ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ ДОСТАВКА БИОМОЛЕКУЛ ДЛЯ МОДУЛЯЦИИ ИММУННОГО ОТВЕТА Российский патент 2024 года по МПК C12N5/783 A61K35/17 A61K39/00 A61K39/39 A61P37/02 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

[0001] По этой заявке испрашивается приоритет временной заявки на патент США № 62/641987, поданной 12 марта 2018 г., временной заявки на патент США № 62/738941, поданной 28 сентября 2019 г., и временной заявки на патент США № 62/794516, поданной 18 января 2019 г.; которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки.

Представление списка последовательностей в электронном виде в текстовом файле ASCII

[0002] Настоящая заявка содержит список последовательностей, который был представлен в текстовом файле ASCII и который в полном объеме включен в настоящий документ посредством ссылки: компьютерно-читаемая форма (CRF) списка последовательностей (название файла 750322001540SEQLIST.TXT, дата записи: 11 марта 2019 г., размер: 14 КБ).

Область техники, к которой относится изобретение

[0003] Настоящее изобретение, в общем, относится к Т-клеткам, содержащим антиген и/или адъювант, способам получения таких Т-клеток и способам применения таких Т-клеток, например, для модуляции иммунного ответа у субъекта.

Уровень техники

[0004] Иммунотерапию можно разделить на два основных типа вмешательств: пассивную и активную. Протоколы пассивной стратегии включают введение предварительно активированных и/или сконструированных клеток, терапевтических антител, специфичных для заболевания, и/или цитокинов. Стратегии активной иммунотерапии направлены на стимуляцию эффекторных функций иммунной системы in vivo. Несколько действующих в настоящее время активных протоколов включают стратегии вакцинации ассоциированными с заболеванием пептидами, лизатами или аллогенными цельными клетками, инфузию аутологичных DC в качестве носителей для доставки опухолевого антигена и введение модуляторов иммунных контрольных точек. См. Papaioannou, Nikos E. et al., Annals of translational medicine 4.14 (2016).

[0005] Цитотоксические CD8+ Т-лимфоциты (CTL) и CD4+ Т(Th)-хелперы, стимулированные антигенами, ассоциированными с заболеванием, обладают способностью нацеливать и уничтожать патологические клетки, однако современные методы индукции эндогенных Т-клеточных ответов сталкиваются с проблемами.

[0006] Все ссылки, цитированные в настоящем описании, включая патентные заявки и публикации, в полном объеме включены здесь посредством ссылки.

Сущность изобретения

[0007] В некоторых аспектах изобретение относится к модифицированной Т-клетке, содержащей антиген и адъювант, где антиген является экзогенным по отношению к модифицированной Т-клетке и включает иммуногенный эпитоп, и где адъювант находится внутриклеточно. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к модифицированной Т-клетке, включающей антиген, содержащий аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 18-25.

[0008] В некоторых аспектах изобретение относится к модифицированной Т-клетке, содержащей антиген и адъювант, где антиген содержит иммуногенный эпитоп, полученной способом, включающим стадии: а) пропускание клеточной суспензии, содержащей входную Т-клетку, через деформирующее клетку сужение, где диаметр сужения является функцией диаметра входной Т-клетки в суспензии, что вызывает, тем самым, пертурбации входной Т-клетки, достаточно большие для того, чтобы антиген и адъювант прошли через них, с образованием пертурбированной входной Т-клетки; и b) инкубирование пертурбированной входной Т-клетки с антигеном и адъювантом в течение достаточного периода времени для обеспечения проникновения антигена и адъюванта в пертурбированную входную Т-клетку; с получением, тем самым, модифицированной T-клетки, содержащей антиген и адъювант. В некоторых вариантах осуществления концентрация антигена, инкубированного с пертурбированной входной Т-клеткой, составляет от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 1 мМ, и/или концентрация адъюванта, инкубированного с пертурбированной входной Т-клеткой, составляет от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления соотношение антигена и адъюванта, инкубированных с пертурбированной входной Т-клеткой, составляет от приблизительно 10000:1 до приблизительно 1:10000.

[0009] В некоторых аспектах изобретение относится к модифицированной Т-клетке, содержащей антиген и адъювант, где антиген содержит иммуногенный эпитоп, полученной способом, включающим стадии: а) пропускание клеточной суспензии, содержащей входную Т-клетку, содержащую адъювант, через деформирующее клетку сужение, где диаметр сужения является функцией диаметра входной Т-клетки в суспензии, что вызывает, тем самым, пертурбации входной Т-клетки, достаточно большие для того, чтобы антиген прошел через них, с образованием пертурбированной входной Т-клетки; и b) инкубирование пертурбированной входной Т-клетки с антигеном в течение достаточного периода времени для обеспечения проникновения антигена в пертурбированную входную Т-клетку; с получением, тем самым, модифицированной T-клетки, содержащей антиген и адъювант. В некоторых вариантах осуществления концентрация антигена, инкубированного с пертурбированной входной Т-клеткой, составляет от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 1 мМ.

[0010] В некоторых аспектах изобретение относится к модифицированной Т-клетке, содержащей антиген и адъювант, где антиген содержит иммуногенный эпитоп, полученной способом, включающим стадии: а) пропускание клеточной суспензии, содержащей входную Т-клетку, содержащую антиген, через деформирующее клетку сужение, где диаметр сужения является функцией диаметра входной Т-клетки в суспензии, что вызывает, тем самым, пертурбации входной Т-клетки, достаточно большие для того, чтобы адъювант прошел через них, с образованием пертурбированной входной Т-клетки; и b) инкубирование пертурбированной входной Т-клетки с адъювантом в течение достаточного периода времени для обеспечения проникновения адъюванта в пертурбированную входную Т-клетку; с получением, тем самым, модифицированной T-клетки, содержащей антиген и адъювант. В некоторых вариантах осуществления концентрация адъюванта, инкубированного с пертурбированной входной Т-клеткой, составляет от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 1 мМ.

[0011] В некоторых вариантах осуществления к входной Т-клетке прикладывается деформирующая сила, когда она проходит через сужение, что вызывает, тем самым, пертурбации входной Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию инкубирования входной Т-клетки и/или модифицированной Т-клетки с агентом, который повышает жизнеспособность и/или функцию модифицированной Т-клетки по сравнению с соответствующей модифицированной Т-клеткой, полученной без дополнительной стадии инкубирования. В некоторых вариантах осуществления агент представляет соединение, которое усиливает эндоцитоз или действует в качестве стабилизирующего агента или кофактора. В некоторых вариантах осуществления диаметр сужения меньше диаметра входной Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления диаметр сужения составляет от приблизительно 20% до приблизительно 99% от диаметра входной Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления диаметр сужения составляет от приблизительно 20% до приблизительно 60% от диаметра входной Т-клетки.

[0012] В некоторых вариантах осуществления антиген и/или адъювант находятся в цитозоле и/или везикуле модифицированной Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления везикула представляет собой эндосому. В некоторых вариантах осуществления антиген и/или адъювант находятся во многих компартментах модифицированной Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления антиген или иммуногенный эпитоп связывается с поверхностью модифицированной Т-клетки.

[0013] В некоторых вариантах осуществления адъювант представляет олигодезоксинуклеотид CpG (ODN), IFN-α, агонисты STING, агонисты RIG-I или поли I:C. В некоторых вариантах осуществления адъювант представляет CpG ODN. В некоторых вариантах осуществления CpG ODN представляет CpG ODN класса A, CpG ODN класса B или CpG ODN класса C.

[0014] В некоторых вариантах осуществления иммуногенный эпитоп происходит из антигена, ассоциированного с заболеванием. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный эпитоп происходит из пептидов или мРНК, выделенных из патологической клетки. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный эпитоп происходит из чужеродного антигена. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммуногенный эпитоп происходит из опухолевого антигена, вирусного антигена, бактериального антигена или грибкового антигена. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный эпитоп происходит из антигена вируса папилломы человека (ВПЧ). В некоторых вариантах осуществления ВПЧ представляет ВПЧ-16 или ВПЧ-18. В некоторых вариантах осуществления антиген включает HLA-A2-рестриктированный пептид, полученный из ВПЧ E6 и/или E7. В некоторых вариантах осуществления HLA-A2-рестриктированный пептид содержит аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 1-4. В некоторых вариантах осуществления антиген содержит аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 18-25. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка содержит множество антигенов, которые содержат множество иммуногенных эпитопов. В некоторых вариантах осуществления изобретения после введения субъекту модифицированной Т-клетки, содержащей множество антигенов, которые включают множество иммуногенных эпитопов, ни один из множества иммуногенных эпитопов не снижает иммунный ответ у субъекта на любой из других иммуногенных эпитопов. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет полипептид, и иммуногенный эпитоп представляет иммуногенный пептидный эпитоп. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный пептидный эпитоп слит с N-концевым фланкирующим полипептидом и/или C-концевым фланкирующим полипептидом. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет полипептид, содержащий иммуногенный пептидный эпитоп и одну или более гетерологичных пептидных последовательностей. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет полипептид, содержащий иммуногенный пептидный эпитоп, который фланкирован на N-конце и/или C-конце гетерологичными пептидными последовательностями. В некоторых вариантах осуществления фланкирующие гетерологичные пептидные последовательности происходят из иммуногенных пептидов, ассоциированных с заболеванием. В некоторых вариантах осуществления N-концевой фланкирующий полипептид содержит аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 5-10, и/или C-концевой фланкирующий полипептид содержит аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 11- 17. В некоторых вариантах осуществления антиген способен процессироваться в пептид, рестриктированный классом I MHC, и/или пептид, рестриктированный классом II MHC.

