМS030, СМS032, СМS033, СМS034, СМS035 и СМS036 способны увеличивать цитотоксическую активность NK клеток, проявляя статистически значимое различие при сравнении с нормальной контрольной группой, получающей физиологический раствор. Также установлено, что пептиды СМS008 и СМS012 в подходящей концентрации способны снижать цитотоксическую активность NK клеток, проявляя статистически значимое различие при сравнении с нормальной контрольной группой, получающей физиологический раствор.
3. Установлено, что пептиды СМS001, СМS003, СМS007, СМS009, СМS010, СМS011, СМS012, СМS015, СМS020, СМS022 и СМS034 способны усиливать секрецию интерлейкина-2 (IL-2) Т-лимфоцитами, проявляя статистически значимое различие при сравнении с нормальной контрольной группой, получающей физиологический раствор.
4. Установлено, что пептиды СМS001, СМS003, СМS009, СМS010, СМS011, СМS012, СМS013, СМS016, СМS021, СМS022 и СМS028 способны усиливать секрецию IFN Т-лимфоцитами, проявляя статистически значимое различие при сравнении с нормальной контрольной группой, получающей физиологический раствор.
5. Установлено, что пептиды СМS001, СМS002, СМS003, СМS007, СМS008, СМS009, СМS010, СМS011, СМS012, СМS013, СМS014, СМS015, СМS016, СМS018, СМS019, СМS020, СМS021, СМS022, СМS023, СМS024, СМS026, СМS027, СМS028, СМS029, СМS030, СМS032, СМS033, СМS034, СМS035 и СМS036 способны усиливать синтез анти-SRBC антител при антигенной стимуляции, проявляя статистически значимое различие при сравнении с нормальной контрольной группой, получающей физиологический раствор. Также установлено, что пептиды СМS002, СМS003, СМS009, СМS010, СМS011, СМS013, СМS014, СМS015, СМS018, СМS019, СМS020, СМS026, СМS028, СМS029, СМS030, СМS034 и СМS036 в подходящей концентрации способны ингибировать синтез анти-SRBC антител при антигенной стимуляции, проявляя статистически значимое различие при сравнении с нормальной контрольной группой, получающей физиологический раствор.
6. Установлено, что пептиды СМS003, СМS008, СМS009, СМS010, СМS011, СМS013, СМS016, СМS018, СМS019, СМS020, СМS022, СМS024, СМS027, СМS030, СМS035, СМS036 способны усиливать фагоцитарную активность моноядерных фагоцитов, проявляя статистически значимое различие при сравнении с нормальной контрольной группой, получающей физиологический раствор.
7. Установлено, что пептиды СМS001, СМS002, СМS008, СМS010, СМS012, СМS013, СМS014, СМS015, СМS016, СМS018, СМS019, СМS020, СМS021, СМS022, СМS023, СМS024, СМS026, СМS027, СМS028, СМS029, СМS030, СМS032, СМS033, СМS034, СМS035 и СМS036 способны увеличивать вес вилочковой железы, проявляя статистически значимое различие при сравнении с нормальной контрольной группой, получающей физиологический раствор.
8. Установлено, что пептиды СМS019, СМS020 и СМS030 способны увеличивать вес селезенки, проявляя статистически значимое различие при сравнении с нормальной контрольной группой, получающей физиологический раствор. Также было установлено, что пептиды СМS001, СМS003, СМS007, СМS008, СМS009, СМS010, СМS011, СМS013, СМS014, СМS015, СМS021, СМS023, СМS024, СМS027, СМS029 и СМS036 в подходящей концентрации способны снижать вес селезенки, проявляя статистически значимое различие при сравнении с нормальной контрольной группой, получающей физиологический раствор.
Ниже описаны материалы и методы, использованные для анализа влияния пептидов на мышах:
Материалы:
1. Экспериментальное животное
Мыши BALB/c, вес 18-22 г, 50% самок и 50% самцов, предоставлены Центром экспериментальных животных, Национальный Институт медицинских наук (National Institute of Medical Science), КНР.
2. Введение
Группа рекомбинантного мышиного IFN-γ(rmIFN-γ): 3×105 МЕ/кг/день
Группа рекомбинантного человеческого IL (rhIL)-2: 3×105 МЕ/кг/день
Группа физиологического раствора: 0,5 мл/каждый день
дозы пептида в I группе: 500 мкг/кг/день
дозы пептида во II группе: 50 мкг/кг/день
дозы пептида в III группе: 5 мкг/кг/день
дозы пептида в IV группе: 0,5 мкг/кг/день
Все вышеуказанные вещества растворяли в 0,5 мл физиологического раствора и вводили внутрибрюшинно (i.p.) непрерывно в течение 15 дней, один раз в день.
3. Основные реагенты
Пептиды были произведены обычным образом American Peptide Company, Inc., США
Фетальная телячья сыворотка и клеточная культуральная среда RPMI-1640 от Gibco, США
MTT и ConA, Sigma, США
rmIFN-γ, Beijing Biotech Inc., Китай
rhIL-2, Shanghai Huaxin Biotech Inc., Китай
Раствор для отделения лимфоцитов, Научно-исследовательский институт Гематологических заболеваний, Национальный институт медицинских наук, КНР.
Вирус везикулярного стоматита (VSV), IFN-γ и IL-2 стандартные образцы, Национальный Институт контроля фармацевтических и биологических продуктов, КНР.
НТ-2 клетки и L929 клетки, дар Профессора WF Chen, факультет иммунологии Пекинского Университета Beijing, КНР.
Метод
1. Влияние пептидов на клеточный иммунитет
1.1. Получение суспензии клеток селезенки [1,2]
Мышей BALB/c случайным образом распределяли на группы пептида, IFN, IL-2 и физиологического раствора. Десять мышей на группу. Через день после последнего введения исследуемого вещества мышей убивали, смещая шейные позвонки. Селезенку удаляли в асептических условиях и вручную диспергировали в холодном растворе D-Hank с использованием иглы для инъекций. Диспергированную клеточную суспензию дополнительно пропускали через сито 100 калибра из нержавеющей стали диаметром 150 мкм. После центрифугирования при 200g в течение 10 минут супернатант (надосадочную жидкость) отбрасывали. Осадок клеток повторно суспендировали в 10 объемах буфера Tris-NH4Cl и затем оставляли на 10 минут при комнатной температуре. Суспендированные клетки собирали центрифугированием при 150g в течение 10 минут. Клетки промывали 2-4 раза холодным раствором D-Hank путем ресуспендирования и центрифугирования при описанных выше условиях. Промытые клетки затем разводили до желаемой плотности клеток с использованием культуральной среды RPMI-1640, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки.
1.2. Влияние пептидов на трансформацию Т-лимфоцитов
Клетки селезенки плотностью 1×106 мл помещали в 96-луночные планшеты для клеточных культур, 100 мкл/лунку, три параллельных лунки для каждого анализируемого образца и контрольный образец для каждой мыши. В анализируемые лунки добавляли 100 мкл/лунку ConA раствора 100 мкг/мл в RPMI-1640 и 100 мкл/лунку просто RPMI-1640 использовали для контроля. Клетки инкубировали в течение 66 часов при 37°С, 5% СО2. Клетки затем осаждали центрифугированием при 150g в течение 10 минут. Супернатант собирали и хранили при -20°С для определения цитокинов IL-2 и IFN.
50 мкл/лунку МТТ раствора 1 мг/мл в RPMI-1640 добавляли к осадку клеток и клетки повторно суспендировали встряхиванием в течение 2 минут. Инкубацию продолжали в течение 4 часов. Супернатант отбрасывали после центрифугирования при 150g в течение 10 минут. 120 мкл 40 мМ HCl в пропаноле-2 добавляли к осадку клеток и встряхивали в течение 3 минут для получения ОП570нм для каждой лунки, нормированной для 630 нм. Использовали ридер ELISA.
Расчеты:
Для каждой мыши формировали три анализируемых лунки и три контрольных лунки. Индекс стимуляции (SI) для каждой мыши получали, первоначально получая среднюю ОП (оптическую плотность) для трех параллельных лунок, а затем деля значение для анализируемых лунок на значение для контрольных лунок.
1.3. Влияние пептидов на NK клеточную активность[3,4]
Получали мышиные клетки селезенки плотностью 4×106 мл, как описано выше в разделе 1.1. Клетки-мишени YAC-1 брали в логарифмической фазе и доводили до 1×105 мл. С использованием 96-луночных планшетов для культур клеток 100 мкл клеток мышиной селезенки и 100 мкл культуральной среды добавляли в контрольную лунку, содержащую только клетки селезенки; 100 мкл клеток-мишеней и 100 мкл культуральной среды добавляли в контрольную лунку, содержащую только клетки-мишени; 100 мкл клеток мышиной селезенки и 100 мкл клеток-мишеней добавляли в лунки для анализа NK активности. Готовили три параллельных серии вышеуказанных лунок на мышь.
Образцы центрифугировали при 150 g в течение 10 минут для того, чтобы собрать клетки. Супернатант отбрасывали и добавляли 50 мкл/лунку МТТ раствора 1 мг/мл. Реакционную смесь затем встряхивали в течение 2 минут и инкубировали при 37°С, 5% СО2 в течение 4 часов. Супернатант отбрасывали после центрифугирования при 150g в течение 10 минут. Добавляли 120 мкл 40 мМ HCl в пропаноле-2 и встряхивали в течение 3 минут. Ридер ELISA использовали для получения ОП570нм для каждой лунки, нормированной для 630 нм.
Расчеты:
Для каждой мыши имелось 9 лунок: три лунки с клетками селезенки - только контроль, три с клетками-мишенями - только контроль и три анализируемых лунки как с клетками селезенки, так и с клетками-мишенями. Индекс NK клеточной активности для каждой мыши получали, первоначально получая среднюю ОП для трех параллельных лунок каждой комбинации, затем используя такую среднюю ОП в следующей формуле:
Индекс активности NK клеток = [1-(средняя ОП лунки с клетками селезенки и клетками-мишенями - средняя ОП лунки только с клетками селезенки)+(средняя ОП лунки только с клетками-мишенями)]×100%.
1.4. Влияние пептидов на активность Т-лимфоцитов при секретировании IL-2 [5].
НТ-2 клетки в логарифмической фазе собирали центрифугированием при 150g в течение 10 минут и промывали три раза холодным раствором Хенка с помощью повторного суспендирования и центрифугирования. Собранные НТ-2 клетки повторно суспендировали в RPMI-1640 и инкубировали при 37°С, 5% СО2 в течение 30 минут. Клетки дополнительно промывали дважды RPMI-1640 с помощью повторного суспендирования и центрифугирования и ресуспендировали до конечной концентрации 2×105/мл в среде RPMI-1640.
Полученный в разделе 1.2 супернатант разводили средой RPMI-1640 до следующих процентных концентраций: 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25% и 3,125%.
rIL-2 разводили средой RPMI-1640 до следующих концентраций: 500 МЕ/мл, 250 МЕ/мл, 125 МЕ/мл, 62,5 МЕ/мл, 31,25 МЕ/мл и 15,5 МЕ/мл.
В 96-луночном планшете для клеточных культур использовали три параллельные лунки для комбинации:
Отрицательный контроль: 100 мкл RPMI-1640+100 мкл суспензии НТ-2 клеток
rIL-2 стандарт: 100 мкл раствора rIL-2+100 мкл суспензии НТ-2 клеток
Анализируемая лунка: 100 мкл разведенного супернатанта+100 мкл суспензии НТ-2 клеток
Планшет инкубировали при 37°С, 5% СО2 в течение 68 часов, затем центрифугировали при 150g в течение 15 минут и супернатант удаляли. В каждую лунку добавляли 100 мкл 0,5 мг/мл МТТ в RPMI-1640 без фенолсульфонафталина. После встряхивания в течение 3-4 минут для ресуспендирования клеток продолжали инкубирование дополнительно в течение 4 часов. Затем образцы центрифугировали при 150g в течение 15 минут и супернатант удаляли. В каждую лунку добавляли 120 мкл 40 мМ HCl в 2-пропаноле, перемешивали в течение 3-4 минут и с использованием планшетного ридера ELISA анализировали ОП при 570 нм, нормированную для 630 нм.
Расчет:
Брали среднее значение ОП для трех параллельных лунок для каждого разведения и строили график относительно концентрации на полулогарифмической шкале, откладывая концентрацию по оси Х. Получали значение концентрации при 50% насыщении ОП как для тестируемого супернатанта, так и для rIL-2.
IL-2 активность образца = (разведение образца при 50% максимальной активности ÷ стандартное разведение rIL-2 при 50% максимальной активности)(активность rIL-2 стандарта при 50% максимальной активности (МЕ/мл).
1.5. Влияние пептидов на активность Т-лимфоцитов при секретировании интерферона (IFN) [6]
Супернатант, полученный в разделе 1.2, разводили культуральной средой RPMI-1640 до следующих процентных концентраций: 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25% и 3,125%.
Стандарт рекомбинантного интерферона (rIFN) разводили средой RPMI-1640 до следующих концентраций: 500 МЕ/мл, 250 МЕ/мл, 125 МЕ/мл, 62,5 МЕ/мл, 31,25 МЕ/мл и 15,5 МЕ/мл.
Клетки-мишени L929 в логарифмической фазе доводили до концентрации 2×105/мл средой RPMI-1640 при такой же обработке, как описано в разделе 1.4 для клеток НТ-2. Исходный VSV также доводили до 100 TCID50 средой RPMI-1640.
В 96-луночном планшете для клеточных культур использовали три параллельные лунки для комбинации:
Отрицательный контроль: 150 мкл RPMI-1640+100 мкл L929
Лунка положительного контроля: 100 мкл раствора RPMI-1640+100 мкл L929+50 мкл VSV
Лунка активности rIFN: 100 мкл rIFN стандарта+100 мкл L929+50 мкл VSV
Анализируемая лунка: 100 мкл разведенного супернатанта+100 мкл L929+50 мкл VSV
Образцы инкубировали при 37°С, 5% СО2 в течение 24 часов. Лунки положительного контроля периодически наблюдали в обращенном микроскопе для подтверждения лизиса клеток, затем собирали, промывали и ОП всех лунок считывали, как описано в разделе 1.4.
Расчет:
Концентрации при 50% максимальной активности получали таким же образом, как в разделе 1.4. Рассчитывали IFN активность образца следующим образом:
IFN активность образца = (разведение образца при 50% максимальной активности ÷ стандартное разведение rIFN при 50% максимальной активности)(активность rIFN стандарта при 50% максимальной активности (МЕ/мл).
2. Влияние пептидов на образование антител[7]
Получали эритроциты овец (SRBC), собирая кровь из шейной вены и помещая ее в стерильную колбу со стеклянными шариками. Колбу встряхивали в течение 3 минут и затем кровь смешивали с раствором Альзевера (Alsever) (глюкоза 2,05 г, NaCl 0,4 г, лемонад Na 0,8 г, доводили до 100 мл дистиллированной водой) и хранили при 4°С.Непосредственно перед использованием образцы центрифугировали при 130g в течение 5 минут, собирая SRBC. Клетки дважды промывали ресуспендированием и центрифугированием в нормальном физиологическом растворе. Затем осадок клеток собирали центрифугированием при 180g в течение 10 минут и повторно суспендировали в физиологическом растворе, получая конечную рабочую суспензию SRBC, 2% (об/об).
Комплемент получали, добавляя 10 объемов свежей сыворотки крови морской свинки к одному объему уплотненного на центрифуге SRBC и затем осторожно встряхивая в течение 30 минут при 4°С. SRBC удаляли центрифугированием при 200g в течение 10 минут. Для получения рабочего комплементного раствора добавляли 10 объемов обычного физиологического раствора.
Мышей BALB/c случайным образом распределяли на группу пептида, IFN группу, IL-2 группу и группу, получающую физиологический раствор, 10 мышей на группу. Тестируемые вещества вводили, как описано в разделе 1.1, плюс внутрибрюшинная инъекция 0,2 мл SRBC на мышь на 12 день. Через день после последнего введения тестируемого вещества (16 день) собирали кровь из угла глазной щели и оставляли при комнатной температуре на один час для выделения сыворотки крови. После центрифугирования при 200g в течение 10 минут сыворотку крови разводили в 500 раз с использованием обычного физиологического раствора.
К 1 мл разведенной мышиной сыворотки крови для каждой мыши добавляли 0,5 мл суспензии SRBC. Охлаждали на льду. Затем добавляли 1 мл рабочего раствора комплемента и инкубировали при 37°С на водяной бане в течение 10 минут. Реакцию останавливали охлаждением льдом. Затем образцы центрифугировали при 200g в течение 10 минут, получая супернатант.
К 1 мл данного супернатанта добавляли 3 мл раствора Драбкина (Drabkin) и оставляли при комнатной температуре на 10 минут. Получали ОП540нм.
Расчет:
Стандартизированную ОП540нм получали, смешивая 0,25 мл суспензии SRBC с раствором Драбкина до 4 мл и оставляя смесь на 10 минут перед получением ОП540 нм.
Индекс сыворотки образца = (ОП540нм тестируемого образца (стандартизированная ОП540нм)×500
3. Влияние пептидов на фагоцитарную функцию моноядерного фагоцита и вес иммунного органа [8,9]
На следующий день после последнего введения исследуемого вещества (16 день) мышам делали инъекцию туши из расчета 0,1 мл/кг веса тела (5-кратное разведение обычным физиологическим раствором) в хвостовую вену.
Через одну минуту и пять минут после инъекции туши отбирали 20 мкл крови из угла глазной щели с помощью гепаринизированной трубки. Кровь смешивали с 2 мл 0,1% вес/об раствора Na2CO3 и затем получали ОП680нм. Основной индекс выведения К рассчитывали по следующей формуле:
K=(lgA1-lgA2)+(t2-t1)
Ключ:
А1: ОП680 нм на первой минуте
А2: ОП680 нм на пятой минуте
t2: 5 минут
t1: 1 минута
Через день после последнего введения исследуемого вещества (16 день) печень, селезенку и вилочковую железу отделяли, промокали досуха фильтровальной бумагой и взвешивали. Фагоцитарный индекс (рассчитывали, как показано ниже:
α=(3√К)×(W÷WLS)
Ключ:
W: вес тела
WLS: вес печени плюс селезенка
Индекс вилочковой железы (%)=(вес вилочковой железы/вес тела)×100%
Индекс селезенки (%)=(вес селезенки/вес тела)×100%
Результаты
Из-за большого количества включенных «исходных» данных представлены только компилированные конечные результаты. Группы, не имевшие статистически значимого отличия от отрицательного контроля с группой, получающей физиологический раствор, также опущены.
1. Влияние пептидов на трансформацию Т-лимфоцитов
Установлено, что в дозе 500 мкг/кг/день СМS002, СМS007, СМS008, СМS010, СМS012, СМS015, СМS019, СМS021 и CMS029 способны усиливать трансформацию Т-лимфоцитов, проявляя статистически значимое различие при сравнении с группой, получающей физиологический раствор (Р<0,05). Показано, что среди данных пептидов СМS010 и СМS015 статистически значимо отличаются от группы IFN-γ и IL-2 группы (Р<0,05), как показано ниже в таблице 1.
@сравнение с IFN-γ группой Р<0,05
∧сравнение с IL-2 группой Р<0,05
Установлено, что в дозе 50 мкг/кг/день СМS001, СМS002 и CMS003 способны стимулировать трансформацию Т-лимфоцитов, проявляя статистически значимое различие при сравнении с группой, получающей физиологический раствор, IFN-γ группой и IL-2 группой (Р<0,05). Показано, что СМS014 и СМS036 способны ингибировать трансформацию Т лимфоцитов, проявляя статистически значимое различие при сравнении с группой, получающей физиологический раствор (Р<0,05). Подробные данные приведены ниже в таблице 2.
@сравнение с IFN-γ группой Р<0,05
∧сравнение с IL-2 группой Р<0,05
Установлено, что в дозе 5 мкг/кг/день СМS001, СМS003, СМS007 и CMS034 способны стимулировать трансформацию Т-лимфоцитов, проявляя статистически значимое различие при сравнении с группой, получающей физиологический раствор (Р<0,05), как показано в таблице 3.
Установлено, что в дозе 0,5 мкг/кг/день СМS008, СМS010 и CMS011 способны стимулировать трансформацию Т-лимфоцитов, проявляя статистически значимое различие при сравнении с группой, получающей физиологический раствор (Р<0,05), как показано в таблице 4.
2. Влияние пептида на цитотоксическую активность NK клеток
Установлено, что в дозе 500 мкг/кг/день СМS010, СМS013, СМS016, СМS023, СМS024, СМS026, СМS027, СМS028, СМS029, СМS030, СМS032, СМS033, СМS034, СМS035 и CMS036 способны увеличивать цитотоксическую активность NK клеток, проявляя статистически значимое различие при сравнении с группой, получающей физиологический раствор (Р<0,05). Показано, что среди данных пептидов СМS010, СМS016 и СМS030 проявляют статистически значимое различие с IFN-γ группой и IL-2 группой (Р<0,05), как показано таблице 5.
* сравнение с группой, получающей физиологический раствор, Р<0,05
@ сравнение с IFN-γ группой Р<0,05
^ сравнение с IL-2 группой Р<0,05
Установлено, что в дозе 50 мкг/кг/день СМS001, СМS003, СМS015, СМS021, СМS026 и CMS035 способны увеличивать цитотоксическую активность NK клеток, проявляя статистически значимое различие при сравнении с группой, получающей физиологический раствор (Р<0,05). Показано, что среди данных пептидов СМS021 проявляет статистически значимое различие с IFN-γ группой и IL-2 группой (Р<0,05). Показано, что СМS012 способен ингибировать цитотоксическую активность NK клеток, проявляя статистически значимое различие при сравнении с группой, получающей физиологический раствор (Р<0,05). Подробные данные приведены ниже в таблице 6.
* сравнение с группой, получающей физиологический раствор, Р<0,05
@ сравнение с IFN-γ группой Р<0,05
^ сравнение с IL-2 группой Р<0,05
Установлено, что в дозе 5 мкг/кг/день СМS008, СМS009, СМS010, СМS011, СМS012, СМS020, СМS024, СМS034 и CMS036 способны увеличивать цитотоксическую активность NK клеток, проявляя статистически значимое различие при сравнении с группой, получающей физиологический раствор (Р<0,05). Показано, что среди данных пептидов СМS008 и СМS009 проявляют статистически значимое различие с IFN-γ группой и IL-2 группой (Р<0,05), как показано в таблице 7.
* сравнение с группой, получающей физиологический раствор, Р<0,05
@ сравнение с IFN-γ группой Р<0,05
^ сравнение с IL-2 группой Р<0,05
Установлено, что в дозе 0,5 мкг/кг/день СМS002, СМS011, СМS012, СМS022, СМS028 и CMS035 способны увеличивать цитотоксическую активность NK клеток, проявляя статистически значимое различие при сравнении с группой, получающей физиологический раствор (Р<0,05). Найдено, что СМS008 способен ингибировать цитотоксическую активность NK клеток, проявляя статистически значимое различие при сравнении с группой, получающей физиологический раствор (Р<0,05). Подробные данные приведены ниже в таблице 8.
* сравнение с группой, получающей физиологический раствор, Р<0,05
3. Влияние пептидов на активность Т-лимфоцита при секреции IL-2
Установлено, что в дозе 500 мкг/кг/день СМS007, СМS009, СМS010 и CMS015 способны стимулировать секрецию IL-2 Т-лимфоцитами, проявляя статистически значимое различие при сравнении с группой, получающей физиологический раствор (Р<0,05). Показано, что среди данных пептидов СМS007 и СМS015 статистически значимо отличаются от группы IL-2 (Р<0,05). Также установлено, что СМS009 и СМS010 проявляют статистически значимое различие при сравнении как с IFN-γ группой, так и с IL-2 группой, как показано в таблице 9.
* сравнение с группой, получающей физиологический раствор, Р<0,05
@ сравнение с IFN-γ группой Р<0,05
^ сравнение с IL-2 группой Р<0,05
Установлено, что в дозе 50 мкг/кг/день СМS001 и CMS003 способны стимулировать активность Т-лимфоцитов для секреции IL-2, проявляя статистически значимое различие при сравнении с группой, получающей физиологический раствор (Р<0,05). Установлено, что среди данных пептидов СМS003 статистически значимо отличается от группы IL-2 (Р<0,05), как показано в таблице 10.
* сравнение с группой, получающей физиологический раствор, Р<0,05
^ сравнение с IL-2 группой Р<0,05
Установлено, что в дозе 5 мкг/кг/день СМS007, СМS012 и CMS020 способны стимулировать Т-лимфоциты к секреции IL-2, проявляя статистически значимое различие при сравнении с группой, получающей физиологический раствор (Р<0,05), как показано в таблице 11.
* сравнение с группой, получающей физиологический раствор, Р<0,05
Установлено, что в дозе 0,5 мкг/кг/день СМS010, СМS011, СМS012, СМS022 и CMS034 способны стимулировать Т-лимфоциты к секреции IL-2, проявляя статистически значимое различие при сравнении с группой, получающей физиологический раствор (Р<0,05). Установлено, что среди данных пептидов СМS034 имеет статистически значимое различие с группой IL-2 (Р<0,05). Также установлено, что СМS011 и СМS022 проявляют статистически значимое различие при сравнении как с IFN-γ группой, так и с IL-2 группой, как показано в таблице 12.
* сравнение с группой, получающей физиологический раствор, Р<0,05
@ сравнение с IFN-γ группой Р<0,05
^ сравнение с IL-2 группой Р<0,05
4. Влияние пептидов на активность Т-лимфоцитов при секреции IFN
Установлено, что в дозе 500 мкг/кг/день СМS010, СМS013 и CMS016 способны стимулировать Т-лимфоциты к секреции IFN (интерферона), проявляя статистически значимое различие при сравнении с группой, получающей физиологический раствор, IFN-γ группой, и IL-2 группой, (Р<0,05), как показано в таблице 13.
* сравнение с группой, получающей физиологический раствор, Р<0,05
@ сравнение с IFN-γ группой Р<0,05
^ сравнение с IL-2 группой Р<0,05
Установлено, что в дозе 50 мкг/кг/день СМS001, СМS003 и CMS021 способны стимулировать Т-лимфоциты к секреции IFN, проявляя статистически значимое различие при сравнении с группой, получающей физиологический раствор (Р<0,05). Установлено, что среди данных пептидов СМS021 имеет статистически значимое различие при сравнении с IFN-γ группой и с IL-2 группой, как показано в таблице 14.
* сравнение с группой, получающей физиологический раствор, Р<0,05
@ сравнение с IFN-γ группой Р<0,05
^ сравнение с IL-2 группой Р<0,05
Установлено, что в дозе 5 мкг/кг/день СМS009 и CMS012 способны стимулировать секрецию IFN Т-лимфоцитами, проявляя статистически значимое различие при сравнении с группой, получающей физиологический раствор (Р<0,05). Показано, что среди данных пептидов СМS009 статистически значимо отличается от группы IL-2 (Р<0,05), как показано в таблице 15.
* сравнение с группой, получающей физиологический раствор, Р<0,05
@ сравнение с IFN-γ группой Р<0,05
^ сравнение с IL-2 группой Р<0,05
Установлено, что в дозе 0,5 мкг/кг/день СМS010, СМS011, СМS022 и CMS028 способны стимулировать секрецию IFN Т-лимфоцитами, проявляя статистически значимое различие при сравнении с группой, получающей физиологический раствор (Р<0,05). Показано, что среди данных пептидов СМS010 и СМS022 статистически значимо отличаются от IFN-γ группы и IL-2 группы (Р<0,05), как показано в таблице 16.
* сравнение с группой, получающей физиологический раствор, Р<0,05
@ сравнение с IFN-γ группой Р<0,05
^ сравнение с IL-2 группой Р<0,05
5. Влияние пептидов на образование антител
Установлено, что в дозе 500 мкг/кг/день СМS002, СМS003, СМS007, СМS008, СМS009, СМS010, СМS011, СМS012, СМS013, СМS014, СМS015, СМS016, СМS018, СМS019, СМS020, СМS022, СМS023, СМS024, СМS029, СМS033 и СМS035 способны стимулировать образование анти-SRBC антитела, проявляя статистически значимое различие по сравнению с группой, получающей физиологический раствор (Р<0,05). Показано, что среди данных пептидов СМS002, СМS003, СМS007, СМS008, СМS013, СМS019, СМS024 и СМS035 статистически значимо отличаются от IFN-γ группы (Р<0,05). Также было обнаружено, что СМS009, СМS010, СМS011, СМS012, СМS014, СМS015, СМS016, СМS020, СМS023, СМS029 и СМS033 имеют статистически значимое различие как с IFN-γ группой, так и с IL-2 группой (Р<0,05), как показано в таблице 17.
* сравнение с группой, получающей физиологический раствор, Р<0,05
@ сравнение с IFN-γ группой Р<0,05
^ сравнение с IL-2 группой Р<0,05
Показано, что в дозе 50 мкг/кг/день СМS003, СМS011, СМS012, СМS013, СМS015, СМS021, СМS022, СМS023, СМS026, СМS027, СМS029, СМS030, СМS032, СМS033, СМS034, СМS035 и СМS036 способны стимулировать образование анти-SRBC антитела, проявляя статистически значимое различие по сравнению с группой, получающей физиологический раствор (Р<0,05). Установлено, что среди данных пептидов СМS011, СМS013 и СМS015 статистически значимо отличаются от IFN-γ группы (Р<0,05). Также было обнаружено, что СМS021, СМS022, СМS023, СМS026, СМS027, СМS029, СМS030, СМS032, СМS033, СМS034, СМS035 и СМS036 имеют статистически значимое различие как с IFN-γ группой, так и с IL-2 группой (Р<0,05). Установлено, что СМS009 способен ингибировать образование анти-SRBC антитела, проявляя статистически значимое различие по сравнению с группой, получающей физиологический раствор (Р<0,05). Подробные данные приведены ниже в таблице 18.