[0015] В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка содержит адъювант в концентрации от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка содержит антиген в концентрации от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления соотношение антигена и адъюванта составляет от приблизительно 10000:1 до приблизительно 1:10000. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка содержит комплекс, включающий: а) антиген, b) антиген и по меньшей мере один другой антиген и/или с) антиген и адъювант.

[0016] В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка дополнительно содержит агент, который повышает жизнеспособность и/или функцию модифицированной Т-клетки по сравнению с соответствующей модифицированной Т-клеткой, которая не содержит агента. В некоторых вариантах осуществления агент представляет соединение, усиливающее эндоцитоз, стабилизирующий агент или кофактор. В некоторых вариантах осуществления агент представляет альбумин. В некоторых вариантах осуществления альбумин представляет мышиный, бычий или человеческий альбумин. В некоторых вариантах осуществления агент представляет катион двухвалентного металла, глюкозу, АТФ, калий, глицерин, трегалозу, D-сахарозу, PEG1500, L-аргинин, L-глутамин или ЭДТА. В некоторых вариантах осуществления агент включает сывороточный альбумин мыши (MSA).

[0017] В некоторых вариантах осуществления клетки дополнительно модифицируют для увеличения экспрессии одной или более костимулирующих молекул. В некоторых вариантах осуществления костимулирующая молекула представляет B7-H2 (ICOSL), B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), CD70, LIGHT, HVEM, CD40, 4-1BBL, OX40L, TL1A, GITRL, CD30L, TIM4, SLAM, CD48, CD58, CD155 или CD112. В некоторых вариантах осуществления клетка содержит нуклеиновую кислоту, которая приводит к повышенной экспрессии одной или более костимулирующих молекул. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка содержит дополнительную модификацию для модуляции экспрессии молекул MHC класса I. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка содержит дополнительную модификацию для модуляции молекул экспрессии MHC класса II.

[0018] В некоторых вариантах осуществления в аллогенном контексте врожденный иммунный ответ, развившийся у субъекта в ответ на введение модифицированных Т-клеток, снижен, в аллогенном контексте, по сравнению с врожденным иммунным ответом, развившимся у субъекта в ответ на введение соответствующих модифицированных Т-клеток, которые не содержат дополнительную модификацию. В некоторых вариантах осуществления период полужизни в кровотоке модифицированных Т-клеток у субъекта, которому они были введены, увеличивается по сравнению с периодом полужизни в кровотоке соответствующих модифицированных Т-клеток, которые не содержат дополнительных модификаций, у субъекта, которому они были введены.

[0019] В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка включает одно или более из Т-хелперов, цитотоксических Т-клеток, Т-клеток памяти или естественных Т-клеток-киллеров. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка включает одно или более из CD3+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток, CD45RA+ Т-клеток, CD45RO+ Т-клеток или γδ-Т-клеток.

[0020] В некоторых аспектах изобретение относится к композиции, содержащей любые модифицированные Т-клетки, описанные здесь. В некоторых аспектах изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей модифицированные Т-клетки, описанные здесь, и фармацевтически приемлемый носитель.

[0021] В некоторых аспектах изобретение относится к способу модуляции иммунного ответа у субъекта, включающему введение субъекту модифицированной Т-клетки, описанной здесь, композиции, описанной здесь, или фармацевтической композиции, описанной здесь.

[0022] В некоторых аспектах изобретение относится к способу модуляции иммунного ответа у субъекта, включающему: a) введение субъекту модифицированной Т-клетки, включающей антиген, содержащий аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 18-25; и b) введение субъекту адъюванта.

[0023] В некоторых аспектах изобретение относится к способу модуляции иммунного ответа у субъекта, включающему: а) пропускание клеточной суспензии, содержащей входную Т-клетку, через деформирующее клетку сужение, где диаметр сужения является функцией диаметра входной Т-клетки в суспензии, что вызывает, тем самым, пертурбации входной Т-клетки, достаточно большие для того, чтобы антиген и адъювант прошли через них, с образованием пертурбированной входной Т-клетки, где антиген содержит имуногенный эпитоп; b) инкубацию пертурбированной входной Т-клетки с антигеном и адъювантом в течение достаточного периода времени для обеспечения проникновения антигена и адъюванта в пертурбированную входную Т-клетку; с получением, тем самым, модифицированной T-клетки, содержащей антиген и адъювант; и с) введение субъекту модифицированной Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления концентрация антигена, инкубированного с пертурбированной входной Т-клеткой, составляет от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 1 мМ, и/или концентрация адъюванта, инкубированного с пертурбированной входной Т-клеткой, составляет от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления слотношение антигена и адъюванта, инкубированных с пертурбированной входной Т-клеткой, составляет от приблизительно 10000:1 до приблизительно 1:10000.

[0024] В некоторых аспектах изобретение относится к способу модуляции иммунного ответа у субъекта, включающему: а) пропускание клеточной суспензии, содержащей входную Т-клетку, содержащую адъювант, через деформирующее клетку сужение, где диаметр сужения является функцией диаметра входной Т-клетки в суспензии, что вызывает, тем самым, пертурбации входной Т-клетки, достаточно большие для того, чтобы антиген прошел через них, с образованием пертурбированной входной Т-клетки, где антиген содержит иммуногенный эпитоп; и b) инкубацию пертурбированной входной Т-клетки с антигеном в течение достаточного периода времени для обеспечения проникновения антигена в пертурбированную входную Т-клетку; с получением, тем самым, модифицированной T-клетки, содержащей антиген и адъювант; и с) введение субъекту модифицированной Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления концентрация антигена, инкубированного с пертурбированной входной Т-клеткой, составляет от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 1 мМ.

[0025] В некоторых аспектах изобретение относится к способу модуляции иммунного ответа у субъекта, включающему: а) пропускание клеточной суспензии, содержащей входную Т-клетку, содержащую антиген, через деформирующее клетку сужение, где антиген содержит иммуногенный эпитоп, где диаметр сужения является функцией диаметра входной Т-клетки в суспензии, что вызывает, тем самым, пертурбации входной Т-клетки, достаточно большие для того, чтобы адъювант прошел через них, с образованием пертурбированной входной Т-клетки; b) инкубацию пертурбированной входной Т-клетки с адъювантом в течение достаточного периода времени для обеспечения проникновения адъюванта в пертурбированную входную Т-клетку; с получением, тем самым, модифицированной T-клетки, содержащей антиген и адъювант; и с) введение субъекту модифицированной Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления концентрация адъюванта, инкубированного с пертурбированной входной Т-клеткой, составляет от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка содержит антиген в концентрации от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка содержит адъювант в концентрации от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления соотношение антигена и адъюванта в модифицированной Т-клетке составляет от приблизительно 10000:1 до приблизительно 1:10000.

[0026] В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка содержит комплекс, включающий: а) антиген, b) антиген и, по меньшей мере, один другой антиген, и/или c) антиген и адъювант.

[0027] В некоторых аспектах изобретение относится к способу модуляции иммунного ответа у субъекта, включающему: а) пропускание клеточной суспензии, содержащей входную Т-клетку, через деформирующее клетку сужение, где диаметр сужения является функцией диаметра входной Т-клетки в суспензии, что вызывает, тем самым, пертурбации входной Т-клетки, достаточно большие для того, чтобы антиген прошел через них, с образованием пертурбированной входной Т-клетки, где антиген содержит иммуногенный эпитоп; и b) инкубацию пертурбированной входной Т-клетки с антигеном в течение достаточного периода времени для обеспечения проникновения антигена в пертурбированную входную Т-клетку; с получением, тем самым, модифицированной T-клетки, содержащей антиген; с) введение субъекту модифицированной Т-клетки; и d) введение субъекту адъюванта. В некоторых вариантах осуществления концентрация антигена, инкубированного с пертурбированной входной Т-клеткой, составляет от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 1 мМ.

[0028] В некоторых вариантах осуществления к входной Т-клетке прикладывается деформирующая сила, когда она проходит через сужение, вызывая тем самым пертурбации входной Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает стадию инкубирования входной Т-клетки и/или модифицированной Т-клетки с агентом, который повышает жизнеспособность и/или функцию модифицированной Т-клетки по сравнению с соответствующей модифицированной Т-клеткой, полученной без дополнительной стадии инкубирования. В некоторых вариантах осуществления агент представляет соединение, усиливающее эндоцитоз, стабилизирующий агент или кофактор. В некоторых вариантах осуществления способов иммунный ответ усиливается. В некоторых вариантах осуществления усиленный иммунный ответ направлен на антиген. В некоторых вариантах осуществления диаметр сужения меньше диаметра входной Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления диаметр сужения составляет от приблизительно 20% до приблизительно 99% от диаметра входной Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления диаметр сужения составляет от приблизительно 20% до приблизительно 60% от диаметра входной Т-клетки.

[0029] В некоторых вариантах осуществления антиген и/или адъювант находятся в цитозоле и/или везикуле модифицированной Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления везикула представляет эндосому. В некоторых вариантах осуществления антиген и/или адъювант находятся во многих компартментах модифицированной Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления антиген или иммуногенный эпитоп связывается с поверхностью модифицированной Т-клетки.

[0030] В некоторых вариантах осуществления изобретения адъювант представляет CpG ODN, IFN-α, агонисты STING, агонисты RIG-I или поли I:C. В некоторых вариантах осуществления адъювант представляет CpG ODN. В некоторых вариантах осуществления CpG ODN представляет CpG ODN класса A, CpG ODN класса B или CpG ODN класса C.