* сравнение с группой, получающей физиологический раствор, Р<0,05
@ сравнение с IFN-γ группой Р<0,05
^ сравнение с IL-2 группой Р<0,05
Установлено, что в дозе 5 мкг/кг/день СМS001, СМS003, СМS007, СМS008, СМS009, СМS011, СМS012, СМS013, СМS015, СМS016, СМS019, СМS020, СМS021, СМS023, СМS024, СМS026, СМS027, СМS028, СМS029, СМS030, СМS032, СМS033, СМS034, СМS035 и СМS036 способны стимулировать образование анти-SRBC антитела, проявляя статистически значимое различие по сравнению с группой, получающей физиологический раствор (Р<0,05). Показано, что среди данных пептидов СМS003, СМS008, СМS009, СМS012, СМS015, СМS016, СМS020 и СМS021 статистически значимо отличаются от IFN-γ группы (Р<0,05). Также было обнаружено, что СМS001, СМS007, СМS011, СМS019, СМS023, СМS024, СМS026, СМS027, СМS028, СМS029, СМS030, СМS032, СМS033, СМS034, СМS035 и СМS036 имеют статистически значимое различие как с IFN-γ группой, так и с IL-2 группой (Р<0,05), как показано в таблице 19.
* сравнение с группой, получающей физиологический раствор, Р<0,05
@ сравнение с IFN-γ группой Р<0,05
∧сравнение с IL-2 группой Р<0,05
Установлено, что в дозе 0,5 мкг/кг/день СМS021, СМS023, СМS024, СМS027 и СМS033 способны стимулировать образование анти-SRBC антитела, проявляя статистически значимое различие по сравнению с группой, получающей физиологический раствор (Р<0,05). Показано, что среди данных пептидов СМS021 и СМS033 статистически значимо отличаются от IFN-γ группы (Р<0,05). Также было обнаружено, что СМS023, СМS024 и СМS027 имеют статистически значимое различие как с IFN-γ группой, так и с IL-2 группой (Р<0,05). Кроме того, показано, что СМS002, СМS003, СМS009, СМS010, СМS011, СМS013, СМS014, СМS015, СМS018, СМS019, СМS020, СМS026, СМS028, СМS029, СМS030, СМS034 и СМS036 способны ингибировать образование анти-SRBC антитела, проявляя статистически значимое различие по сравнению группой, получающей физиологический раствор (Р<0,05). Подробные данные приведены ниже в таблице 20.
* сравнение с группой, получающей физиологический раствор, Р<0,05
@ сравнение с IFN-γ группой Р<0,05
^ сравнение с IL-2 группой Р<0,05
6. Влияние пептидов на фагоцитарную активность моноядерного фагоцита.
Установлено, что в дозе 500 мкг/кг/день СМS003, СМS008, СМS020, СМS022 и СМS024 способны усиливать фагоцитарную активность моноядерного фагоцита, имея статистически значимое различие по сравнению с группой, получающей физиологический раствор (Р<0,05). Установлено, что среди данных пептидов СМS022 имеет статистически значимое различие как с IFN-γ группой, так и с IL-2 группой (Р<0,05), как показано в таблице 21.
* сравнение с группой, получающей физиологический раствор, Р<0,05
@ сравнение с IFN-γ группой Р<0,05
^ сравнение с IL-2 группой Р<0,05
Установлено, что в дозе 50 мкг/кг/день СМS019, СМS024 и СМS030 способны усиливать фагоцитарную активность моноядерного фагоцита, имея статистически значимое различие по сравнению с группой, получающей физиологический раствор (Р<0,05). Установлено, что среди данных пептидов СМS019 имеет статистически значимое различие с IL-2 группой (Р<0,05), как показано в таблице 22.
* сравнение с группой, получающей физиологический раствор, Р<0,05
^ сравнение с IL-2 группой Р<0,05
Установлено, что в дозе 5 мкг/кг/день СМS003*, СМS008, СМS009, СМS010, СМS011, СМS013, СМS016, СМS018, СМS019 и СМS035 способны усиливать фагоцитарную активность моноядерного фагоцита, имея статистически значимое различие по сравнению с группой, получающей физиологический раствор (Р<0,05). Установлено, что среди данных пептидов СМS003, СМS009, СМS010, СМS016, СМS019 и СМS035 имеют статистически значимое различие с IL-2 группой (Р<0,05), как показано в таблице 23.
* сравнение с группой, получающей физиологический раствор, Р<0,05
^ сравнение с IL-2 группой Р<0,05
Установлено, что в дозе 0,5 мкг/кг/день СМS024, СМS027 и СМS036 способны усиливать фагоцитарную активность моноядерного фагоцита, проявляя статистически значимое различие по сравнению с группой, получающей физиологический раствор (Р<0,05). Установлено, что среди данных пептидов СМS024 имеет статистически значимое различие с IL-2 группой (Р<0,05), как показано в таблице 24.
* сравнение с группой, получающей физиологический раствор, Р<0,05
^ сравнение с IL-2 группой Р<0,05
7. Влияние пептидов на вес иммунного органа
Установлено, что в дозе 500 мкг/кг/день СМS008, СМS010, СМS016, СМS019, СМS020, СМS022, СМS026, СМS027, СМS028, СМS029, СМS030, СМS032, СМS033, СМS034, СМS035 и СМS036 способны увеличивать вес вилочковой железы, проявляя статистически значимое различие по сравнению с группой, получающей физиологический раствор (Р<0,05). Установлено, что среди данных пептидов СМS027 и СМS034 имеют статистически значимое различие с IL-2 группой (Р<0,05). Также установлено, что СМS008, СМS022, СМS029, СМS030, СМS032, СМS033 и СМS035 имеют статистически значимое различие как с IFN-γ группой, так и с IL-2 группой (Р<0,05), как показано в таблице 25.
* сравнение с группой, получающей физиологический раствор, Р<0,05
@ сравнение с IFN-γ группой Р<0,05
^ сравнение с IL-2 группой Р<0,05
Установлено, что в дозе 500 мкг/кг/день СМS019 способен увеличивать вес селезенки со статистически значимым различием по сравнению с контрольной группой, получающей физиологический раствор (Р<0,05), как показано в таблице 26. Установлено, что СМS001, СМS003, СМS007, СМS009, СМS011, СМS013, СМS014, СМS015, СМS021, СМS023, СМS024, СМS027 и СМS036 способны снижать вес селезенки со статистически значимым различием по сравнению с контрольной группой, получающей физиологический раствор (Р<0,05). Подробные данные приведены ниже в таблице 26.
* сравнение с группой, получающей физиологический раствор, Р<0,05
Установлено, что в дозе 50 мкг/кг/день СМS002, СМS008, СМS012, СМS014, СМS016, СМS018, СМS019, СМS020, СМS022, СМS023, СМS024, СМS026, СМS027, СМS028, СМS029, СМS030, СМS032, СМS033, СМS034 и СМS036 способны увеличивать вес вилочковой железы, проявляя статистически значимое различие по сравнению с группой, получающей физиологический раствор (Р<0,05). Установлено, что среди данных пептидов СМS034 имеет статистически значимое различие с IL-2 группой (Р<0,05). Также установлено, что СМS002, СМS008, СМS012, СМS014, СМS016, СМS018, СМS019, СМS020, СМS022, СМS023, СМS024, СМS026, СМS027, СМS030, СМS032 и СМS036 имеют статистически значимое различие как с IFN-γ группой, так и с IL-2 группой (Р<0,05), как показано в таблице 27.
* сравнение с группой, получающей физиологический раствор, Р<0,05
@ сравнение с IFN-γ группой Р<0,05
^ сравнение с IL-2 группой Р<0,05
Установлено, что в дозе 50 мкг/кг/день СМS008, СМS010 и СМS029 способны снижать вес селезенки со статистически значимым различием с группой, получающей физиологический раствор (Р<0,05). Подробные данные приведены ниже в таблице 28.
* сравнение с группой, получающей физиологический раствор, Р<0,05
Установлено, что в дозе 5 мкг/кг/день СМS001, СМS002, СМS010, СМS011, СМS012, СМS013, СМS014, СМS015, СМS016, СМS018, СМS019, СМS020, СМS021, СМS022, СМS023, СМS024, СМS026, СМS028, СМS029, СМS030, СМS32, СМS033, СМS034 и СМS036 способны увеличивать вес вилочковой железы, проявляя статистически значимое различие по сравнению с группой, получающей физиологический раствор (Р<0,05). Установлено, что среди данных пептидов СМS002, СМS014, СМS024 и СМS030 имеют статистически значимое различие с IL-2 группой (Р<0,05). Также установлено, что СМS010, СМS012, СМS018, СМS019, СМS020, СМS022, СМS026, СМS028, СМS032, СМS034 и СМS036 имеют статистически значимое различие как с IFN-γ группой, так и с IL-2 группой (Р<0,05), как показано в таблице 29.
* сравнение с группой, получающей физиологический раствор, Р<0,05
@ сравнение с IFN-γ группой Р<0,05
^ сравнение с IL-2 группой Р<0,05
Установлено, что в дозе 5 мкг/кг/день СМS030 способен увеличивать вес селезенки, имея статистически значимое различие с группой, получающей физиологический раствор (Р<0,05). Установлено, что СМS015 способен снижать вес селезенки, имея статистически значимое различие с группой, получающей физиологический раствор (Р<0,05). Подробные данные приведены ниже в таблице 30.
* сравнение с группой, получающей физиологический раствор, Р<0,05
Установлено, что в дозе 0,5 мкг/кг/день СМS002, СМS008, СМS010, СМS012, СМS014, СМS018, СМS020, СМS022, СМS026, СМS028, СМS030 и СМS032 способны увеличивать вес вилочковой железы, проявляя статистически значимое различие по сравнению с группой, получающей физиологический раствор (Р<0,05). Установлено, что среди данных пептидов СМS008 и СМS012 имеют статистически значимое различие с IL-2 группой (Р<0,05). Также установлено, что СМS002, СМS020 и СМS030 имеют статистически значимое различие как с IFN-γ группой, так и с IL-2 группой (Р<0,05), как показано в таблице 31.
* сравнение с группой, получающей физиологический раствор, Р<0,05
@ сравнение с IFN-γ группой Р<0,05
^ сравнение с IL-2 группой Р<0,05
Установлено, что в дозе 0,5 мкг/кг/день СМS020 способен увеличивать вес селезенки, имея статистически значимое различие с группой, получающей физиологический раствор, IFN-γ группой и IL-2 группой (Р<0,05). Установлено, что СМS001 способен снижать вес селезенки при статистически значимом различии с группой, получающей физиологический раствор (Р<0,05). Подробные данные приведены ниже в таблице 32.
* сравнение с группой, получающей физиологический раствор, Р<0,05
@ сравнение с IFN-γ группой Р<0,05
^ сравнение с IL-2 группой Р<0,05
В заключение, авторы настоящего изобретения обнаружили, что пептиды СМS001, СМS002, СМS003, СМS007, СМS008, СМS009, СМS010, СМS011, СМS012, СМS013, СМS014, СМS015, СМS016, СМS018, СМS019, СМS020, СМS021, СМS022, СМS023, СМS024, СМS026, СМS027, СМS028, СМS029, СМS030, СМS032, СМS033, СМS034, СМS035 и СМS036 обладают биологической активностью in vivo на протестированных животных моделях.
II. Антивирусное действие пептидов in vivo
Для того, чтобы установить, обладают ли данные пептиды возможным терапевтическим действием на вирусные инфекции, авторы настоящего изобретения использовали в таком исследовании животную модель утиного гепатита В для того, чтобы изучить влияние вышеуказанных пептидов in vivo на больных животных.
Получали модель гепатита В у уток Chongqing, которую обрабатывали пептидами с помощью внутрибрюшинных инъекций (50 мкг/кг/день, один раз в день) в течение 4 недель. Анализировали уровень DHBV ДНК гибридизацией сыворотки методом дот-блоттинга. Обработку ламивудином и обычным физиологическим раствором использовали в качестве положительного и отрицательного контроля соответственно. Установлено, что пептид CMS001 способен снижать уровень DHBV ДНК в сыворотке крови на 4-ю неделю обработки при статистически значимом различии с контрольной группой, получающей физиологический раствор (Р<0,05). Можно сделать вывод, что CMS001 при подходящем уровне дозировки можно использовать как часть или сам по себе для лечения инфекции вирусного гепатита.
Материалы и методы
1.Пептиды были синтезированы обычным образом American Peptide company, Inc., США, из L-аминокислот.
2. Животная модель [1]
Уткам Chongqing в возрасте одного дня инокулировали с помощью внутрибрюшинной инъекции 0,1 мл исходной сыворотки положительной по ДНК вируса утиного гепатита В (DHBV) (5х107 копий/мл). Через неделю собирали образцы крови из внешней яремной вены и подтверждали инфицирование гибридизацией методом дот-блоттинга с использованием DHBV ДНК зонда, меченного дигоксином[2]. Уток выращивали до 2-недельного возраста для начала исследования.
3. Деление на группы и обработка
DHBV инфицированных уток разбивали случайным образом на следующие группы
А) Группа отрицательного контроля (n=9): Обычный физиологический раствор вводили из расчета 1 мл на утку один раз в день.
b) Группа ламивудина (n=8): В качестве группы положительного контроля. Ламивудин[4] давали в дозе 50 мг/кг/день путем перорального введения один раз в день
с) Пептидная группа (n=9): 50 мкг/кг/день пептида (доводили до конечного объема 0,5-1 мл обычным физиологическим раствором) вводили один раз в день с помощью внутрибрюшинной инъекции.
Обработку продолжали в течение 4 недель и наблюдения продолжали еще в течение одной недели после окончания обработки. Образцы крови объемом 1 мл отбирали из внешней яремной вены уток в дни 0, 7, 14, 21, 28 и 35 после начала обработки. Сыворотку из образцов крови сразу же выделяли[3] и хранили при -20°С до анализа.
4. Определения уровня DHBV ДНК в сыворотке.
DHBV ДНК зонд был флуоресцентно помечен в соответствии с протоколом набора меток от производителя набора (Amersham Pharmacia Biotech Co.). 40 мкл утиной сыворотки крови подвергали дот-блоттингу (1 дубликатное пятно на образец) на нитроцеллюлозной мембране и гибридизировали флуоресцентно-меченым DHBV ДНК зондом для количественного определения[2]. После завершения гибридизации блотты проявляли в CDP-Star флуориметрическом реагенте RPN2690 и сканировали с использованием сканнера Vuego Scan (Brisa-620st). Программное обеспечение ImageMaster TotalLab v.1.11.Ink использовали для количественного анализа блоттов. Статистический анализ проводили в соответствии с парным t-тестом с использованием программного обеспечения SPSS.
Результаты
Титр DHBV ДНК в сыворотке крови перед и после обработки
Парный t-тест, сравнение с 0 днем для тех же животных: *P<0,05
Отрицательная (обычный физиологический раствор) и положительная (ламивудин) контрольные группы подтверждают успешное создание животной модели гепатита. Установлено, что в дозе 50 мкг/кг/день пептид CMS001 способен снижать титр DHBV ДНК в сыворотке крови через 4 недели обработки при статистически значимом различии (р<0,05) со значением для тех же животных перед обработкой. По окончании обработки титр DHBV ДНК в сыворотке крови возвращался к значению, не имеющему статистического различия со значением до обработки, показывая, что действие пептида CMS001 может быть обратимым и/или необходим более длительный период обработки для подавления вируса.
Обсуждение
Животная модель утиного гепатита[1] представляет собой разработанную модель для исследования патогенеза гепатита В у человека и для скрининга терапевтических агентов для лечения гепатита В. В данном исследовании установлено, что CMS001 способе снижать титр DHBV ДНК в сыворотке крови после 4 недель обработки, указывая, что пептид CMS001 при подходящем уровне дозировки и при подходящей схеме применения может быть полезен сам по себе или в сочетании с другими веществами в качестве агента для лечения гепатита В у человека.
В настоящем исследовании тестировали введение с помощью внутрибрюшинной инъекции, но это не исключает возможной эффективности пептида при его введении другими альтернативными путями. Пептиды также можно вводить путем внутривенной инъекции, внутримышечной инъекции, подкожной инъекции и подкожной имплантации, с использованием или без использования устройства, облегчающего доставку лекарственного средства, такого как липосомы, защита для замедленного высвобождения и т.д. Пептид также можно вводить в любой форме для перорального введения, такой как таблетка, капсула, суспензия, раствор и т.д. в подходящей форме без модификации или в виде формы с замедленным высвобождением, или с использованием или без использования желудочно-кишечной защиты. Кроме того, пептид можно использовать в любой форме для местного применения, такой как мазь, крем, гель и т.д., с использованием или без использования устройства, облегчающего чрезкожное проникновение, или в виде ингаляции порошка в растворенном или липосомно-защищенном виде. Пептид также может быть переведен в его генетическую последовательность и клонирован в систему экспрессии, или сам по себе или в сочетании с другими пептидными последовательностями, для образования конечной пептидной молекулы для использования активности пептидов, как описано в данном изобретении, с очисткой или без очистки конечного пептида.
Влияние пептидов на гепатит В
Список литературы
1. Chen Yaxi, Guo shuhua, Zhang Dingfeng, et al. Foundation and application of Chongqing duck hepatitis B model. Chinese Journal of Hepatology. 1993; 1(2): 89-91
2. Chen Yaxi, Guo shuhua, Chen Xuehua. Preparation and application of DHBV DNA probe labeled with digoxin. Journal of Chongqing University of Medical Sciences. 1994; 19(4): 295-297
3. Tang Ni, Huang Ailong, Guo shuhua, et al. Systemic foundation and application of serological parameters of humoral immunity to duck hepatitis B virus. Chinese Journal of Hepatology. 2001; 9(1): 13-15
4. Chen Yaxi, Guo shuhua, Qi Zhenyuan, et al. An experimental study of lamivudine against duck hepatitis B virus in combination with famciclovir. Chinese Journal of Hepatology. 2001; 9(4): 209-211
III. Влияние пептидов на нефрит
Для того, чтобы выяснить, обладают ли эти пептиды возможным терапевтическим действием на нефрит, авторы настоящего изобретения использовали в таком исследовании животную модель Масуги (Masugi) нефрита у крыс, для того, чтобы протестировать in vivo влияние вышеуказанных пептидов на больных животных [3,4].
Задача данного исследования заключалась в изучении терапевтического эффекта пептидов in vivo на хронический гломерулонефрит. Крысиную модель нефрита Масуги создавали с помощью инъекции кроличьего IgG антикрысиного-почечного коркового вещества здоровым крысам Sprague Dawley, а затем немедленно вводили им внутрибрюшинно инъекцию пептидов в дозе 50 мкг/кг/день один раз в день в течение 3 недель. В качестве положительного контроля использовали гидрокортизон. Установлено, что протеинурия, уровень креатинина в сыворотке крови и индекс селезенки у крыс, обработанных СМS014, СМS018, СМS030 и СМS036, были сниженными по сравнению с контрольной группой при статистической значимости (р<0,05). Патолого-анатомическое исследование под микроскопом почки показало, что терапевтическое действие данных пептидов было аналогично обработке гидрокортизоном. Можно сделать вывод, что СМS014, СМS018, СМS030 и СМS036 можно использовать в качестве средства для лечения хронического нефрита.
Материалы.
Крысы Sprague Dawley (SD), самцы, весом 120±20 г получены из Центра экспериментальных животных Университета Гуаньчжоу Традиционной китайской медицины (Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine), а также Первого Военно-медицинского университета. Кролики породы «шиншилла», весом 3 кг, получены из Центра экспериментальных животных Университета Гуаньчжоу Традиционной китайской медицины
Пептиды, происходящие из L-аминокислот, были синтезированы обычным образом American Peptide Company, Inc., США и разведены до концентрации 10 мкг/мл стерильным обычным физиологическим раствором. Гидрокортизон получен от Yangzhou Pharmaceutical Factory, Китай.
Набор для определения уровня креатинина от Shanghai Rongsheng Biological technique Company, КНР.
Методы:
1. Получение кроличьей антисыворотки антикрысиного-почечного коркового вещества [1]. 20 здоровых крыс SD анестезировали с помощью внутривенной инъекции 3%-ного пентобарбитала натрия, 40 мг/кг. Брюшную аорту раскрывали и почки заливали обычным физиологическим раствором до тех пор, пока они не становились чистыми от крови. Выделяли почечное корковое вещество, гомогенизировали в 5 объемах 0,01М буфера Tris-HCl, pH 8,1, и фильтровали через сито из нержавеющей стали 140 калибра. Фильтрат собирали и смешивали либо с дополненным GIBCO-RPE, либо с неполным адьювантом Фрейнда (Freund) в соотношении 1:1 и эмульгировали, получая рабочий иммунизирующий раствор.
10 здоровых кроликов иммунизировали иммунизирующим раствором, в первый раз с использованием полного адьюванта Фрейнда, а затем неполного. Антиген вводили гиподермальной инъекцией через 6 выбранных случайным образом точек по 0,1 мл на точку один раз в 10 дней. Через 6 недель собирали кровь из ушной вены и определяли титр антитела методом двойной диффузии [2]. Через 8 недель после начала иммунизации кроликов анестезировали с помощью внутривенной инъекции 3%-ного пентобарбитала натрия, 20 мг/кг и собирали кровь из сонной артерии. Затем антисыворотку процеживали и выделяли.
Цельную кровь собирали у 15 здоровых SD крыс. Выделяли эритроциты и трижды промывали дочиста обычным физиологическим раствором. Чистые эритроциты смешивали с 250 мл кроличьей антисыворотки и инкубировали при 4°С в течение ночи. После инкубации эритроциты удаляли центрифугированием и супернатант дополнительно инактивировали при 56°С в течение 30 минут. После центрифугирования для удаления какого-либо осадка из супернатанта выделяли неочищенный IgC и частично очищали, трижды осаждая (NH4)2SO4 (50%, 33% и затем 33%)[5]. Неочищенный IgC повторно растворяли в 125 мл дважды дистиллированной воды и проводили очистку диализом сульфатом аммония. Титр антитела антикрысиного-почечного коркового вещества определяли методом двойной диффузии [2].
2. Индукция гломерулонефрита у крыс[5]: 0,25 мл затравочного раствора (содержащего примерно 4 мг неспецифического кроличьего IgG с полным адьювантом Фрейнда) вводили с помощью внутрибрюшинной инъекции здоровым SD крысам для примирования крыс за пять дней перед индукцией. За исключением нормальной здоровой контрольной группы, которая получала обычный физиологический раствор, все группы впоследствии индуцировали с помощью внутрибрюшинной инъекции 1 мл кроличьего IgG антикрысиного-почечного коркового вещества, полученного, как описано в разделе «Метод 1».
3. Деление на группы и введение: самцов SD крыс случайным образом разделяли на следующие группы: нормальная здоровая контрольная группа, контрольная нефритная группа с обработкой плацебо (плацебо), нефритная группа с обработкой пептидом и контрольная нефритная группа с обработкой гидрокортизоном (гидрокортизон), 12 животных на группу. Обработку начинали в день индукции. Пептиды - 50 мкг/кг/день, гидрокортизон - 3,3 мг/кг/день и обычный физиологический раствор использовали в качестве плацебо, во всех случаях введение проводили внутрибрюшинно, один раз день в течение 3 недель.
4. Контролируемые параметры[4]:
(a) уровень белка в моче: каждую крысу содержали в индивидуальной клетке. Обеспечивали адекватной водой для питья. Мочу собирали один раз в неделю в течение 24 часов. Содержание белка в моче определяли по методу кумассина синего.
(b) уровень креатинина в сыворотке крови: кровь собирали через три недели обработки и проводили определение уровня креатинина в сыворотке крови. Набор для креатинина получен от Shanghai Rongsheng Biological Technique Company.
(c) Индекс веса селезенки: индекс веса селезенки определяли по следующей формуле:
Индекс веса селезенки = средний вес селезенки÷средний вес тела
(d) Патологические микроскопическое исследование почки: для патологического исследования в каждой группе выбирали 6 наиболее тяжелых почек
Статистический анализ:
Использовали t-тест для сравнений между группами, отделяли набор при р<0,05. Для всех групп двух крыс с наиболее низкими значениями белка в моче исключали из статистического анализа.
Результат
1. Влияние обработки пептидом на уровень белка в моче
Влияние обработки пептидом на уровень белка в моче (единицы:мг)
Сравнение с плацебо, *р<0,05
Установлено, что пептиды CMS014, CMS018, CMS030 и CMS036 в дозе 50 мкг/кг/день один раз в день способны понижать уровень белка в моче в крысиной модели нефрита Masugi при статистически значимом различии с контрольной группой, получающей обработку плацебо. Также отмечено, что скорость роста в группах CMS014, CMS030 и CMS036 и гидрокортизона была ниже обычной скорости роста. Скорость роста в группе гидрокортизона снижалась до такой степени, что после первой недели доза обработки была сокращена наполовину для того, чтобы исключить тяжелую непереносимость.
2. Влияние обработки пептидом на уровень креатинина в сыворотке крови
Влияние пептидов на уровень креатинина в сыворотке крови
Сравнение с крысами, больными нефритом, получавшими обработку плацебо (плацебо), *р<0,05
Уровень креатинина у крыс с нефритом Masugi, получавших обработку плацебо, был намного выше уровня в нормальной контрольной группе, демонстрируя, что почечная функция у крыс с нефритом была аномальной. Установлено, что пептиды CMS014, CMS018, CMS030 и CMS036 в дозе 50 мкг/кг/день один раз в день способны понижать уровень креатинина при статистически значимом различии с крысами, страдающими нефритом, при обработке плацебо.
3. Влияние пептидов на индексы селезенки
Влияние пептидов на индекс селезенки (×10-3)
Сравнение с крысами, больными нефритом, получавшими обработку плацебо (плацебо), *р<0,05
Селезенка всех индуцированных крыс была увеличена по сравнению с обычными крысами, показывая, что индукция нефрита связана с иммунной ответной реакцией. Установлено, что пептиды CMS014, CMS018, CMS030 и CMS036 в дозе 50 мкг/кг/день один раз в день способны понижать индекс селезенки при статистически значимом различии с крысами, страдающими нефритом, при обработке плацебо, р<0,05. На этом основании предполагается, что пептиды могут оказывать корректирующее действие в отношении нефрита посредством иммуносуппрессорного (иммуноподавляющего) механизма.
4. Влияние пептидов на патологическое микроскопическое исследование почки
При сравнении с обычными крысами крысы, страдающие нефритом, при обработке плацебо (группа плацебо) продемонстрировали признаки образования фиброзной ткани в клубочковой капсуле, гиперплазии эпителия клубочков, образования нарастания, расширения и закупорки капилляров клубочков, отека продольных канальцев эпителия и образования искривления в периферическом канальце и собирающем протоке. Такие патологические изменения подтвердили успешное индуцирование нефрита. Наблюдали, что в группе CMS014 имелась только одна крыса, имевшая признаки образования фиброзной ткани в клубочковой капсуле и гиперплазии эпителия клубочков. Другие параметры для той же крысы и для других крыс в той же группе имели по существу такую же гистологию почки, что и обычные крысы. В группах CMS018, CMS030 и CMS036 все патологические параметры для всех крыс были в пределах нормы.
Вывод
Можно сделать вывод, что пептиды CMS014, CMS018, CMS030 и CMS036 в дозе 50 мкг/кг/день один раз в день при внутрибрюшинном введении могут оказывать терапевтическое действие в экспериментальной крысиной модели Masugi нефрита. Протеинурия, выделение креатинина и гистология почки корректировались данными пептидами в обрабатываемой группе при статистически значимом различии с контрольной группой, получающей обработку плацебо. Данные пептиды могут действовать посредством иммунологического механизма, на что указывает их влияние на индекс веса селезенки, но нельзя исключать возможность их действия посредством других механизмов.
Обсуждение
Пептиды CMS014, CMS018, CMS030 и CMS036 могут использоваться как часть или сами по себе для лечения нефрита у человека. Например, пептиды можно использовать для коррекции протеинурии или для восстановления выделительных функций у больных нефритом. Пептиды также можно использовать для профилактики дальнейшего ухудшения функции почек у больных нефритом. Пептиды можно использовать сами по себе или в виде комбинации двух или более пептидов, или в комбинации с другими фармацевтическими средствами или пищевыми добавками, в качестве полного курса лечения нефрита.
Влияние пептидов на нефрит
Список литературы
1. SDA(State Drag Administration, P.R.China). The guideline of preclinical researches of new drugs. 1994, the 1st edition, Page 96
2. Xu Shuyun, et al. The methodology of pharmacological experiment, the People's Sanitation Publishing Company; Beijing, the 2nd edition, 1991:1071.
3. Chen Qi, et al. The methodology of pharmacological researches of traditional Chinese medicine, the People's Sanitation Publishing Company, Beijing, the 1st edition. 1993:390.
4. Du Guanhua. The guideline for pharmacological experiment -the discovery and pharmacological evaluation of new drugs, Science Publishing Company, Beijing, the 1st edition, 2001:598.