[0031] В некоторых вариантах осуществления иммуногенный эпитоп происходит из антигена, ассоциированного с заболеванием. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный эпитоп происходит из пептидов или мРНК, выделенных из патологической клетки. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный эпитоп происходит из чужеродного антигена. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный эпитоп происходит из опухолевого антигена, вирусного антигена, бактериального антигена или грибкового антигена. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный эпитоп происходит из антигена вируса папилломы человека (ВПЧ). В некоторых вариантах осуществления ВПЧ представляет ВПЧ-16 или ВПЧ-18. В некоторых вариантах осуществления антиген включает HLA-A2-рестриктированный пептид, полученный из HPV E6 и/или E7. В некоторых вариантах осуществления HLA-A2-рестриктированный пептид содержит аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 1-4. В некоторых вариантах осуществления антиген содержит аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 18-25. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка содержит множество антигенов, которые содержат множество иммуногенных эпитопов. В некоторых вариантах осуществления ни один из множества иммуногенных эпитопов не снижает иммунный ответ субъекта на любой из других иммуногенных эпитопов. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет полипептид, и иммуногенный эпитоп представляет собой иммуногенный пептидный эпитоп. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный пептидный эпитоп слит с N-концевым фланкирующим полипептидом и/или C-концевым фланкирующим полипептидом. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный пептидный эпитоп, слитый с N-концевым фланкирующим полипептидом и/или C-концевым фланкирующим полипептидом, представляет не встречающуюся в природе последовательность. В некоторых вариантах осуществления N-концевые и/или C-концевые фланкирующие полипептиды полуены из иммуногенного синтетического длинного пептида (SLP). В некоторых вариантах осуществления N-концевые и/или C-концевые фланкирующие полипептиды происходят из иммуногенных SLP, ассоциированных с заболеванием. В некоторых вариантах осуществления N-концевой фланкирующий полипептид содержит аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 5-10, и/или C-концевой фланкирующий полипептид содержит аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 11- 17. В некоторых вариантах осуществления антиген способен процессироваться в пептид, рестриктированный классом I MHC, и/или пептид, рестриктированный классом II MHC.

[0032] В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка дополнительно содержит агент, который повышает жизнеспособность и/или функцию модифицированной Т-клетки по сравнению с соответствующей модифицированной Т-клеткой, которая не включает агента. В некоторых вариантах осуществления агент представляет соединение, усиливающее эндоцитоз, стабилизирующий агент или кофактор. В некоторых вариантах осуществления агент представляет альбумин. В некоторых вариантах осуществления альбумин представляет мышиный, бычий или человеческий альбумин. В некоторых вариантах осуществления агент представляет катион двухвалентного металла, глюкозу, АТФ, калий, глицерин, трегалозу, D-сахарозу, PEG1500, L-аргинин, L-глутамин или ЭДТА. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка содержит дополнительную модификацию для модуляции экспрессии молекул MHC класса I. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка включает дополнительную модификацию для модуляции экспрессии молекул MHC класса II.

[0033] В некоторых вариантах осуществления в аллогенном контексте врожденный иммунный ответ, развившийся у субъекта в ответ на введение модифицированных Т-клеток, снижен, в аллогенном контексте, по сравнению с врожденным иммунным ответом, развившимся у субъекта в ответ на введение соответствующих модифицированных Т-клеток, которые не содержат дополнительную модификацию. В некоторых вариантах осуществления период полужизни в кровотоке модифицированных Т-клеток у субъекта, которому они были введены, увеличивается по сравнению с периодом полужизни в кровотоке соответствующих модифицированных Т-клеток, которые не содержат дополнительных модификаций у субъекта, которому они были введены.

[0034] В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка включает одно или более из Т-хелперов, цитотоксических Т-клеток, Т-клеток памяти или естественных Т-клеток-киллеров. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка включает одно или более из CD3+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток, CD45RA+ Т-клеток, CD45RO+ Т-клеток или γδ-Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка является аллогенной для субъекта. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка является аутологичной для субъекта. В некоторых вариантах осуществления субъект предварительно кондиционирован к модуляции воспаления и/или иммунного ответа.

[0035] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение пациенту второго адъюванта. В некоторых вариантах осуществления второй адъювант представляет IFN-α или CpG ODN. В некоторых вариантах осуществления модифицированные Т-клетки и второй адъювант вводят вместе или одновременно. В некоторых вариантах осуществления модифицированные Т-клетки и второй адъювант вводят последовательно. В некоторых вариантах осуществления модифицированные Т-клетки вводят до введения второго адъюванта. В некоторых вариантах осуществления модифицированные Т-клетки вводят после введения второго адъюванта.

[0036] В некоторых вариантах осуществления модифицированную Т-клетку вводят до, одновременно или после введения ингибитора иммунных контрольных точек. В некоторых вариантах осуществления ингибитор иммунных контрольных точек нацелен на любое из PD-1, PD-L1, CTLA-4 и TIM-3. В некоторых вариантах осуществления введение модифицированной Т-клетки субъекту приводит к активации и/или экспансии цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL), специфических для данного антигена. В некоторых вариантах осуществления введение модифицированной Т-клетки субъекту приводит к активации и/или экспансии Т(Th)-хелперов, специфических для антигена. В некоторых вариантах осуществления количество модифицированных Т-клеток, вводимых субъекту, составляет от приблизительно 1×10⁶ до приблизительно 1×10¹² клеток.

[0037] В некоторых вариантах осуществления способ включает многократное введение модифицированной Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления временной интервал между двумя последовательными введениями модифицированной Т-клетки составляет от приблизительно 1 суток до приблизительно 30 суток.

[0038] В некоторых аспектах изобретение относится к способу модуляции иммунного ответа у субъекта, включающему: введение субъекту модифицированной Т-клетки, ассоциированной с антигеном, где модифицированная Т-клетка получена способом, включающим стадии:

[0039] а) инкубация входной Т-клетки с антигеном и/или адъювантом в течение достаточного периода времени для обеспечения связывания антигена с клеточной поверхностью входной Т-клетки, где антиген содержит иммуногенный эпитоп, тем самым получая модифицированную Т-клетку, ассоциированную с антигеном; и b) введение модифицированной Т-клетки субъекту. В некоторых вариантах осуществления антиген ВПЧ содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере, с 90% сходством с любой из SEQ ID NO: 18-25. В некоторых вариантах осуществления антиген ВПЧ содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23. В некоторых вариантах осуществления адъювант представляет CpG ODN. В некоторых вариантах осуществления CpG ODN представляет собой CpG ODN 1018, CpG ODN 1826 или CpG ODN 2006.

Краткое описание фигур

[0040] На фиг. 1А представлена репрезентативная схема по группам обработки и схема опыта. На фиг. 1B приведены результаты оценки роста опухолей, измеренные по формуле ((длина × ширина²)/2), по сравнению с мышами из необработанной группы (без адоптивного переноса Т-клеток) и обработанных групп B-E, показанных на фиг. 1A.

[0041] На фиг. 2A представлена репрезентативная схема оценки антигенов E7. На фиг. 2B показано влияние последовательности SLP на продуцирующие IFN-γ CD8+ Т-клетки, продуцированные в ответ на вакцинацию T_APC.

[0042] На фиг. 3 представлен график, показывающий способность E6 SLP индуцировать антигенспецифический иммунный ответ в Т-клетках E6 респондерах на человеческой модели in vitro.

[0043] На фиг. 4 показана способность E7 SLP индуцировать антигенспецифический иммунный ответ в Т-клетках E7_11-20 респондерах, а также влияние последовательности SLP на активацию Т-клеток APC (T_apc), полученных с использованием устройства SQZ, на человеческой модели in vitro.

[0044] На фиг. 5 приведены результаты исследования по оценке дозы антигена для Т-клеток APC, полученных с использованием устройства SQZ, на человеческой модели in vitro.

[0045] На фиг. 6 показаны результаты опыта по определению вариабельности донора Т-клеток APC, полученных с использованием устройства SQZ, на человеческой модели in vitro.

[0046] На фиг. 7A представлена схема опыта по сравнению силы иммунных ответов с использованием различных адъювантов. На фиг. 7B приведены результаты опыта по сравнению силы иммунных ответов с использованием поли I:C и CpG ODN.

[0047] На фиг. 8A представлена схема опыта по оценке влияния концентрации CpG ODN на иммунные ответы. На фиг. 8B приведены результаты опыта по оценке влияния концентрации CpG ODN на иммунные ответы.

[0048] На фиг. 9A представлена схема опыта по оценке схемы введения CpG ODN на иммунные ответы. На фиг. 9В приведены результаты опыта по оценке схемы введения CpG ODN на иммунные ответы.

[0049] На фиг. 10A представлена схема опыта по оценке влияния комбинации внутриклеточной доставки и системного введения адъюванта на противоопухолевую активность T_APC. На фиг. 10B приведены Т-клеточные ответы для каждой опытной группы, и на фиг. 10C показан рост опухолей для каждой опытной группы. На фиг. 10D показан рост опухолей после повторной прививки опухолевых клеток у животных, получавших SQZ (E7 + CpG), по сравнению с необработанными животными.

[0050] На фиг. 11A представлена схема опыта по оценке влияния комбинирования нескольких антигенов ВПЧ на противоопухолевую активность T_APC. На фиг. 11B показаны Т-клеточные ответы у животных в каждой опытной группе, и на фиг. 11C показан рост опухолей для каждой опытной группы.