5. Wang Shuxian. Nephrology, the People's Sanitation Publishing Company, Beijing, the 11th edition, 1987:244.
IV. Влияние CMS пептидов на рак
Для того, чтобы установить, являются ли данные пептиды лекарственными средствами для рака, авторы настоящего изобретения использовали различные стандартные животные модели рака в таком исследования для изучения биологического действия вышеуказанных пептидов на больных животных.
Материалы
1. Экспериментальные животные
Мыши BALB/c, C57BL/6 и DBA/2, весом 18-22 г из Института медицинских наук Китая (China Medical Science Institute), КНР.
2. Клеточные линии
Клетки мышиной саркомы S180, клетки В16 и клетки L1210 из Департамента исследований рака Института медицинских наук Китая (Cancer Research Department, China Medical Science Institute).
Клетки YAC-1 предоставлены в дар профессором Yao Zhi, медицинского университета Тяньджина (Tianjin Medical University).
3. Основные лекарственные средства и реагенты
Пептиды, использованные в данном анализе, были произведены обычным образом American Peptide Company, Inc., США.
Плодная телячья сыворотка, RPMI-1640 клеточная культуральная среда от Gibco, США.
МТТ, ConA от Sigma, США.
Рекомбинантный мышиный интерферон-((rmIFN-γ) от Beijing Biotech Inc., Китай
Рекомбинантный интерлейкин-2 человека (rhIL-2) от Shanghai Huaxin Biotech Inc., Китай
Раствор для отделения лимфоцитов, Научно-исследовательский институт Гематологических заболеваний, Национальный институт медицинских наук, КНР.
Циклофосфамид получен от 12-й фармацевтической фабрики Шанхая, КНР.
Методы
1. Введение исследуемых веществ
Внутрибрюшинная инъекция, один раз в день. За исключением группы циклофосфамида во всех группах начинали обработку за 5 дней перед трансплантацией раковых клеток. Группу циклофосфамида начинали обрабатывать на следующий день после трансплантации раковых клеток. Обработку всех групп исследуемыми веществами проводили в течение 30 дней или до тех пор, пока животное не умирало, если не указано другого.
2. Влияние пептидов на скорость роста трансплантированных клеток саркомы S180 у мышей BALB/c и на иммунологическую функцию хозяина.
Мышей BALB/c случайным образом распределяли на пептидную группу, группу циклофосфамида, группу rmIFN-γ, группу rhIL-2 и группу физиологического раствора, 20 животных на группу.
Исходные клетки саркомы S180 инкубировали в среде DMEM/F12, дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой, 37°С, 5% СО2 в течение 72 часов, затем промывали 3-4 раза раствором Хенка (Hank) при комнатной температуре. Концентрацию клеток доводили до 1-2×109 на литр раствором Хенка. 0,2 мл клеточной суспензии имплантировали нескольким мышам BALB/c в подмышку в течение 10-12 дней. Мышей убивали смещением шейного позвонка. Интенсивно выросшие и не разрушенные опухолевые массы собирали и промывали дочиста стерильным физиологическим раствором. Ткань диспергировали в физиологическом растворе до гомогенной клеточной суспензии в соотношении 1 г ткани на 4 мл физиологического раствора. Мышиную модель саркомы получали инъекцией 0,2 мл клеточной суспензии через подмышку[1]. Введение исследуемого вещества начинали, как описано в разделе «Метод 1».
2.1. Влияние пептидов на фагоцитарную функцию моноядерного фагоцита у мышей с саркомой S180 [2,3] анализировали путем ведения туши в хвостовую вену из расчета 0,1 мл/10 г веса тела (разведение 1:5 обычным физиологическим раствором) на второй день после последнего введения исследуемого вещества. Через одну минуту и пять минут после инъекции туши отбирали 20 мкл крови из угла глазной щели с помощью гепаринизированной трубки. Кровь смешивали с 2 мл 0,1% вес/об Na2CO3 и затем получали ОП680 нм. Основной явный индекс К рассчитывали по следующей формуле:
K=(lgA1-lgA2)+(t2-t1)
Ключ:
А1: ОП680 нм на первой минуте
А2: ОП680 нм на пятой минуте
t2: 5 минут
t1: 1 минута
Затем после исследования фагоцитарного индекса мышь убивали путем смещения шейного позвонка. Печень, селезенку и раковые ткани иссекали, промокали досуха и взвешивали.
Фагоцитарный индекс (рассчитывали, как показано ниже):
α=(3√К)×(W÷WLS)
Ключ:
W: вес тела
WLS: вес печени и селезенки
2.2. Индекс ингибирования роста опухоли рассчитывали по следующей формуле:
Индекс ингибирования роста опухоли = (средний вес опухоли в контрольной группе - средний вес опухоли в группе обработки)÷средний вес опухоли в контрольной группе.
3. Влияние пептидов на выживание BALB/c мышей с трансплантированным раком печени Н22 асцитического жидкостного типа
Мышей BALB/c случайным образом распределяли на пептидную группу, группу циклофосфамида, группу rmIFN-γ, группу rhIL-2 и группу физиологического раствора, 20 животных на группу.
Исходные клетки Н22 инкубировали в среде DMEM/F12, дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой, 37°С/5% СО2 в течение 72 часов, затем промывали 3-4 раза раствором Хенка (Hank) при комнатной температуре. Концентрацию клеток доводили до 1-2×109 на литр раствором Хенка. 0,2 мл клеточной суспензии имплантировали нескольким мышам BALB/c в брюшную полость на 6-8 дней[1]. Мышей убивали смещением шейного позвонка. Асцитическую жидкость мышей собирали асептическим образом и концентрацию клеток доводили до 1×106 на мл раствором Хенка. 0,2 мл клеточной суспензии имплантировали в брюшную полость здоровых мышей для получения мышиной модели, несущей Н22, рак печени асцитического жидкостного типа. Введение исследуемого вещества начинали, как описано в разделе «Метод 1». Записывали данные по выживанию мышей. Если животное жило дольше, чем продолжался эксперимент, дни выживания записывали как продолжительность эксперимента. Средний день выживания получали с помощью метода Каплана-Мейера в опции «Выживание» программного обеспечения SPSS. Индекс выживания рассчитывали согласно следующей формуле:
Индекс выживания = (среднее число дней выживания в группе обработки - среднее число дней выживания контрольной группы)÷среднее число дней выживания контрольной группы (100%)
4. Влияние пептидов на клеточный иммунитет BALB/c мышей с трансплантированным раком печени Н22 асцитического жидкостного типа
4.1. Получение суспензии клеток селезенки [1,4]
Здоровых мышей BALB/c случайным образом распределяли на пептидную группу, группу rmIFN-γ, группу rhIL-2 и группу физиологического раствора, 15 мышей на группу и получали несущую Н22 мышиную модель, как описано в разделе «Метод 3». После имплантации раковых клеток тестируемые вещества вводили в течение 15 дней, мышей убивали смещением шейного позвонка. Селезенку отделяли и вручную диспергировали в холодном растворе D-Hank с использованием иглы для инъекций. Диспергированную клеточную суспензию дополнительно пропускали через сито 100 калибра из нержавеющей стали диаметром 150 мкм. После центрифугирования при 200g в течение 10 минут супернатант отбрасывали. Осадок клеток повторно суспендировали в 10 объемах буфера Tris-NH4Cl и затем оставляли на 10 минут при комнатной температуре. Суспендированные клетки собирали центрифугированием при 150g в течение 10 минут. Клетки промывали 2-4 раза холодным раствором D-Hank путем ресуспендирования и центрифугирования при описанных выше условиях. Промытые клетки затем разводили до желаемой плотности клеток с использованием культуральной среды RPMI-1640, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки.
4.2. Влияние пептидов на трансформацию Т-лимфоцитов у мышей с трансплантированным раком печени Н22 асцитического жидкостного типа [1,4]
Клетки селезенки плотностью 1×106 мл помещали в 96-луночные планшеты для клеточных культур, 100 мкл/лунку, три параллельных лунки для каждого анализируемого образца и контрольный образец для каждой мыши. В анализируемые лунки добавляли 100 мкл/лунку ConA раствора 100 мкг/мл в RPMI-1640 и 100 мкл/лунку самой среды RPMI-1640 использовали для контроля. Клетки инкубировали в течение 66 часов при 37°С, 5% СО2. Клетки затем осаждали центрифугированием при 150g в течение 10 минут. Супернатант собирали и хранили при -20°С для определения цитокинов IL-2 и IFN.
50 мкл/лунку МТТ раствора 1 мг/мл в RPMI-1640 добавляли к осадку клеток и клетки повторно суспендировали встряхиванием в течение 2 минут. Инкубацию продолжали в течение 4 часов. Супернатант отбрасывали после центрифугирования при 150g в течение 10 минут. 120 мкл 40 мМ HCl в пропаноле-2 добавляли к осадку клеток и встряхивали в течение 3 минут. Использовали ридер ELISA для получения ОП570 нм для каждой лунки, нормированной для 630 нм.
Для каждой мыши формировали три анализируемых лунки и три контрольных лунки. Индекс стимуляции (SI) для каждой мыши получали, первоначально получая среднюю ОП для трех параллельных лунок, а затем деля значение для анализируемых лунок на значение для контрольных лунок.
4.3. Влияние пептидов на NK клеточную активность у мышей с трансплантированным раком печени Н22 асцитического жидкостного типа[5,6]
Получали мышиные клетки селезенки плотностью 4×106 мл, как описано выше в разделе 4.1. Клетки-мишени YAC-1 брали в логарифмической фазе и доводили до 1×105 мл. С использованием 96-луночных планшетов для культур клеток 100 мкл клеток мышиной селезенки и 100 мкл культуральной среды добавляли в контрольную лунку, содержащую только клетки селезенки; 100 мкл клеток-мишеней и 100 мкл культуральной среды добавляли в контрольную лунку, содержащую только клетки-мишени; 100 мкл клеток мышиной селезенки и 100 мкл клеток-мишеней добавляли в лунки для анализа NK активности. Готовили три параллельных серии вышеуказанных лунок на мышь.
Образцы центрифугировали при 150g в течение 10 минут для того, чтобы собрать клетки. Супернатант отбрасывали и добавляли 50 мкл/лунку МТТ раствора 1 мг/мл. Реакционную смесь затем встряхивали в течение 2 минут и инкубировали при 37°С, 5% СО2 в течение 4 часов. Супернатант отбрасывали после центрифугирования при 150g в течение 10 минут. Добавляли 120 мкл 40 мМ HCl в пропаноле-2 и встряхивали в течение 3 минут. Ридер ELISA использовали для получения ОП570 нм для каждой лунки, нормированной для 630 нм.
Для каждой мыши имелось 9 лунок: три лунки с клетками селезенки - только контроль, три с клетками-мишенями - только контроль и три анализируемых лунки как с клетками селезенки, так и с клетками-мишенями. Индекс NK клеточной активности для каждой мыши получали, первоначально получая среднюю ОП для трех параллельных лунок каждой комбинации, затем используя такую среднюю ОП в следующей формуле:
Индекс NK клеточной активности = [1-(средняя ОП лунки с клетками селезенки и клетками-мишенями - средняя ОП лунки только с клетками селезенки)÷(средняя ОП лунки только с клетками-мишенями)]×100%
5. Влияние пептидов на выживание DBA/2 мышей с трансплантированным L1210 лейкозом
Мышей DBA/2 случайным образом распределяли на пептидную группу, группу циклофосфамида, группу rmIFN-γ, группу rhIL-2 и группу физиологического раствора, 20 животных на группу.
Исходные клетки L1210 инкубировали в DMEM/F12 среде, дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой, 37°C/5% СО2 в течение 72 часов, затем промывали 3-4 раза раствором Хенка и доводили до 1×105 клеток на литр. 0,1 мл суспензии клеток имплантировали в брюшную полость нескольким здоровым мышам DBA на 6-8 дней. Затем мышей убивали смещением шейного позвонка и собирали асептическим образом их асцитическую жидкость. Концентрацию клеток в собранной асцитической жидкости доводили до 1×106 на мл раствором Хенка. 0,1 мл клеточной суспензии имплантировали каждому из тест-животных и регистрировали данные по выживанию животных. Обработку начинали, как описано в разделе «Метод 1». Средний день выживания получали с помощью метода Каплана-Мейера в опции «Выживание» программного обеспечения SPSS. Если животное жило дольше, чем продолжался эксперимент, дни выживания записывали как продолжительность эксперимента. Индекс выживания рассчитывали согласно следующей формуле:
Индекс выживания = (среднее число дней выживания в группе обработки - среднее число дней выживания контрольной группы)÷среднее число дней выживания контрольной группы
6. Влияние пептидов на гуморальный иммунитет мышей C57BL/6, несущих трансплантированную В16 меланому и на метастатическую способность инокулированных клеток меланомы
Мышей C57BL/6, возраст 6-8 недель, вес 18-22 г, случайным образом распределяли на пептидную группу, группу циклофосфамида, группу rmIFN-γ, группу rhIL-2 и группу, получающую физиологический раствор, 20 животных на группу.
Исходные клетки В16 мышиной меланомы инкубировали в среде DMEM/F12, дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой, 37°C/5% СО2 в течение 72 часов, затем промывали 3-4 раза раствором Хенка. Концентрацию клеток доводили до 1×105 клеток на литр и 0,1 мл суспензии клеток вводили инъекцией в хвостовую вену тестируемым мышам для получения животной модели В16 меланомы[7,8]. Обработку исследуемым веществом начинали, как описано в разделе «Метод 1».
6.1. Влияние пептидов на гуморальный иммунитет мышей C57BL/6, несущих трансплантированную В16 меланому[9]
Получали эритроциты овец (SRBC), собирая кровь из шейной вены и помещая ее в стерильную колбу со стеклянными шариками. Колбу встряхивали в течение 3 минут и затем кровь смешивали с раствором Альзевера (Alsever) (глюкоза 2,05 г, NaCl 0,4 г, лемонад Na 0,8 г, доводили до 100 мл дистиллированной водой) и хранили при 4°С. Непосредственно перед использованием образцы центрифугировали при 130g в течение 5 минут, собирая SRBC. Клетки дважды промывали ресуспендированием и центрифугированием в нормальном физиологическом растворе. Затем осадок клеток собирали центрифугированием при 180g в течение 10 минут и повторно суспендировали в физиологическом растворе, получая конечную рабочую суспензию SRBC, 2% (об/об).
Комплемент получали, добавляя 10 объемов свежей сыворотки крови морской свинки к одному объему уплотненного на центрифуге SRBC, и затем осторожно встряхивая в течение 30 минут при 4°С. SRBC удаляли центрифугированием при 200g в течение 10 минут. Для получения рабочего комплементного раствора добавляли 10 объемов обычного физиологического раствора.
Тестируемым животным на 27-й день обработки тестируемым веществом вводили 0,2 мл рабочей суспензии клеток SRBC каждому животному для индуцирования антител. Через день после последнего введения исследуемого вещества собирали кровь из угла глазной щели и оставляли при комнатной температуре на один час для экссудации сыворотки крови. После центрифугирования при 200g в течение 10 минут собранную сыворотку крови разводили в 500 раз с использованием обычного физиологического раствора.
К 1 мл разведенной мышиной сыворотки крови для каждой мыши добавляли 0,5 мл суспензии SRBC. Охлаждали на льду. Затем добавляли 1 мл рабочего раствора комплемента и инкубировали при 37°С на водяной бане в течение 10 минут. Реакцию останавливали охлаждением льдом. Затем образцы центрифугировали при 200g в течение 10 минут, получая супернатант.
К 1 мл данного супернатанта добавляли 3 мл раствора Драбкина (Drabkin) и оставляли при комнатной температуре на 10 минут. Получали ОП540 нм.
Стандартизированную ОП540 нм получали, смешивая 0,25 мл суспензии SRBC с раствором Драбкина до 4 мл и оставляя смесь на 10 минут перед получением ОП540 нм.
Индекс гемолиза = (ОП540 нм тестируемого образца (стандартизированная ОП540 нм)×500
6.2. После исследования гуморального иммунитета мышей убивали смещением шейного позвонка. Проводили патолого-анатомическое исследование животных. Регистрировали патологические изменения и подсчитывали число метастазных очагов меланомы в легких.
Результаты
1. Влияние пептида на клеточный фагоцитоз у BALB/c мышей с трансплантированной саркомой S180
Влияние пептида на индекс фагоцитоза у BALB/c мышей с трансплантированной саркомой S180
*: сравнение с физиологическим раствором, Р<0,05
∧: сравнение с IFN-γ, Р<0,05
Установлено, что CMS001 в дозе 50 мкг/кг/день и 5 мкг/кг/день и CMS034 в дозе 5 мкг/кг/день и 0,5 мкг/кг/день способны увеличивать индекс фагоцитоза при статистически значимом различии с группой, получающей физиологический раствор.
2. Влияние пептида на скорость роста трансплантированной саркомы S180 у BALB/c мышей
Влияние пептида на рост трансплантированной опухоли S180
*: сравнение с группой физиологического раствора, Р<0,05
Установлено, что CMS010 в дозе 500 мкг/кг/день, CMS034 в дозе 0,5 мкг/кг/день, CMS035 в дозе 5 мкг/кг/день способны снижать рост трансплантированной саркомы S180 при статистически значимом различии с группой, получающей физиологический раствор (Р<0,05).
3. Влияние пептида на выживание BALB/c мышей с трансплантированным раком печени Н22 асцитического жидкостного типа (Метод 3)
Влияние пептида на индекс выживания BALB/c мышей с трансплантированным раком печени Н22 асцитического жидкостного типа
*: сравнение с физиологическим раствором, Р<0,05
∧: сравнение с rmIFN-γ, Р<0,05
&: сравнение с rhIL-2, Р<0,05
$: сравнение с циклофосфамидом, Р<0,05
Установлено, что CMS008 в дозе 5 мкг/кг/день, CMS011 в дозе 5 мкг/кг/день, CMS024 в дозе 50 мкг/кг/день, CMS024 в дозе 0,5 мкг/кг/день и CMS032 в дозе 0,5 мкг/кг/день способны продлевать выживание BALB/c мышей с трансплантированным раком печени Н22 асцитического жидкостного типа при статистически значимом различии с группой, получающей физиологический раствор (Р<0,05). Также наблюдали, что в группе CMS024 0,5 мкг/кг/день более 30% (n=6) мышей прожило дольше 90 дней (два месяца после окончания эксперимента). Патолого-анатомическое исследование мышей не выявило признаков развития опухоли. Таким образом, CMS024 в дозе 0,5 мкг/кг/день может препятствовать росту трансплантированного Н22, препятствуя его развитию или индуцируя полное выздоровление от развившегося рака.
4. Влияние пептида на трансформацию Т лимфоцитов у BALB/c мышей с трансплантированным раком печени Н22 асцитического жидкостного типа (Метод 4.2)
Влияние пептида на трансформацию Т-лимфоцитов
*: сравнение с физиологическим раствором, Р<0,05
$: сравнение с циклофосфамидом, Р<0,05
Установлено, что CMS010 в дозе 500 мкг/кг/день, CMS019 в дозе 0,5 мкг/кг/день, CMS024 в дозе 0,5 мкг/кг/день и 5 мкг/кг/день и CMS035 в дозе 0,5 мкг/кг/день и 5 мкг/кг/день способны увеличивать индекс стимуляции Т-лимфоцита при статистически значимом различии с группой, получающей физиологический раствор (Р<0,05).
5. Влияние пептида на активность NK клеток у мышей BALB/c с трансплантированным раком печени Н22 асцитического жидкостного типа (Метод 4.3)
Влияние пептида на индекс цитотоксической активности NK клеток
*: при сравнении с физиологическим раствором, Р<0,05
∧: при сравнении с IFN-γ, Р<0,05
&: при сравнении с IL-2, Р<0,05
$: при сравнении с циклофосфамидом, Р<0,05
Установлено, что CMS003 в дозе 500 мкг/кг/день, CMS014 в дозе 0,5 мкг/кг/день, CMS024 в дозе 0,5 мкг/кг/день, 5 мкг/кг/день и 50 мкг/кг/день и CMS034 в дозе 50 мкг/кг/день способны увеличивать цитотоксическую активность NK клеток при статистически значимом различии с группой, получающей физиологический раствор (Р<0,05).
6. Влияние пептида на выживание DBA/2 мышей с трансплантированным L1210 лейкозом (метод 5)
Влияние пептида на индекс выживания исследуемых животных
*: сравнение с группой физиологического раствора, Р<0,05
Установлено, что CMS019 в дозе 0,5 мкг/кг/день и CMS035 в дозе 0,5 мкг/кг/день способны пролонгировать выживание DBA/2 мышей с трансплантированным L1210 лейкозом при статистически значимом различии с группой, получающей физиологический раствор (Р<0,05).
7. Влияние пептида на гуморальный иммунитет C57BL/6 мышей с трансплантированной В16 меланомой (метод 6.1)
Влияние пептида на индекс гемолиза C57BL/6 мышей с трансплантированной В16 меланомой
*: сравнение с физиологическим раствором, Р<0,05
$: сравнение с циклофосфамидом, Р<0,05
Установлено, что CMS001, CMS003, CMS008, CMS010, CMS011, CMS016, CMS019, CMS024, CMS034 и CMS035 способны усиливать гуморальную ответную реакцию (увеличение индекса гемолиза) у C57BL/6 мышей с трансплантированной В16 меланомой в дозировках, показанных в таблице IV.7, при статистически значимом различии с группой, получающей физиологический раствор (Р<0,05).
8. Влияние пептида на выживание инокулированных клеток В16 меланомы у C57BL/6 мышей (метод 6.2)
Патолого-анатомическое исследование животных после окончания обработки тестируемым веществом не выявило каких-либо признаков очагов метастазов В16 в легком мышей, которых обрабатывали CMS008 в дозах 0,5 мкг/кг/день, 5 мкг/кг/день и 50 мкг/кг/день и CMS016 в дозах 5 мкг/кг/день и 500 мкг/кг/день.
Выводы
В соответствии с Указаниями по доклиническим исследованиям новых лекарственных средств, выпущенным Отделением введения лекарственных средств департамента здравоохранения народной Республики Китай в 1993 г., исследовано влияние пептида на мышей с трансплантированными раковыми клетками. В итоге сделан вывод, что
1. CMS010, CMS034 и CMS035 в подходящей дозировке могут существенно ингибировать развитие трансплантированной S180 саркомы у мышей;
2. CMS001 и CMS034 в подходящей дозировке могут усиливать фагоцитарную иммунную активность у мышей с трансплантированной S180 саркомой;
3. CMS008, CMS011, CMS024 и CMS032 в подходящей дозировке могут пролонгировать выживание мышей, которым трансплантирован рак печени асцитического жидкостного типа Н22;
4. CMS010, CMS019, CMS024, CMS034 и CMS035 в подходящей дозировке могут усиливать трансформацию Т лимфоцитов у мышей, которым трансплантирован рак печени асцитического жидкостного типа Н22;
5. CMS003, CMS014, CMS024, CMS032 и CMS034 в подходящей дозировке могут увеличивать цитотоксическую активность NK клеток у мышей, которым трансплантирован рак печени асцитического жидкостного типа Н22;
6. CMS019 и CMS035 в подходящей дозировке могут пролонгировать выживание мышей, которым трансплантирован L1210 лейкоз;
7. CMS008 и CMS016 в подходящей дозировке могут ингибировать развитие трансплантированной В16 меланомы у мышей;
8. CMS001, CMS003, CMS008, CMS010, CMS011, CMS016, CMS019, CMS024, CMS034 и CMS035 в подходящей дозировке могут усиливать гуморальную иммунную ответную реакцию у мышей, которым трансплантирована В16 меланома.
CMS001, CMS003, CMS008, CMS010, CMS011, CMS014, CMS016, CMS019, CMS024, CMS032, CMS034, CMS035 могут использоваться как часть или сами по себе для лечения рака у человека. Например, CMS001, CMS003, CMS008, CMS010, CMS011, CMS014, CMS016, CMS019, CMS024, CMS032, CMS034, CMS035 можно использовать для усиления иммунитета у пациентов, страдающих раком. CMS008, CMS010, CMS016, CMS034 и CMS035 могут использоваться для предотвращения роста раковых клеток у пациентов. CMS008, CMS011, CMS019, CMS024, CMS032 и CMS035 можно использовать для пролонгирования ожидаемой продолжительности жизни больных раком. Пептиды можно использовать по отдельности, в виде комбинации двух или более пептидов или в виде комбинации с другими фармацевтическими препаратами или пищевыми добавками в качестве полного курса лечения рака.
Пептиды, эффективные при раке
Список литературы
1. Principles of Pre-clinical Research of New Drugs, People's Republic of China. 1993, 7: 137-143
2. Principles of Pre-clinical Research of New Drugs, People's Republic of China. 1993, 7: 128-129
3. Yuanpei Zhang, Huaide Su. Pharmacological experiment (second edition). People's Health Publishing House. 1998, 137-138
4. Shuyun Xu, Rulian Bian, Xiu Chen. Methodology of pharmacological experiment. People's Health Publishing House. 1991, 1221-1234
5. Principles of Pre-clinical Research of New Drugs, People's Republic of China. 1993, 7: 140
6. Jinsheng He, Ruizhu Li, Tingyi Zong. The study on MTT reduction method of testing NK cell activity. China Immunology Journal. 1996, 1(6): 356-358
7. Yaoqin Yang, Huchuan Yang, Huihong Tao, et al. The synergic effect of Tween-80 on the antitumor of hyperfhenm'a-Experimental studies of mouse melanoma. Cancer Research on Prevention and Treatment. 1999, 26(4): 8-12
8. Jian Fu, Jie Zheng, Weigang Fang, et al. Interleukin-12 gene transfection into murine B16 melanoma cells suppresses tumorigenicity and decreases metastatic potential. National Medical Journal of China. 1998, 78(8): 627-629
9. Qian Wang. Modern medical experiment method. People's Health Publishing House. 1998, 482-483
10. Qichao Pan, Bin Xu. Cancer pharmacology and chemotherapy, Henan medical university Publishing House. 2000, 66-69
11. Yuanpei Zhang, Huaide Su. Pharmacological experiment (second edition). People's Health Publishing House. 1998, 131
V. Влияние на вес тела
Здоровых крыс кормили высокопитательной диетой в течение 5 недель с использованием одновременной обработки пептидом или без обработки (внутримышечно 300 мкг/кг/день). В качестве отрицательного контроля использовали крыс с обычным питанием, которым вводили инъекции физиологического раствора. Через 5 недель обработки инъекции прекращали и поддерживали такой же режим питания еще в течение трех недель. Данные веса тела собирали одновременно с недельным интервалом. Также наблюдали за поведением крыс. Было установлено, что в процессе обработки пептидом у крыс, получавших пептид СМS015, наблюдалось статистически значимое меньшее увеличение веса тела по сравнению с контролем. Такая тенденция уменьшения веса тела постепенно снижалась после прекращения обработки СМS015. Сделан вывод, что СМS015 при подходящем уровне дозировки может обратимо контролировать развитие ожирения, индуцированное перееданием.
Материалы
Крыс Sprague-Dawley (SD), весом 145±10 г поставляли из Центра экспериментальных животных Университета Гуаньчжоу Традиционной китайской медицины (Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine), КНР (сертификат №2000А019). Пептиды были синтезированы обычным образом (на основе L-аминокислот) American Peptide company, Inc., США, и разводили до концентрации 10 мкг/мл в обычном физиологическом растворе. Высокопитательное и обычное питание готовили в соответствии с указаниями для доклинического исследования лекарственных средств против ожирения, изданными SDA (Государственное управление лекарственных средств), КНР[1].
Методы
Здоровых крыс статистически распределяли на экспериментальную, положительную контрольную и отрицательную контрольную группы из расчета 10 крыс на группу, половина самцы и половина самки. Экспериментальную группу крыс кормили высокопитательной диетой в течение 5 недель с одновременным введением пептида в дозе 300 мкг/кг/день один раз в день путем внутримышечной инъекции. Положительная контрольная группа получала ту же самую высокопитательную диету, но «плацебо» инъекцию физиологического раствора, тогда как группа отрицательного контроля, использованная для доказательства успешного установления модели ожирения, получала обычное питание с «плацебо» инъекцией физиологического раствора. Через 5 недель обработки инъекции прекращали и поддерживали ту же модель питания еще в течение 3 недель. Крыс взвешивали одновременно с недельным интервалом. Также наблюдали за поведением крыс.
Данные представлены как среднее значение (стандартное отклонение. Парный t критерий или однофакторный ANOVA использовали для сравнения между группами и внутри групп. Предельная статистическая значимость составляла Р≤0,05.
Результаты
1. Влияние пептида на вес тела крысы SD
Влияние пептида на вес тела крысы SD
При сравнении с группой положительного контроля: р<0,05
Было установлено, что в дозе 300 мкг/кг/день СМS015 способен ограничивать увеличение веса у ожиревших крыс, вызванное перекормом, проявляя статистически значимое различие при сравнении с контрольной группой (р<0,05). Разница между группой обработки и контрольной группой увеличивалась при увеличении продолжительности обработки. При прекращении обработки пептидом СМS015 в группе обработки разница между группой обработки и контрольной группой постепенно снижалась и становилась статистически незначимой через три недели, показывая, что влияние пептида на вес тела крыс SD является обратимым.
На протяжении всего эксперимента наблюдалось, что аппетит и активность всех групп крыс оставались нормальными.