[0051] На фиг. 12A приведены результаты опыта по оценке значения пути введения адъюванта CpG, для E7-специфического противоопухолевого эффекта T_APC. Приведена схема введения. На фиг. 12B показан объем опухолей во временной динамике у отдельных мышей в каждой группе обработки.

[0052] На фиг. 13 представлена схема опыта по оценке способности совместно введенных адъювантов приводить к инфильтрации опухолей Е7-специфическими Т-клетками. Т-клеточные ответы показаны на нижней панели.

[0053] На фиг. 14A представлена схема опыта по определению схемы вакцинации в режиме прайм и буст T_APC, нагруженных синтетическим длинным пептидом E7 (SLP) + CpG. На фиг. 14B показан рост опухолей для каждой опытной группы.

[0054] На фиг. 15 приведены результаты опыта, показывающего, что SQZ’d T_APC могут презентировать антиген непосредственно.

[0055] На фиг. 16 показано, что доставка адъюванта с помощью устройства SQZ не вызывает достоверного изменения уровней цитокинов в Т-клетках in vitro.

[0056] На фиг. 17 показано, что доставка антигена +/- адъювант с помощью SQZ достоверно не изменяет уровни цитокинов в сыворотке крови in vivo.

[0057] На фиг.18А приведены гистограммы, представляющие популяции клеток с относительным количеством минимального эпитопа, презентированного на MHC-I. На фиг.18В показано количество антигена, презентированного на клетку, измеренное по средней интенсивности флуоресценции.

[0058] На фиг. 19 показана способность Т-клеток, нагруженных антигеном CMV pp65, индуцировать антигенспецифический иммунный ответ в Т-клетках pp65 респондендерах на модели in vitro.

[0059] На фиг.20 показаны относительные уровни рекрутмента опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов (TIL) к опухолям, в которые вводили T_APC SQZ, нагруженные ВПЧ16 E7 SLP, с совместным введением адъюванта или без него.

[0060] На фиг.21 показан объем опухолей во временной динамике в опыте по оценке способности Т-клеток, нагруженных с использованием устройства SQZ, функционировать в качестве APC для профилактики роста опухолей, ассоциированных с ВПЧ, в отношении краткосрочной (опухоли на правом боку, привитая на сутки 0), а также долгосрочной защиты (опухоли на левом боку, привитая на сутки 60).

[0061] На фиг. 22 показан объем опухолей во временной динамике в опыте по оценке влияния дозы Т-клеток, совместного введения адъюванта, а также количества введений (схема прайм против схемы прайм/буст) на способность Т-клеток, нагруженных с использованием SQZ, функционировать в качестве APC для лечения опухолей, ассоциированных с ВПЧ. «P» обозначает прайм, и «B» обозначает буст на фиг. 22.

Подробное описание изобретения

[0062] Антигенпрезентирующие клетки (APC) играют ключевую роль в индукции эндогенной активации CTL. В настоящей работе описывается реализация платформы CellSqueeze® для конструирования Т-клеток APC (T_APC) для применения в модуляции иммунного ответа при различных показаниях, включая рак и инфекционные заболевания. Обеспечивая эффективную цитозольную доставку антигенов-мишеней и/или адъюванта к Т-клеткам, данная платформа показала способность индуцировать эффективную презентацию антигенов-мишеней MHC-I и стимуляцию CTL in vivo.

[0063] Настоящая заявка в некоторых аспектах относится к модифицированным Т-клеткам, содержащим антиген и адъювант, где антиген включает иммуногенный эпитоп, и где адъювант находится внутриклеточно. В некоторых вариантах осуществления модифицированные Т-клетки получают: а) пропусканием клеточной суспензии, содержащей входную Т-клетку, через деформирующее клетку сужение, где диаметр сужения является функцией диаметра входной Т-клетки в суспензии, что вызывает, тем самым, пертурбации входной Т-клетки, достаточно большие для того, чтобы антиген и адъювант прошли через них, с образованием пертурбированной входной Т-клетки; и b) инкубированием пертурбированной входной Т-клетки с антигеном и адъювантом в течение достаточного периода времени для обеспечения проникновения антигена и адъюванта в пертурбированную входную Т-клетку; с получением, тем самым, модифицированной T-клетки, содержащей антиген и адъювант. Также обеспечиваются способы применения модифицированных Т-клеток для модуляции иммунного ответа у субъекта, например, для усиления иммунного ответа у субъекта. В некоторых вариантах осуществления усиленный иммунный ответ направлен на антиген. В некоторых вариантах осуществления сужение, деформирующее клетки, находится в микрофлюидном канале, таком как любой из микрофлюидных каналов, описанных здесь.

[0064] В еще одних аспектах обеспечивается способ модуляции иммунного ответа у субъекта, включающий введение субъекту: а) модифицированной Т-клетки, содержащей антиген, где антиген содержит иммуногенный эпитоп; и b) адъюванта. В некоторых вариантах осуществления модифицированную Т-клетку получают: а) пропусканием клеточной суспензии, содержащей входную Т-клетку, через деформирующее клетку сужение, где диаметр сужения является функцией диаметра входной Т-клетки в суспензии, что вызывает, тем самым, пертурбации входной Т-клетки, достаточно большие для того, чтобы антиген прошел через них, с образованием пертурбированной входной Т-клетки; и b) инкубированием пертурбированной входной Т-клетки с антигеном в течение достаточного периода времени для обеспечения проникновения антигена в пертурбированную входную Т-клетку; с получением, тем самым, модифицированной T-клетки, содержащей антиген. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ усиливается. В некоторых вариантах осуществления усиленный иммунный ответ направлен на антиген. В некоторых вариантах осуществления сужение, деформирующее клетки, находится в микрофлюидном канале, таком как любой из микрофлюидных каналов, описанных здесь.

Общие методы

[0065] Методики и процедуры, описанные или упомянутые в настоящем описании, в общем хорошо понятны и обычно используются специалистами в данной области техники с использованием традиционных методологий, например, таких как широко используемые методологии, описанные в руководствах Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., 4^th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., 2003); в серийных изданиях Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds., 1995); Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow and Lane, eds., 1988); Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (R.I. Freshney, 6th ed., J. Wiley and Sons, 2010); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., Academic Press, 1998); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, Plenum Press, 1998); Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., J. Wiley and Sons, 1993-8); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1996); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., J. Wiley and Sons, 2002); Immunobiology (C.A. Janeway et al., 2004); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); и Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 2011).

Определения

[0066] В целях интерпретации данной заявки будут применяться следующие определения, и, где это уместно, термины, используемые в единственном числе, также будут включать термины во множественном числе и наоборот. В случае, если какое-либо определение, приведенное ниже, противоречит любому документу, включенному здесь посредством ссылки, то приведенное определение имеет преимущественную силу.

[0067] В контексте настоящего описания формы единственного числа «а», «ан» и «the» включают множественные ссылки, если не указано иное.

[0068] Подразумевается, что аспекты и варианты осуществления изобретения, описанные здесь, включают аспекты и варианты «содержащий», «состоящий» и «состоящий по существу из».

[0069] Как здесь используется, термин «приблизительно» относится к обычному диапазону ошибки для соответствующего значения, хорошо известному специалисту в данной области техники. Ссылка на «приблизительно» перед значением или параметром в настоящем описании включает (и описывает) варианты осуществления, которые относятся к данным значениям или параметрам как таковым.

[0070] Как здесь используется, термин «пора» относится к просвету, включая, помимо прочего, отверстие, разрыв, полость, апертуру, пертурбацию, щель или перфорацию в материале. В некоторых примерах (где указано) термин относится к поре на поверхности по настоящему раскрытию. В других примерах (где указано) пора может относиться к поре в клеточной мембране.

[0071] Как здесь используется, термин «мембрана» относится к избирательному барьеру или пластине, содержащим поры. Термин включает гибкую пластинчатую структуру, которая функционирует в качестве границы или выстилки. В некоторых примерах этот термин относится к поверхности или фильтру, содержащим поры. Данный термин отличается от термина «клеточная мембрана».

[0072] Как здесь используется, термин «фильтр» относится к пористому изделию, которое позволяет избирательно проходить веществу через поры. В некоторых примерах термин относится к поверхности или мембране, содержащей поры.

[0073] Как здесь используется, термин «гетерогенный» относится к чему-либо, что является смешанным или неоднородным по структуре или составу. В некоторых примерах данный термин относится к порам, имеющим различные размеры, форму или распределение на данной поверхности.

[0074] Как здесь используется, термин «гомогенный» относится к чему-либо, что является постоянным или однородным по структуре или составу везде. В некоторых примерах термин относится к порам, имеющим постоянный размер, форму или распределение на данной поверхности.

[0075] Термин «гетерологичная» в том смысле, в котором он относится к последовательностям нуклеиновых кислот, таким как кодирующие последовательности и контрольные последовательности, обозначает последовательности, которые обычно не связаны вместе и/или обычно не ассоциированы с конкретной клеткой. Таким образом, «гетерологичная» область конструкции нуклеиновой кислоты или вектора представляет собой сегмент нуклеиновой кислоты внутри или присоединенный к другой молекуле нуклеиновой кислоты, который не встречается в ассоциации с другой молекулой в природе. Например, гетерологичная область конструкции нуклеиновой кислоты может включать кодирующую последовательность, фланкированную последовательностями, не встречается в ассоциации с кодирующей последовательностью в природе. Другим примером гетерологичной кодирующей последовательности является конструкция, где сама кодирующая последовательность не встречается в природе (например, синтетические последовательности, имеющие кодоны, отличные от нативного гена). Аналогично клетка, трансформированная конструкцией, которая обычно отсутствует в клетке, будет считаться гетерологичной для целей настоящего изобретения. Аллельные варианты или встречающиеся в природе мутационные события не приводят к возникновению гетерологичной ДНК, как здесь используется.