Обсуждение
Сделан вывод, что CMS015 при подходящем уровне дозировки может ограничивать развитие ожирения, индуцированного перееданием. Пептид можно использовать на человеке для борьбы с ожирением. Пептиды можно использовать сами по себе, в виде комбинации двух или нескольких пептидов или в виде комбинации с другими фармацевтическими препаратами или пищевыми добавками в качестве полного курса лечения ожирения.
В настоящем исследовании тестировали введение с помощью внутримышечной инъекции, но это не исключает возможной эффективности пептида при его введении другими альтернативными путями. Пептиды можно вводить путем внутривенной инъекции, внутримышечной инъекции, внутрибрюшинной инъекции, подкожной инъекции и подкожной имплантации, с использованием или без использования устройства, облегчающего доставку лекарственного средства, такого как липосомы, защита для замедленного высвобождения и т.д. Пептид также можно вводить в любой форме для перорального введения, такой как таблетка, капсула, суспензия, раствор и т.д. в обычной подходящей форме без модификации или в виде формы с замедленным высвобождением, с использованием или без использования желудочно-кишечной защиты. Кроме того, пептид можно использовать в любой форме для местного применения, такой как мазь, крем, гель и т.д., с использованием или без использования устройства, облегчающего чрезкожное проникновение, или в виде ингаляции порошка в растворенном или липосомно-защищенном виде. Пептид также может быть конвертирован в его генетическую последовательность и клонирован в систему экспрессии, или сам по себе или в сочетании с другими пептидными последовательностями, для образования конечной пептидной молекулы для использования активности пептидов, как описано в данном изобретении, с очисткой или без очистки конечного пептида.
Эффективность пептидов при ожирении
Литература
1.SDA PR China, The guideline for pre-clinical research of new drugs, 1993.
Следует понимать, что возможно добавлять дополнительные аминокислоты к аминному или карбоксильному концу описанных выше пептидов в качестве другого метода практического осуществления изобретения. Например, одна или две аминокислоты могут быть добавлены к описанному пептиду без влияния на его биологическое действие. Также можно добавить три или четыре аминокислоты и все еще сохранить функцию пептидов. Все они упоминаются как варианты одного и того же пептида. Альтернативно, одна или две аминокислоты могут быть удалены из пептида без влияния на его биологическую активность. Кроме того, возможно удалить три или четыре аминокислоты, без влияния на биологическую функцию пептидов. Они упоминаются как фрагменты настоящего пептида. Кроме того, для практического осуществления другого аспекта настоящего изобретения можно использовать производные пептида, например получаемые при консервативном замещении одной аминокислоты на другую аминокислоту того же самого функционального класса. Например, в пептидах, имеющих неполярные или гидрофобные боковые цепи, возможно замещение одной боковой группы на другую без снижения биологической активности. В качестве дополнительного примера линкер/спейсер может быть введен в пептид с образованием вариантов, но вариантов, все еще сохраняющих свой активный фрагмент в качестве первоначального пептида, использованного в данном исследовании. Они также представляют собой рассматриваемые варианты пептидов. Аналог пептида, как использовано в данном описании, включает пептиды, имеющие молекулы аминокислот, которые имитируют структуру природной аминокислоты, например аналог с другой структурой скелета или D-аминокислотным замещением. В качестве дополнительного примера, хотя аминокислоты, использованные для синтеза пептидов, представляют собой L-оптические изомерные формы, пептиды с одной или более аминокислотами в последовательности, замещены на D-форму, могут обладать подобной биологической активностью. Подразумевается, что термин «функциональное производное», как он использован в формуле изобретения, включает фрагменты, варианты, аналоги или химические производные пептида.
Как использовано в данном описании, термин «гибридный пептид» используется для обозначения пептидов, которые содержат дополнительные пептиды, встроенные в первоначальные биологически активные пептиды, с SEQ ID No: 1-30 или их функциональные производные, но все еще сохраняющие по существу аналогичную активность. Дополнительные пептиды включают лидерные пептиды, которые содержат, например, аминокислотную последовательность, которая распознается одной или более прокариотическими или эукариотическими клетками в качестве сигнала для секреции гибридного белка в окружающую среду или в клетку. Секреция может представлять собой непосредственно секрецию или косвенную секрецию посредством секреторных везикулов.
«По существу чистый пептид» относится к пептидам, которые обладают по крайней мере 10% вес/вес чистотой, более предпочтительно 20%, еще более предпочтительно 40; и намного более предпочтительно 60% и еще более предпочтительно более чем 90% чистотой. В наиболее предпочтительном варианте осуществления чистота превышает 99%. По существу чистый пептид можно использовать для получения фармацевтических и пищевых композиций, которые могут представлять собой сложные смеси, как описано далее.
Применение вышеуказанных пептидов в фармацевтических композициях можно использовать для возможного лечения иммунологических нарушений или заболеваний, обладающих вторичным действием на иммунитет, таких как рак или инфекции или любое из отмеченных выше болезненных состояний. Композиции могут содержать один из идентифицированных пептидов, смешанных с другими активными или неактивными составляющими, включая другие пептиды. Например, два или несколько (например, 3-5) из перечисленных пептидов могут быть добавлены в одну и ту же композицию или без других ингредиентов. Альтернативно, один из перечисленных пептидов можно использовать для получения композиции вместе с пептидами, не перечисленными в данном изобретении. Их можно вводить внутривенно, внутримышечно, внутрикожно, подкожно или интрадермально. Способ введения также может представлять собой внутриартериальную инъекцию, которая приводит непосредственно к больному органу. Другими способами введения является чрескожное введение, ингаляция в виде порошка или спрея и другие виды доставки, известные в данной области. Композиция также может представлять собой перорально принимаемый препарат, и может содержать носители, которые используются для предотвращения расщепления пептида в желудке после перорального приема или любые другие носители, известные в данной области (для чрескожного введения такие как липосомы).
Фармацевтическая композиция может включать любой из известных фармацевтических носителей. Примеры подходящих носителей включают любой стандартный фармацевтически приемлемый носитель, известный специалистам в данной области. Они включают, но не ограничиваются этим, физиологический раствор, воду, эмульсии, включая масляные и водные смеси или эмульсии триглицеридов, и другие типы агентов, наполнителей, покрытых оболочкой таблеток и капсул. Подходящий носитель может быть выбран на основе способа введения фармацевтической композиции.
Пептиды можно вводить с помощью внутривенной инъекции, внутримышечной инъекции, внутрибрюшинной инъекции, подкожной инъекции и подкожного имплантирования. Пептид также можно вводить в любой форме для перорального введения, такой как таблетка, капсула, суспензия, раствор и т.д. в обычной подходящей форме без модификации или в виде формы с замедленным высвобождением, с использованием или без использования желудочно-кишечной защиты. Кроме того, пептид можно использовать в любой форме для местного применения, такой как мазь, крем, гель и т.д., с использованием или без использования устройства, облегчающего чрезкожное проникновение. Пептид также может быть конвертирован в его генетическую последовательность и клонирован в систему экспрессии, или сам по себе или в сочетании с другими пептидными последовательностями, для образования конечной пептидной молекулы для использования активности пептидов, как описано в данном изобретении.
Доза каждого пептида может составлять 1 нг-10 г на кг веса тела. Предпочтительная доза составляет 10 нг-10 мг на кг и более предпочтительно 1 мкг-1 мг на кг для инъекционного способа введения. Однако эффективная доза может быть такой низкой, как 1 нг на кг веса тела, поскольку один или более пептидов могут действовать посредством рецепторов, которые индуцируют каскад нормальной физиологической ответной реакции. Альтернативно, один или более пептидов могут быть только инициаторами для целого каскада реакций. Для перорального приема количество может составлять 1 нг-10 г в день на кг веса тела, более предпочтительно 0,1 мкг-1 г в день на кг веса тела и даже более предпочтительно 1 мкг-10 мг в день.
VI. Генотерапия и способ лечения
Генотерапию на основе открытых пептидных последовательностей осуществляют путем создания последовательности нуклеиновых кислот, которая кодирует один из данных пептидов. Нуклеиновая кислота может быть синтезирована химически или функционально лигирована с промотором и клонирована в вектор экспрессии. Вектор экспрессии затем вводят в организм человека в виде формы генотерапии для экспрессии в клетке человека. Термин «генетические векторы», как он использован в данном описании, включает такие векторы экспрессии. Векторы, которые можно использовать для генотерапии, включают адено-ассоциированный вирус (Mizuno M., et al., 1998), Jpn J Cancer Res., 89, 76-80), векторы LNSX (Miller A.D. et al., (1993), Methods Enzymol., 217, 581-599) и лентивирус (Goldman M.J. et al., (1997) Hum Gene Ther., 8, 2261-2268).
Другие носители для доставки пептида включают векторы экспрессии, кодирующие желаемый пептид, которые могут быть перенесены в организм, которые могут реплицироваться в организме-хозяине, которому желательно ввести пептид, без значительного вредного воздействия на здоровье организма-хозяина. Например, векторы экспрессии могут быть перенесены в организм, который не является патогенным для организма-хозяина, которому желательно ввести пептид. В некоторых вариантах осуществления вектор экспрессии продуцирует целевой пептид в организме бактерии или гриба, которые не оказывают значительного вредного воздействия на здоровье организма-хозяина, которому вводится пептид. Например, вектор экспрессии, кодирующий желаемый пептид, может представлять собой вектор экспрессии, который продуцирует желаемый пептид в организме, таком как молочнокислая бактерия, E.coli или дрожжи. В одном варианте осуществления вектор экспрессии продуцирует желаемый пептид в микробе, обычно обнаруживаемом в желудочно-кишечном тракте млекопитающего или в микробе, которые толерантен желудочно-кишечному тракту млекопитающего. Некоторые из разновидностей микробов, в которых может экспрессироваться желаемый пептид, включают, но не ограничиваются этим, вид Lactobacillus, такие как L.acidophilus, L.amylovorus, L.casei, L.crispatus, L.gallinarum, L.gasseri, L.johnsonii, L.paracasei, L.plantarum, L.reuteri, L.rhamnosus или другие; виды Bifidobacterium, такие как B.adolescentis, B.animalus, B.bifidum, B.breve, B.infantis, B.lactis, B.longum или другие; Enterococcus faecalis или Ent.facium; Sporolactobacillus inulinus; Bacillus subtilis или Bacillus cereus; Escherichia coli; Propionibacterium freudenreichii; или Saccharomyces cerevisitae или Saccharomyces boulardii.
Последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют пептиды по настоящему изобретению, синтезированные химически или продуцируемые другими способами, включая, но не ограничиваясь этим, обратимую транскрипцию мРНК для продуцирования молекул ДНК, включены в векторы экспрессии для генного переноса в целевые организмы способами генной инженерии, знакомыми специалистам в данной области. Векторы экспрессии могут быть ДНК векторами или РНК векторами. Например, векторы экспрессии могут быть основаны на плазмидных или вирусных генетических элементах. Векторы экспрессии могут представлять собой векторы, которые реплицируются внехромосомно, или векторы, интегрированные в хромосомы.
Векторы экспрессии включают промотор, функционально связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей пептид по настоящему изобретению. Промотор может представлять собой регулируемый промотор, такой как индуцибельный промотор или конститутивный промотор. В некоторых вариантах осуществления промотор может быть выбран для обеспечения желательного уровня экспрессии пептида. Дополнительно, при желании, векторы экспрессии могут включать другие последовательности для стимулирования продуцирования, презентации и/или секреции пептидов. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая пептид по настоящему изобретению, функционально связана с последовательностью нуклеиновых кислот, которая регулирует секрецию пептида. Например, нуклеиновая кислота, кодирующая пептид по настоящему изобретению, может быть функционально связана с нуклеиновой кислотой, кодирующей сигнальный пептид.
В некоторых вариантах осуществления векторы экспрессии, которые сконструированы для кодирования пептидов по настоящему изобретению, могут представлять собой векторы экспрессии, которые адаптированы для экспрессии пептида по настоящему изобретению в видах бактерий, которые создают нормальную флору в желудочно-кишечном тракте млекопитающих, таких как виды Lactobacillus и Bacillus subtilis. Примеры таких векторов экспрессии можно найти в патентах США №6100388, Casas, и №5728571, Bellini, соответственно. Данные документы специально включены в данное описание в качестве ссылки во всей своей полноте. Следует понимать, что можно использовать любой вектор экспрессии, который облегчает экспрессию пептида по настоящему изобретению в организме, который не оказывает негативного влияния на здоровье организма-хозяина, которому следует вводить пептид.
В некоторых вариантах осуществления векторы экспрессии, которые сконструированы для кодирования пептидов по настоящему изобретению, могут представлять собой векторы экспрессии, которые адаптированы для экспрессии пептида по настоящему изобретению в видах дрожжей, которые хорошо переносятся желудочно-кишечным трактом млекопитающих, таких как Saccharomyces cerevisiae; или, предпочтительно Saccharomyces boulardii, которые могут заселять желудочно-кишечный тракт человека или используются для лечения некоторых форм диареи. Можно использовать дрожжевые векторы экспрессии, которые конститутивно экспрессируют гетерологичные белки и пептиды, и являются высоко стабильными, поэтому хорошо передаются потомству клетки во время митоза и мейоза и могут включать кодирующую последовательность сигнального пептида или пептидов, которые регулируют высокие уровни секреции рекомбинантного белка. Пример такого дрожжевого вектора приведен в патенте США №6391585, Jang et al., который включен в данное описание в качестве ссылки во всей своей полноте.
Векторы экспрессии, кодирующие пептиды по настоящему изобретению могут быть введены в организм, который предназначен для экспрессии пептидов, методами, известными в данной области. Такие методы включают традиционные методы трансформации бактерий, дрожжей или других микроорганизмов с помощью использования химически компетентных бактериальных клеток, электропорации или литий-ацетатной трансформации (для дрожжей), также, например, с использованием последних достижений в трансформации бактериальных видов, стойких к таким методикам. В некоторых вариантах осуществления векторы экспрессии вводят в молочнокислые бактерии, известные как устойчивые к трансформации, с помощью способа, описанного Leer at el. (WO 95/35389), который включен в данное описание в качестве ссылки во всей своей полноте. Вводимые последовательности могут быть внесены в микробные хромосомные ДНК, или они могут оставаться внехромосомными ДНК элементами.
Такой генетически сконструированный микроб, содержащий вектор экспрессии, затем может быть инокулирован в пищевой тракт, влагалище, трахею и т.д. для осуществления пролонгированной иммунотерапии. В некоторых вариантах осуществления организмы, экспрессирующие пептиды по настоящему изобретению, проглатывают в неактивной форме или предпочтительно в живой форме. В пищеварительном тракте данные микроорганизмы продуцируют указанные пептиды, высвобождая их в просвет путем секреции или лизисом микроорганизма или каким-либо другим образом предоставляя пептиды хозяину, при этом подразумевается, что продуцируемые при этом пептиды оказывают действие на организм-хозяин. В других вариантах осуществления пептиды предоставляются хозяину на слизистой мембране носовых проходов, влагалища или тонкого кишечника.