[0076] Термин «гетерологичная», в том смысле, в котором он относится к аминокислотным последовательностям, таким как пептидные последовательности и полипептидные последовательности, обозначает последовательности, которые обычно не связаны вместе и/или обычно не ассоциированы с конкретной клеткой. Таким образом, «гетерологичная» область пептидной последовательности представляет сегмент из аминокислот внутри или присоединенный к другой молекуле аминокислоты, который не встречается в ассоциации с другой молекулой в природе. Например, гетерологичная область пептидной конструкции может включать аминокислотную последовательность пептида, фланкированную последовательностями, не встречающимися в ассоциации с аминокислотной последовательностью пептида в природе. Другим примером гетерологичной пептидной последовательности является конструкция, где сама пептидная последовательность не встречается в природе (например, синтетические последовательности, содержащие аминокислоты, отличающиеся от кодированных нативным геном). Аналогично клетка, трансформированная вектором, который экспрессирует аминокислотную конструкцию, которая обычно отсутствует в клетке, будет считаться гетерологичной для целей настоящего изобретения. Аллельные варианты или встречающиеся в природе мутации не приводят к возникновению гетерологичных пептидов, как здесь используется.

[0077] Термин «экзогенный», когда он используется в отношении агента, такого как антиген или адъювант, применительно к клетке, относится к агенту, доставленному извне клетки (то есть снаружи клетки). Клетка может иметь или не иметь агент, уже присутствующий, и может или не может продуцировать агент после доставки экзогенного агента.

[0078] Как здесь используется, термин «ингибировать» может относиться к действию блокирования, снижения, элиминации или иного противодействия присутствию или активности конкретной мишени. Ингибирование может относиться к частичному ингибированию или полному ингибированию. Например, ингибирование иммунного ответа может относиться к любому действию, приводящему к блокаде, снижению, элиминации или любому другому антагонизму иммунного ответа. В других примерах ингибирование экспрессии нуклеиновой кислоты может включать, помимо прочего, снижение транскрипции нуклеиновой кислоты, уменьшение количества мРНК (например, сайленсинг транскрипции мРНК), деградацию мРНК, ингибирование трансляции мРНК и так далее.

[0079] Как здесь используется, термин «супрессировать» может относиться к действию уменьшения, снижения, отмены, ограничения, сокращения или иного понижения присутствия или активности конкретной мишени. Супрессия может относиться к частичной супрессии или полной супрессии. Например, супрессия иммунного ответа может относиться к любому действию, приводящему к уменьшению, снижению, отмене, ограничению, сокращению или иному понижению иммунного ответа. В других примерах супрессия экспрессии нуклеиновой кислоты может включать, помимо прочего, снижение транскрипции нуклеиновой кислоты, уменьшение количества мРНК (например, сайленсинг транскрипции мРНК), деградацию мРНК, ингибирование трансляции мРНК и так далее.

[0080] Как здесь используется, термин «усиливать» может относиться к действию улучшения, повышения, наращивания или иного увеличения присутствия или активности конкретной мишени. Например, усиление иммунного ответа может относиться к любому действию, приводящему к улучшению, повышению, наращиванию или иному увеличению иммунного ответа. В одном иллюстративном примере усиление иммунного ответа может относиться к применению антигена и/или адъюванта для улучшения, повышения, наращивания или иного увеличения иммунного ответа. В других примерах усиление экспрессии нуклеиновой кислоты может включать, помимо прочего, увеличение транскрипции нуклеиновой кислоты, увеличение количества мРНК (например, повышение транскрипции мРНК), уменьшение деградации мРНК, повышение трансляции мРНК и так далее.

[0081] Как здесь используется, термин «модулировать» может относиться к действию изменения, внесения изменения, варьирования или иной модификации присутствия или активности конкретной мишени. Например, модуляция иммунного ответа может относиться к любому действию, приводящему к изменению, внесению изменения, варьированию или иной модификации иммунного ответа. В других примерах, модуляция экспрессии нуклеиновой кислоты может включать, не ограничиваясь этим, изменение транскрипции нуклеиновой кислоты, изменение количества мРНК (например, повышение транскрипции мРНК), соответствующее изменение деградации мРНК, изменение трансляции мРНК и так далее.

[0082] Как здесь используется, термин «индуцировать» может относиться к действию инициирования, побуждения, стимулирования, установления или иного получения результата. Например, индукция иммунного ответа может относиться к любому действию, приводящему к инициированию, побуждению, стимулированию, установлению или иному получению желаемого иммунного ответа. В других примерах индукция экспрессии нуклеиновой кислоты может включать, не ограничиваясь этим, инициацию транскрипции нуклеиновой кислоты, инициацию трансляции мРНК и так далее.

[0083] Как здесь используется, термин «гомологичная» относится к молекуле, полученной из одного и того же организма. В некоторых примерах термин относится к нуклеиновой кислоте или белку, которые обычно встречаются или экспрессируются в данном организме.

[0084] Как здесь используется, термин «полинуклеотид» или «нуклеиновая кислота» относится к полимерной форме из нуклеотидов любой длины, будь то рибонуклеотиды или дезоксирибонуклеотиды. Таким образом, данный термин включает, не ограничиваясь этим, одно-, двух- или полицепочечную ДНК или РНК, геномную ДНК, кДНК, гибриды ДНК-РНК или полимер, содержащий пуриновые и пиримидиновые основания, или другие природные, химически или биохимически модифицированные, неприродные или дериватизированные азотистые основания. Остов полинуклеотида может включать сахара и фосфатные группы (которые обычно можно встретить в РНК или ДНК) или модифицированные или замещенные сахара или фосфатные группы. Альтернативно, остов полинуклеотида может включать полимер из синтетических субъединиц, таких как фосфорамидаты и фосфоротиоаты, и, таким образом, может представлять олигодезоксинуклеозидфосфорамидат (P-NH2), смешанный фосфоротиоатный-фосфодиэфирный олигомер или смешанный фосфоридиэфирный олигомер. Кроме того, двухцепочечный полинуклеотид можно получить из одноцепочечного полинуклеотидного продукта химического синтеза посредством синтеза комплементарной цепи и отжига цепей в соответствующих условиях или посредством синтеза комплементарной цепи de novo с использованием ДНК-полимеразы с соответствующим праймером.

[0085] Термины «полипептид» и «белок» используются взаимозаменяемо для обозначения полимера из аминокислотных остатков и не ограничиваются минимальной длиной. Такие полимеры из аминокислотных остатков могут содержать природные или неприродные аминокислотные остатки и включают, не ограничиваясь этим, пептиды, олигопептиды, димеры, тримеры и мультимеры из аминокислотных остатков. Данное определение охватывает как полноразмерные белки, так и их фрагменты. Термины также включают постэкспрессионные модификации полипептида, например гликозилирование, сиалирование, ацетилирование, фосфорилирование и тому подобное. Кроме того, для целей настоящего изобретения «полипептид» относится к белку, который включает модификации, такие как делеции, добавления и замены (обычно консервативные по природе), в нативной последовательности, при условии, что белок сохраняет желаемую активность. Такие модификации могут быть преднамеренными, например, посредством сайт-направленного мутагенеза, или могут быть случайными, например, за счет мутаций хозяев, которые продуцируют белки, или ошибок в результате амплификации ПЦР.

[0086] Как здесь используется, термин «адъювант» относится к веществу, которое модулирует и/или вызывает иммунный ответ. Обычно адъювант вводят вместе с антигеном для усиления иммунного ответа на антиген по сравнению с одним антигеном. Здесь описаны различные адъюванты.

[0087] Термины «CpG-олигодезоксинуклеотид» и «CpG ODN» относятся к молекулам ДНК длиной от 10 до 30 нуклеотидов, содержащим динуклеотид цитозина и гуанина, разделенные фосфатом (также называемый здесь динуклеотидом «CpG», или «CpG»). CpG ODN по настоящему изобретению содержат, по меньшей мере, один неметилированный динуклеотид CpG. То есть, цитозин в динуклеотиде CpG не метилирован (т.е. не является 5-метилцитозином). CpG ODN могут иметь частичный или полный фосфоротиоатный (PS) остов.

[0088] Как здесь используется, термин «фармацевтически приемлемый» или «фармакологически совместимый» означает вещество, которое не является нежелательным с биологической или иной точки зрения, например, это вещество может быть включено в фармацевтическую композицию, которую вводят пациенту, не вызывая каких-либо значительных нежелательных биологических эффектов или негативного взаимодействия с любыми другими компонентами композиции, в которой оно содержится. Фармацевтически приемлемые носители или эксципиенты предпочтительно соответствуют требуемым стандартам токсикологических и производственных испытаний и/или включены в Руководство по неактивным ингредиентам, Управления по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США.

[0089] Для любых описанных здесь структурных и функциональных характеристик методы определения этих характеристик известны в данной области техники.

Модифицированные Т-клетки

[0090] В некоторых аспектах обеспечивается модифицированная Т-клетка, содержащая антиген и адъювант, где антиген является экзогенным по отношению к модифицированной Т-клетке и включает иммуногенный эпитоп, и где адъювант находится внутриклеточно. Экзогенные антигены представляют один или более антигенов из источника вне Т-клетки, введенные в Т-клетку, подлежащую модификации, и включают антигены, которые могут присутствовать в Т-клетке (т. е. являются эндогенными) либо до, либо после введения экзогенного антигена, и таким образом, могут продуцироваться Т-клеткой (например, кодированные геномом Т-клетки). Например, в некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка включает два пула антигенов, где первый пул содержит антиген из эндогенного источника, и второй пул содержит антиген из экзогенного источника, продуцированный вне Т-клетки и введенный в Т-клетку, подлежающую модификации. В некоторых вариантах осуществления антиген эктопически экспрессируется или сверхэкспрессируется в патологической клетке у субъекта, и модифицированная Т-клетка происходит от субъекта и включает антиген из экзогенного источника или содержащийся в нем иммуногенный эпитоп, продуцированный вне Т-клетки и введенный в Т-клетку, подлежащую модификации. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет неоантиген (например, измененный собственный белок или его фрагмент), содержащий неоэпитоп, и модифицированная Т-клетка включает антиген из экзогенного источника или его фрагмент, содержащий неоэпитоп, продуцированный вне Т-клетки и введенный в Т-клетку, подлежащую модификации. В некоторых вариантах осуществления адъювант является экзогенным по отношению к модифицированной Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления антиген и/или адъювант находятся во многих компартментах модифицированной Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления антиген и/или адъювант находятся в цитозоле и/или везикуле модифицированной Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления везикула представляет собой эндосому. В некоторых вариантах осуществления антиген или иммуногенный эпитоп связывается с поверхностью модифицированной Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка включает одно или более из Т-хелперов, цитотоксических Т-клеток, Т-клеток памяти или естественных Т-клеток-киллеров. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка включает одно или более из CD3+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток, CD45RA+ Т-клеток, CD45RO+ Т-клеток или γδ-Т-клеток.

[0091] В некоторых аспектах обеспечивается модифицированная Т-клетка, включающая антиген, содержащий аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 18-25. В некоторых вариантах осуществления антиген находится во многих компартментах модифицированной Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления антиген находится в цитозоле и/или везикуле модифицированной Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления везикула представляет эндосому. В некоторых вариантах осуществления антиген или находящийся в нем иммуногенный эпитоп связывается с поверхностью модифицированной Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка включает одно или более из Т-хелперов, цитотоксических Т-клеток, Т-клеток памяти и естественных Т-клеток-киллеров. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка включает одно или более из CD3+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток, CD45RA+ Т-клеток, CD45RO+ Т-клеток и γδ-Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка дополнительно содержит адъювант.

[0092] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с любой из модифицированных Т-клеток, описанных здесь, модифицированные Т-клетки содержат адъювант. В некоторых вариантах осуществления адъювант представляет олигодезоксинуклеотид CpG (ODN), IFN-α, агонисты STING, агонисты RIG-I или поли I:C. В некоторых вариантах осуществления адъювант представляет CpG ODN. В некоторых вариантах осуществления CpG ODN имеет не более приблизительно 50 (например, не более приблизительно 45, 40, 35, 30, 25, 20 или меньше) нуклеотидов в длину. В некоторых вариантах осуществления CpG ODN представляет CpG ODN класса A, CpG ODN класса B или CpG ODN класса C. В некоторых вариантах осуществления CpG ODN содержит нуклеотидную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 26-37. В некоторых вариантах осуществления CpG ODN содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 30. В некоторых вариантах осуществления CpG ODN содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 31. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка содержит множество различных CpG ODN. Например, в некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка содержит множество различных CpG ODN, выбранных из CpG ODN класса A, класса B и класса C.

[0093] В некоторых вариантах осуществления адъювант представляет CpG ODN, LPS, IFN-α, агонисты STING, агонисты RIG-I, поли I:C, R837, R848, агонист TLR3, агонист TLR4 или агонист TLR9. В конкретных вариантах осуществления адъювант представляет CpG ODN. В некоторых вариантах осуществления адъювант представляет CpG ODN. В некоторых вариантах осуществления CpG ODN представляет CpG ODN класса A, CpG ODN класса B или CpG ODN класса C. В некоторых вариантах осуществления адъювант CpG ODN выбран из группы, состоящей из CpG ODN 1018, CpG ODN 1585, CpG ODN 2216, CpG ODN 2336, CpG ODN 1668, CpG ODN 1826, CPG ODN 2006, CpG ODN 2007, CpG ODN. BW006, CpG ODN D-SL01, CpG ODN 2395, CpG ODN M362, CpG ODN D-SL03. В некоторых вариантах осуществления адъювант CpG ODN представляет олигонуклеотид CpG ODN 1826 (TCCATGACGTTCCTGACGTT; SEQ ID NO: 30) или CpG ODN 2006 (также известный как CpG ODN 7909) (TCGTCGTTTGTCGTTTTGTCGTT; SEQ ID NO: 31). В некоторых вариантах осуществления адъювант представляет CpG ODN 7909. В некоторых вариантах осуществления агонист RIG-I содержит полиинозиновую: полицитидиловую кислоту (поли I:C). Многочисленные адъюванты также можно использовать в сочетании с антигенами для усиления индукции иммунного ответа. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка содержит более одного адъюванта. Многочисленные адъюванты также можно использовать в сочетании с антигенами для усиления индукции иммунного ответа. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка содержит более одного адъюванта. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка содержит любую комбинацию адъювантов CpG ODN, LPS, IFN-α, агонистов STING, агонистов RIG-I, поли I:C, R837, R848, агониста TLR3, агониста TLR4 или агониста TLR9.

[0094] В некоторых вариантах осуществления, в соответствии с любым из антигенов, содержащих иммуногенный эпитоп, описанных здесь, модифицированная Т-клетка включает антиген, содержащий иммуногенный эпитоп. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный эпитоп происходит из антигена, ассоциированного с заболеванием. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный эпитоп происходит из пептидов или мРНК, выделенных из больной клетки. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный эпитоп происходит из белка, эктопически экспрессируемого или сверхэкспрессируемого в патологической клетке. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный эпитоп происходит из неоантигена, например, неоантигена, ассоциированного с раком. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный эпитоп включает неоэпитоп, например, неоэпитоп, ассоциированный с раком. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный эпитоп происходит из чужеродного антигена. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный эпитоп происходит из мутантного или иным образом измененного аутоантигена. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный эпитоп происходит из опухолевого антигена, вирусного антигена, бактериального антигена или грибкового антигена. В некоторых вариантах осуществления антиген включает иммумогенный эпитоп, слитый с гетерологичными пептидными последовательностями. В некоторых вариантах осуществления антиген содержит множество иммуногенных эпитопов. В некоторых вариантах осуществления некоторые из множества иммуногенных эпитопов происходят из одного источника. Например, в некоторых вариантах осуществления некоторые из множества иммуногенных эпитопов происходят из одного и того же вирусного антигена. В некоторых вариантах осуществления все множество иммуногенных эпитопов происходит из одного источника. В некоторых вариантах осуществления ни один из множества иммуногенных эпитопов не происходит из одного источника. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка содержит множество различных антигенов.

[0095] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с любым из антигенов, содержащих иммуногенный эпитоп, описанных здесь, антиген представляет полипептид, и иммуногенный эпитоп представляет иммуногенный пептидный эпитоп. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный пептидный эпитоп слит с N-концевым фланкирующим полипептидом и/или C-концевым фланкирующим полипептидом. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный пептидный эпитоп, слитый с N-концевым фланкирующим полипептидом и/или C-концевым фланкирующим полипептидом, представляет не встречающуюся в природе последовательность. В некоторых вариантах осуществления N-концевые и/или C-концевые фланкирующие полипептиды происходят из иммуногенного синтетического длинного пептида (SLP). В некоторых вариантах осуществления N-концевые и/или C-концевые фланкирующие полипептиды происходят из иммуногенных SLP, ассоциированных с заболеванием. В некоторых вариантах осуществления N-концевой фланкирующий полипептид содержит аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 5-10, и/или C-концевой фланкирующий полипептид содержит аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 11-17.

[0096] В некоторых вариантах осуществления, в соответствии с любым из антигенов, содержащих иммуногенный эпитоп, описанных здесь, антиген или иммуногенный эпитоп, содержащийся в нем, происходит из антигена вируса папилломы человека (ВПЧ). В некоторых вариантах осуществления антиген или иммуногенный эпитоп, содержащийся в нем, происходит из любого из ВПЧ-16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73 и 82. В некоторых вариантах осуществления антиген или иммуногенный эпитоп, содержащийся в нем, происходит из антигена ВПЧ-16 или антигена ВПЧ-18. В дополнительных вариантах осуществления антиген или иммуногенный эпитоп, содержащийся в нем, происходит из антигена ВПЧ Е6 (например, антигена ВПЧ-16 или ВПЧ-18 Е6) или антигена ВПЧ Е7 (например, антигена ВПЧ-16 или ВПЧ-18 Е7). В некоторых вариантах осуществления антиген включает HLA-A2-рестриктированный пептид, полученный из ВПЧ E6 и/или E7. В некоторых вариантах осуществления антиген содержит фрагмент белка ВПЧ-16 E6 между остатками 29 и 38 (т.е. ВПЧ-16 E6_29-38). В некоторых вариантах осуществления антиген содержит фрагмент белка ВПЧ-16 E6 между остатками 48 и 57 (т.е. ВПЧ-16 E6_48-57). В некоторых вариантах осуществления антиген содержит фрагмент белка E7 ВПЧ-16 между остатками 11 и 20 (т.е. ВПЧ-16 E7_11-20). В некоторых вариантах осуществления антиген содержит фрагмент белка ВПЧ-16 E7 между остатками 49 и 57 (т.е. ВПЧ-16 E7_49-57). В некоторых вариантах осуществления антиген содержит аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 1-4. В некоторых вариантах осуществления антиген содержит аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 1-4, фланкированную N-концевым полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 5-10 и C-концевым полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 11-17. В некоторых вариантах осуществления антиген содержит аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 18-25.