Другой способ лечения заключается в использовании липосом как средств доставки конкретной нуклеиновой кислоты в клетки тела человека. Нуклеиновая кислота (такая как вектор экспрессии, содержащий нуклеотидную последовательность, которая кодирует пептиды с последовательностями SEQ ID No: 1-30) доставляется в окружающую среду, которая поддерживает клеточное поглощение и хромосомное слияние, как описано Gao X. и Huang L. (1995), Gene Ther., 2, 710-722, и патенте США 6207456. Альтернативно, сам пептид может быть инкапсулирован в липосому и непосредственно доставлен с использованием способа, описанного в патенте США 6245427. Все указанные выше научные публикации и патенты включены в данное описание в качестве ссылки.
Последовательности нуклеиновых кислот, пригодные для вышеуказанной генотерапии и способа лечения, включают последовательности, которые кодируют данные пептиды и их функциональные производные. Любая из многочисленных последовательностей нуклеиновых кислот может быть использована для кодирования данных пептидов и из производных на основе вырожденности генетического кода.
Следующие ссылки включены в данное описание во всей своей полноте.
1. Principles of Pre-clinical Research of New Drugs, People's Republic of China. 1993, 7: 134-135
2. Shuyun Xu, Rulian Bian, Xiu Chen. Methodology of pharmacological experiment. People's Health Publishing House. 1991, 1221-1234
3. Principle of new drug research in pre-clinic issued by Ministry of Health, People's Republic of China. 1993, 7: 140
4. Jinsheng He, Ruizhu Li, Tingyi Zong. The study on MTT reduction method of testing NK cell activity. China Immunology Journal. 1996, 1(6): 356-358
5. Qian Wang. Modem medical experiment method. People's Health Publishing House. 1998, 482-483
6. Principle of new drug research in pre-clinic issued by Ministry of Health, People's Republic of China. 1993, 7: 141
7. Principle of new drug research in pre-clinic issued by Ministry of Health, People's Republic of China. 1993, 7: 132-133
8. Principle of new drug research in pre-clinic issued by Ministry of Health, People's Republic of China. 1993, 7: 128-129
9. Yuanpei Zhang, Huaide Su. Pharmacological experiment (second edition). People's Health Publishing House. 1998, 137-138
10. Jiatai Li, Clinical pharmacology (second edition). People's Health Publishing House. 1998, 1338-1339.
Пример 1
Доставка пептидов с помощью генетически сконструированных видов бактерий Lactobacillus
Далее представлен один из иллюстративных способов доставки пептидов по изобретению хозяину, как описано выше. Последовательность ДНК, кодирующая один из пептидов, перечисленных выше в таблице А, синтезирована химическими способами, и данная ДНК последовательность встроена в вектор экспрессии с использованием стандартных методов генной инженерии, известных специалистам в данной области. Выбранный вектор экспрессии содержит конститутивный промотор, функциональный в Lactobacillus, сайт множественного клонирования для введения ДНК последовательностей в специфическое 5'-3' положение, а также селективный маркерный ген, который придает устойчивость к антибиотику (для облегчения процедуры клонирования) и может включать другие последовательности, чтобы способствовать продуцированию и/или секреции пептидов, таких как сигнальные пептидные последовательности. Пример такого вектора приведен в патенте США 5592908, Pavla, который включен в данное описание в качестве ссылки во всей своей полноте. Кратко, в данном патенте обсуждаются несколько известных промоторов, которые действуют в видах Lactobacillus, а также способ обнаружения новых промоторов в указанной бактерии, любой из которых может быть функционально связан с нуклеиновой кислотой, кодирующей пептид по настоящему изобретению для экспрессии пептида Lactobacillus. Нуклеиновую кислоту, кодирующую сигнальный пептид, такой как пептиды, содержащие 16-35 наиболее гидрофобных аминокислот, которые являются активными в Lactobacillus lactis, описаны в указанном выше патенте США 5529908, помещают между промотором и нуклеиновой кислотой, кодирующей пептид по настоящему изобретению таким образом, что нуклеиновая кислота, кодирующая сигнальный пептид, находится в рамке вместе с нуклеиновой кислотой, кодирующей пептид по настоящему изобретению.
В дополнение к кодирующей последовательности пептида синтезированная последовательность ДНК может включать последовательности для облегчения лигирования и клонирования указанной ДНК в вектор экспрессии. Например, сайт распознавания рестриктаз, который соответствуют сайтам, обнаруживаемым в сайте множественного клонирования вектора, может быть встроен в синтезированную ДНК на 5' и 3' концах последовательности таким образом, что последовательность может быть клонирована в правильной ориентации в вектор. Как вектор, так и синтезированная ДНК, расщепляются конкретными ферментами рестрикции, а затем очищаются. После реакций лигирования вектора и синтезированной ДНК проводят трансформирование в подходящий штамм E.Coli. Трансформированную бактерию помещают в среду, содержащую антибиотик, к которому вектору придана устойчивость. Колонию трансформированных бактерий отбирают для роста культур и процедур получения плазмид; подтверждают присутствие синтезированной ДНК в правильной ориентации.
Такой вектор экспрессии затем трансформируют в бактериальную клетку-хозяина видов Lactobacillus, таких как L.acidophilus. Трансформированные клетки отбирают на основании селективного маркера, обнаруживаемого в последовательности вектора, и секреция пептида может быть подтверждена проведением вестерн-блоттинга, проведением гелевого электрофореза пептидов, присутствующих в среде для роста, или другими стандартными способами. Отбирают трансформированную колонию бактерий и используют для получения в крупном масштабе культуры бактерий, полученных методами генной инженерии. Выращивают культуру генетически сконструированных бактерий, экспрессирующих желаемый пептид, и по крайней мере часть ее вводят в пищеварительный тракт, влагалище, трахею или другие области организма-хозяина, где бактерии способны реплицироваться. При желании, бактериальные культуры могут быть обработаны разными способами для получения добавок к потреблению в кишечнике хозяина. Такие обработки включают лиофилизацию или другие способы сохранения бактерий, в дополнение к комбинированию бактерий с агентами-носителями, такими как растворы, растворители, диспергирующие среды, задерживающие высвобождение агенты, эмульсии и тому подобные. Применение таких агентов для получения добавок хорошо известно в данной области. Например, бактерии можно использовать для получения содержащих культуры молочных продуктов или других продуктов питания для потребления человеком, так что организм, экспрессирующий пептид, образует колонии в пищеварительном тракте организма-хозяина. Число различных способов введения специфических штаммов молочнокислых бактерий в продукты питания, такие как йогурт, кимчи, сыр и масло, описаны в патенте США 6036952, Oh, который включен в данное описание в качестве ссылки во всей своей полноте. При потреблении бактерий через один из множества путей сконструированные организмы могут заселять в пищеварительный тракт и дать возможность предоставлять и/или поглощать пептиды по данному изобретению через слизистый слой пищеварительного тракта.
Пример 2
Доставка пептидов с помощью генетически сконструированных форм Bacillus subtilis
Далее представлен другой иллюстративный способ доставки пептидов по изобретению хозяину, как описано выше. Последовательность ДНК, кодирующая один из пептидов, перечисленных выше в таблице А, синтезирована химическими способами, и данная ДНК последовательность вставлена в вектор экспрессии с использованием стандартных методов генной инженерии; все методы известны специалистам в данной области. Выбранный вектор экспрессии включает челночный вектор, такой как pTZ18R (Pharmacia, Piscataway, NJ), способный размножаться как в E.coli, так и в B.Subtilis и содержащий ген устойчивости к антибиотикам для отбора колоний трансформированных бактерий. Такой вектор может содержать конститутивный промотор, активный в B.Subtilis, такой как промотор, полученный из Sac B гена B.Subtilis, а также нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный или лидерный пептид, активный в B.Subtilis, который регулирует эффективный экспорт экспрессированных гетерологичных белков из бактериальной клетки. Пример такого вектора описан в патенте США 6268169, Fahnestock, описание которого включено в качестве ссылки во всей своей полноте. Кратко, как подробно описано выше, ДНК, кодирующая пептид по данному изобретению будет синтезирована с помощью ферментативных сайтов рестрикции и/или других последовательностей для облегчения клонирования ДНК с помощью методов, знакомых специалистам в данной области. После трансформации в E.Coli, выращивания культуры на пластинке, отбора и размножения плазмиды для создания источника плазмид, плазмиду трансформируют в B.Subtilis и отбирают трансформанты на основании устойчивости к антибиотику в среде для выращивания культуры.
Продуцирование пептида и секрецию из генетически сконструированных B.Subtilis подтверждают с использованием способов, хорошо известных специалистам в данной области, таких как мечение пептидов изотопной меткой для авторадиографического обнаружения после SDS-PAGE анализа или вестерн-блоттинга.
Выращивают культуру генетически сконструированных бактерий и по крайней мере часть ее вводят в пищеварительный тракт, влагалище, трахею или другие области организма-хозяина, где бактерии способны воспроизводиться.
Пример 3
Доставка пептидов с помощью генетически сконструированных видов дрожжей Saccharomyces
Далее представлен другой иллюстративный способ доставки пептидов по изобретению хозяину, как описано выше. Последовательность ДНК, кодирующая один из пептидов, перечисленных выше в таблице А, синтезирована химическими способами, и данная ДНК последовательность вставлена в вектор экспрессии с использованием методов генной инженерии; все методы известны специалистам в данной области. Выбранный вектор экспрессии включает стабильно поддерживаемый дрожжевой белковый вектор экспрессии, включающий конститутивный дрожжевой промотор, такой как pADH1, сайты для репликации вектора как в дрожжах, так и в E.coli., ген, придающий фототрофию ауксотрофным дрожжевым мутантам для выбранных целей, сайт множественного клонирования (MCS) и, при желании, последовательности, которые кодируют сигнальный пептид. Векторы, такие какие как указанный, являются коммерчески доступными и хорошо известны в данной области или легко могут быть сконструированы с использованием стандартных методов. После встраивания синтезированной ДНК в дрожжевой вектор, трансформации в E.Coli, выращивания трансформированных E.Coli на селективной среде, отбора трансформированной бактериальной колонии и получения плазмидной ДНК из выращенной культуры бактерий из указанной колонии, вектор трансформируют в Saccharomyces cerevisiae с помощью хорошо известных способов, таких как литий-ацетатное трансформирование или электропорация. Штамм Saccharomyces cerevisiae, выбранный для трансформации, представляет собой мутантный ауксотрофный штамм, который требует ген на плазмиде для роста на минимальной среде на пластинах. Трансформированные дрожжевые колонии выделяют, выращивая дрожжи на среде для роста без гена, встроенного в вектор. Только такие дрожжи, которые получили вектор и его селективный ген и экспрессируют такой генный продукт, будут способны вырастать в колонии на минимальной среде. Подтверждение секреции пептида может быть получено при проведении вестерн-блоттинга, проведении гель-электрофореза пептидов, присутствующих в среде роста, или другими стандартными способами.
Отбирают трансформированную колонию дрожжей и используют для крупномасштабного получения культур. Выращивают культуру генетически сконструированных дрожжей и по крайней мере часть ее вводят в пищеварительный тракт, влагалище, трахею или другие области организма-хозяина, где бактерии способны воспроизводиться. При желании, дрожжевые культуры могут быть обработаны разными способами для получения добавок к потреблению в кишечнике хозяина. Такие обработки включают лиофилизацию или другие способы сохранения дрожжей, в дополнение к комбинированию бактерий с агентами-носителями, такими как растворы, растворители, диспергирующие среды, задерживающие высвобождение агенты, эмульсии и тому подобные. Применение таких агентов для получения добавок хорошо известно в данной области. В другом варианте осуществления трансформированные дрожжи используют для создания пищевых продуктов, таких как ферментированные молочные продукты, например, йогурт и кефир, с использованием технологий, хорошо известных специалистам в данной области. Как и в случае живых молочнокислых бактериальных культур в таких продуктах питания, трансформированные дрожжи образуют колонии в пищеварительном тракте по крайней мере временно и служат для предоставления пептидов хозяину через просвет пищеварительного тракта.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| ВЫДЕЛЕННЫЙ ПЕПТИД, СТИМУЛИРУЮЩИЙ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЙ ИММУННЫЙ ОТВЕТ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ЕГО ОСНОВЕ, СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ МЛЕКОПИТАЮЩЕГО И СПОСОБ МОДУЛЯЦИИ ИММУННОГО ОТВЕТА | 2002 |
|
RU2425053C2 |
| КОМПЛЕКС ДЛЯ УСИЛЕНИЯ ИММУННОГО ОТВЕТА | 2019 |
|
RU2779622C2 |
| СПОСОБЫ И АНТИТЕЛА ДЛЯ МОДУЛЯЦИИ ИММУННОГО ОТВЕТА | 2016 |
|
RU2757489C2 |
| ПРИМЕНЕНИЕ ИНГИБИРУЮЩИХ TGF-бета1 ПЕПТИДОВ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ МОДУЛИРУЮЩЕГО ИММУННЫЙ ОТВЕТ АГЕНТА | 2005 |
|
RU2420307C2 |
| КОМПОЗИЦИЯ ДНК ДЛЯ ВЫЗОВА ИММУННОГО ОТВЕТА ПРОТИВ ОПУХОЛЕАССОЦИИРОВАННЫХ МАКРОФАГОВ | 2007 |
|
RU2459631C2 |
| Иммунобиологическое средство для повышения клеточного ответа против вируса гепатита С | 2023 |
|
RU2811136C1 |
| СТИМУЛЯЦИЯ ИММУННОГО ОТВЕТА ЭНАНТИОМЕРАМИ КАТИОННЫХ ЛИПИДОВ | 2009 |
|
RU2530555C2 |
| ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ ДОСТАВКА БИОМОЛЕКУЛ ДЛЯ МОДУЛЯЦИИ ИММУННОГО ОТВЕТА | 2019 |
|
RU2819143C2 |
| НОВЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ПЕПТИДЫ И ИХ НОВОЕ ПРИМЕНЕНИЕ | 2006 |
|
RU2423375C2 |
| ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ВИРУСА ПРОСТОГО ГЕРПЕСА 2 ТИПА: КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ЗАПУСКА ИММУННОГО ОТВЕТА | 2010 |
|
RU2585961C9 |
Изобретение относится к биотехнологии и медицине. Предлагаются пептид структуры TyrSerLeu, фармацевтическая композиция на его основе, которую используют для стимулирования противоопухолевого иммунного ответа, а также способы лечения млекопитающего и модуляции иммунного ответа. Предлагаемые изобретения расширяют арсенал средств для лечения раковых заболеваний. 4 н. и 16 з.п. ф-лы, 49 табл.
| US 5861483 А, 19.01.1999 | |||
| WO 9812219 А, 26.03.1998 | |||
| Гидрометаллургический способ переработки материалов, содержащих свинец и сурьму | 1941 |
|
SU63233A1 |