[0097] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с любым из антигенов, содержащих иммуногенный эпитоп, описанных здесь, антиген или иммуногенный эпитоп, содержащийся в нем, происходит из антигена цитомегаловируса человека (HCMV). В некоторых вариантах осуществления антиген или иммуногенный эпитоп, содержащийся в нем, происходит из любого из штаммов Merlin, Toledo, Davis, Esp, Kerr, Smith, TB40E, TB40F, AD169 или Towne HCMV. В некоторых вариантах осуществления антиген или иммуногенный эпитоп, содержащийся в нем, происходит из антигена штамма AD169 HCMV или антигена штамма Merlin HCMV. В дополнительных вариантах осуществления антиген или иммуногенный эпитоп, содержащийся в нем, происходит из pUL48, pUL47, pUL32, pUL82, pUL83 и pUL99, pUL69, pUL25, pUL56, pUL94, pUL97, pUL144 или pUL128. В некоторых вариантах осуществления антиген содержит HLA-A2-рестриктированный пептид, полученный из HCMV pUL83.

[0098] В некоторых вариантах осуществления, в соответствии с любым из антигенов, содержащих иммуногенный эпитоп, описанных здесь, антиген способен процессироваться в пептид, рестриктированный классом I MHC, и/или пептид, рестриктированный классом II MHC. В некоторых вариантах осуществления антиген способен процессироваться в пептид, рестриктированный классом I MHC. В некоторых вариантах осуществления антиген способен процессироваться в пептид, рестриктированный классом II MHC. В некоторых вариантах осуществления антиген включает множество иммуногенных эпитопов и способен процессироваться в пептид, рестриктированный классом I MHC, и пептид, рестриктированный классом II MHC. В некоторых вариантах осуществления некоторые из множества иммуногенных эпитопов происходят из одного источника. В некоторых вариантах осуществления все множество иммуногенных эпитопов происходит из одного источника. В некоторых вариантах осуществления ни один из множества иммуногенных эпитопов не происходит из одного источника.

[0099] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с любой из модифицированных Т-клеток, описанных здесь, модифицированные Т-клетки содержат множество антигенов, которые содержат множество иммуногенных эпитопов. В некоторых вариантах осуществления изобретения после введения субъекту модифицированной Т-клетки, содержащей множество антигенов, которые включают множество иммуногенных эпитопов, ни один из множества иммуногенных эпитопов не снижает иммунный ответ субъекта на любой из других иммуногенных эпитопов.

[0100] В некоторых вариантах осуществления, в соответствии с любой из модифицированных Т-клеток, описанных здесь, модифицированная Т-клетка содержит антиген и адъювант. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка содержит адъювант в концентрации от приблизительно 1 пМ до приблизительно 10 мМ. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка содержит адъювант в концентрации от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 10 мМ. Например, в некоторых вариантах осуществления концентрация адъюванта в модифицированной Т-клетке составляет менее приблизительно 1 пМ, приблизительно 10 пМ, приблизительно 100 пМ, приблизительно 1 нМ, приблизительно 10 нМ, приблизительно 100 нМ, приблизительно 1 мкМ, приблизительно 10 мкМ, приблизительно 100 мкМ, приблизительно 1 мМ или приблизительно 10 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация адъюванта в модифицированной Т-клетке составляет выше приблизительно 10 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация антигена в модифицированной Т-клетке составляет от приблизительно 1 пМ до приблизительно 10 пМ, от приблизительно 10 пМ до приблизительно 100 пМ, от приблизительно 100 пМ до приблизительно 1 нМ, от приблизительно 1 нМ до приблизительно 10 нМ, от приблизительно 10 нМ до приблизительно 100 нМ, от приблизительно 100 нМ до приблизительно 1 мкМ, от приблизительно 1 мкМ до приблизительно 10 мкМ, от приблизительно 10 мкМ до приблизительно 100 мкМ, от приблизительно 100 мкМ до приблизительно 1 мМ, или от приблизительно 1 мМ до приблизительно 10 мМ. В некоторых вариантах осуществления молярное соотношение антигена и адъюванта в модифицированной Т-клетке составляет от приблизительно 10000:1 до приблизительно 1: 10000. Например, в некоторых вариантах осуществления молярное соотношение антигена и адъюванта в модифицированной Т-клетке составляет приблизительно 10000:1, приблизительно 1000:1, приблизительно 200:1, приблизительно 100:1, приблизительно 10:1, приблизительно 1:1, приблизительно 1:10, приблизительно 1:100, приблизительно 1:1000 или приблизительно 1:10000. В некоторых вариантах осуществления молярное соотношение антигена и адъюванта в модифицированной Т-клетке составляет от приблизительно 10000:1 до приблизительно 1000:1, от приблизительно 1000:1 до приблизительно 100:1, от приблизительно 100:1 до приблизительно 10:1, от приблизительно 10:1 до приблизительно 1:1, от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:10, от приблизительно 1:10 до приблизительно 1:100, от приблизительно 1:100 до приблизительно 1:1000, от приблизительно 1:1000 до приблизительно 1:10000. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка содержит комплекс, включающий: а) антиген, b) антиген и, по меньшей мере, один другой антиген и/или с) антиген и адъювант.

[0101] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с любой из модифицированных Т-клеток, описанных здесь, модифицированная Т-клетка дополнительно содержит агент, который повышает жизнеспособность и/или функцию модифицированных Т-клеток по сравнению с соответствующей модифицированной Т-клеткой, которая не содержат агента. В некоторых вариантах осуществления агент представляет стабилизирующий агент или кофактор. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой альбумин. В некоторых вариантах осуществления альбумин представляет мышиный, бычий или человеческий альбумин. В некоторых вариантах осуществления агент представляет катион двухвалентного металла, глюкозу, АТФ, калий, глицерин, трегалозу, D-сахарозу, PEG1500, L-аргинин, L-глутамин или ЭДТА.

[0102] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с любым из способов или композиций, описанных здесь, модифицированная Т-клетка дополнительно содержит агент, который повышает жизнеспособность и/или функцию модифицированных Т-клеток по сравнению с соответствующим множеством модифицированных Т-клеток, которые не содержат агента. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка дополнительно содержит агент, который повышает жизнеспособность и/или функцию модифицированной Т-клетки в цикле замораживания-оттаивания по сравнению с соответствующей модифицированной Т-клеткой, которая не включает агента. В некоторых вариантах осуществления агент представляет агент для криоконсервации и/или агент для гипотермической консервации. В некоторых вариантах осуществления ни агент для криоконсервации, ни агент для гипотермической консервации не вызывают более 10% или 20% клеточной гибели в модифицированной Т-клетке, содержащей агент, по сравнению с соответствующей модифицированной Т-клеткой, которая не включает агента, до любого цикла замораживания-оттаивания. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, приблизительно 70%, приблизительно 80% или приблизительно 90% модифицированных Т-клеток являются жизнеспособными после 1, 2, 3, 4, 5 циклов замораживания-оттаивания. В некоторых вариантах осуществления агент представляет соединение, усиливающее эндоцитоз, стабилизирующий агент или кофактор. В некоторых вариантах осуществления агент представляет альбумин. В некоторых вариантах осуществления альбумин представляет собой мышиный, бычий или человеческий альбумин. В некоторых вариантах осуществления агент представляет альбумин человека. В некоторых вариантах осуществления агент представляет одно или более из следующего: катион двухвалентного металла, глюкозу, АТФ, калий, глицерин, трегалозу, D-сахарозу, PEG1500, L-аргинин, L-глутамин или ЭДТА. В некоторых вариантах осуществления катион двухвалентного металла представляет любой из катионов Mg²⁺, Zn²⁺ или Ca²⁺. В некоторых вариантах осуществления агент представляет одно или более из следующего: пирувата натрия, аденина, трегалозы, декстрозы, маннозы, сахарозы, сывороточного альбумина человека (HSA), ДМСО, HEPES, глицерина, глутатиона, инозина, двухосновного фосфата натрия, одноосновного фосфата натрия, ионов металла натрия, ионов металла калия, ионов металла магния, хлорида, ацетата, глюконата, сахарозы, гидроксида калия или гидроксида натрия. В некоторых вариантах осуществления агент представляет одно или более из следующего: пирувата натрия, адениан, Rejuvesol®, трегалозы, декстрозы, маннозы, сахарозы, сывороточного альбумина человека (HSA), PlasmaLyte®, ДМСО, Cryostor® CS2, Cryostor® CS5, Cryostor® CS10, Cryostor® CS15, HEPES, глицерина, глутатиона, HypoTherosol®.

[0103] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с любой из модифицированных Т-клеток, описанных здесь, модифицированная Т-клетка содержит дополнительную модификацию. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка содержит дополнительную модификацию для модуляции экспрессии молекул MHC класса I. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка содержит дополнительную модификацию для снижения экспрессии молекул MHC класса I. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка содержит дополнительную модификацию для увеличения экспрессии молекул MHC класса I. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка содержит дополнительную модификацию для модуляции экспрессии молекул MHC класса II. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка включает дополнительную модификацию для снижения экспрессии молекул MHC класса II. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка включает дополнительную модификацию для увеличения экспрессии молекул MHC класса II. В некоторых вариантах осуществления в аллогенном контексте врожденный иммунный ответ, развившийся у субъекта в ответ на введение модифицированных Т-клеток, снижен, в аллогенном контексте, по сравнению с врожденным иммунным ответом, развившимся у субъекта в ответ на введение соответствующих модифицированных Т-клеток, которые не содержат дополнительную модификацию. В некоторых вариантах осуществления период полужизни в кровотоке модифицированных Т-клеток у субъекта, которому они были введены, увеличивается по сравнению с периодом полужизни в кровотоке соответствующих модифицированных Т-клеток, которые не содержат дополнительных модификаций у субъекта, которому они были введены.

[0104] В некоторых аспектах обеспечивается модифицированная Т-клетка, включающая антиген, содержащий аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 18-25. В некоторых вариантах осуществления антиген находится во многих компартментах модифицированной Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления антиген находится в цитозоле и/или везикуле модифицированной Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления везикула представляет эндосому. В некоторых вариантах осуществления антиген или иммуногенный эпитоп, содержащийся в нем, связывается с поверхностью модифицированной Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка включает одно или более из Т-хелперов, цитотоксических Т-клеток, Т-клеток памяти или естественных Т-клеток-киллеров. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка включает одно или более из CD3+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток, CD45RA+ Т-клеток, CD45RO+ Т-клеток или γδ-Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка дополнительно содержит адъювант. В некоторых вариантах осуществления модифицированную Т-клетку получают способом, включающим следующие стадии: а) пропускание клеточной суспензии, содержащей входную Т-клетку, через деформирующее клетку сужение, где диаметр сужения является функцией диаметра входной Т-клетки в суспензии, что вызывает, тем самым, пертурбации входной Т-клетки, достаточно большие для того, чтобы антиген прошел через них, с образованием пертурбированной входной Т-клетки; и b) инкубирование пертурбированной входной Т-клетки с антигеном и адъювантом в течение достаточного периода времени для обеспечения проникновения антигена в пертурбированную входную Т-клетку; с получением, тем самым, модифицированной T-клетки, содержащей антиген. В некоторых вариантах осуществления концентрация антигена, инкубированного с пертурбированной входной Т-клеткой, составляет от приблизительно 1 пМ до 10 мМ. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка дополнительно содержит адъювант, такой как любой из адъювантов, описанных здесь.

[0105] В некоторых аспектах обеспечивается модифицированная Т-клетка, содержащая антиген и адъювант, где антиген содержит иммуногенный эпитоп, полученная способом, включающим стадии: а) пропускание клеточной суспензии, содержащей входную Т-клетку, через деформирующее клетку сужение, где диаметр сужения является функцией диаметра входной Т-клетки в суспензии, что вызывает, тем самым, пертурбации входной Т-клетки, достаточно большие для того, чтобы антиген и адъювант прошли через них, с образованием пертурбированной входной Т-клетки; и b) инкубирование пертурбированной входной Т-клетки с антигеном и адъювантом в течение достаточного периода времени для обеспечения проникновения антигена и адъюванта в пертурбированную входную Т-клетку; с получением, тем самым, модифицированной T-клетки, содержащей антиген и адъювант. В некоторых вариантах осуществления концентрация антигена, инкубированного с пертурбированной входной Т-клеткой, составляет от приблизительно 1 пМ до 10 мМ и/или концентрация адъюванта, инкубированного с пертурбированной входной Т-клеткой, составляет от приблизительно 1 пМ до 10 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация антигена, инкубированного с пертурбированной входной Т-клеткой, составляет от приблизительно 0,1 мкМ до 10 мМ, и/или концентрация адъюванта, инкубированного с пертурбированной входной Т-клеткой, составляет от приблизительно 0,1 мкМ до 10 мМ. В некоторых вариантах осуществления соотношение антигена и адъюванта, инкубированных с пертурбированной входной Т-клеткой, составляет от приблизительно 10000:1 до приблизительно 1:10000.

[0106] В некоторых аспектах обеспечивается модифицированная Т-клетка, содержащая антиген и адъювант, где антиген содержит иммуногенный эпитоп, полученная способом, включающим стадии: а) пропускание клеточной суспензии, содержащей входную Т-клетку, содержащую адъювант, через деформирующее клетку сужение, где диаметр сужения является функцией диаметра входной Т-клетки в суспензии, что вызывает, тем самым, пертурбации входной Т-клетки, достаточно большие для того, чтобы антиген прошел через них, с образованием пертурбированной входной Т-клетки; и b) инкубирование пертурбированной входной Т-клетки с антигеном в течение достаточного периода времени для обеспечения проникновения антигена в пертурбированную входную Т-клетку; с получением, тем самым, модифицированной T-клетки, содержащей антиген и адъювант. В некоторых вариантах осуществления концентрация антигена, инкубированного с пертурбированной входной Т-клеткой, составляет от приблизительно 1 пМ до 10 мМ.

[0107] В некоторых аспектах обеспечивается модифицированная Т-клетка, содержащая антиген и адъювант, где антиген содержит иммуногенный эпитоп, полученная способом, включающим стадии: а) пропускание клеточной суспензии, содержащей входную Т-клетку, содержащую антиген, через деформирующее клетку сужение, где диаметр сужения является функцией диаметра входной Т-клетки в суспензии, что вызывает, тем самым, пертурбации входной Т-клетки, достаточно большие для того, чтобы адъювант прошел через них, с образованием пертурбированной входной Т-клетки; и b) инкубирование пертурбированной входной Т-клетки с адъювантом в течение достаточного периода времени для обеспечения проникновения адъюванта в пертурбированную входную Т-клетку; с получением, тем самым, модифицированной T-клетки, содержащей антиген и адъювант. В некоторых вариантах осуществления концентрация адъюванта, инкубированного с пертурбированной входной Т-клеткой, составляет от приблизительно 1 пМ до 10 мМ.

[0108] Модифицированные Т-клетки, описанные здесь, в некоторых вариантах осуществления, получают способом, в котором используется деформирующее клетки сужение, через которое проходит входная Т-клетка. В некоторых вариантах осуществления диаметр сужения меньше диаметра входной Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления диаметр сужения составляет от приблизительно 20% до приблизительно 99% от диаметра входной Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления диаметр сужения составляет от приблизительно 20% до приблизительно 60% от диаметра входной Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления сужение, деформирующее клетки, находится в микрофлюидном канале, таком как любой из микрофлюидных каналов, описанных здесь. Микрофлюидный канал может находиться в любом из микрофлюидных устройств, описанных здесь, например, описанных в разделе «Микрофлюдные устройства» ниже. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, в соответствии с любой из модифицированных Т-клеток, описанных здесь, полученных способом, в котором используется микрофлюидный канал, включая деформирующее клетки сужение, через которое проходит входная Т-клетка, способ включает пропускание входной Т-клетки через микрофлюидный канал, включающий деформирующее клетки сужение, содержащееся в любой из микрофлюидных систем, описанных здесь. В некоторых вариантах осуществления к входной Т-клетке, когда она проходит через сужение, прикладывается деформирующая сила, вызывая тем самым пертурбации входной Т-клетки.

[0109] Входные Т-клетки могут происходить из ряда источников, включая мононуклеарные клетки периферической крови, костный мозг, ткань лимфатических узлов, пуповинную кровь, ткань тимуса, ткань из очага инфекции, асцит, плевральный выпот, ткань селезенки и опухоли. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения можно использовать любое число линий Т-клеток, доступных в данной области. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения Т-клетки могут быть происходят из единицы крови, отобранной у субъекта, с использованием любого количества методов, известных специалисту в данной области, таких как систему разделения Ficoll™. В некоторых вариантах осуществления клетки из циркулирующей крови человека получают аферезом. Продукт афереза обычно содержит лимфоциты, включая Т-клетки, моноциты, гранулоциты, В-клетки, другие ядерные лейкоциты, эритроциты и тромбоциты. В некоторых вариантах осуществления клетки, собранные с помощью афереза, можно промыть для удаления фракции плазмы и помещения клеток в соответствующий буфер или среду для последующих стадий обработки. В некоторых вариантах осуществления клетки промывают забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS). В некоторых вариантах осуществления в промывочном растворе могут отсутствовать кальций и магний, или могут отсутствовать многие, если не все двухвалентные катионы. Как могут понять легко специалисты в данной области техники, стадия промывания можно выполнить способами, известными специалистам в данной области, например, с использованием полуавтоматической «проточной» центрифуги (например, процессора клеток Cobe 2991, Baxter CytoMate или Haemonetics Cell Saver 5) в соответствии с инструкциями изготовителя. После промывания клетки можно ресуспендировать в различных биосовместимых буферах, таких как PBS без Ca²⁺, без Mg²⁺, PlasmaLyte A или других физиологических растворах с буфером или без него. Альтернативно, нежелательные компоненты образца афереза могут быть удалены, а клетки непосредственно ресуспендированы в культуральной среде.

[0110] В некоторых вариантах осуществления Т-клетки выделяют из лимфоцитов периферической крови лизисом эритроцитов и истощением моноцитов, например, центрифугированием в градиенте PERCOLL™ или проточным элютриационным центрифугированием. Специфическую субпопуляцию Т-клеток, таких как CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+, CD45RO+ Т-клетки и γδ-Т-клетки, можно зам выделить методами положительной или отрицательной селекции. Например, в некоторых вариантах осуществления Т-клетки выделяют инкубацией с гранулами, конъюгированными с анти-CD3/анти-CD28 (т.е. 3 × 28), такими как DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T, в течение периода времени, достаточного для положительной селекции требуемых Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления период времени составляет приблизительно 30 мин. В некоторых вариантах осуществления период времени составляет от 30 мин до 36 ч или более, и все целые значения находятся между ними. В некоторых вариантах осуществления период времени составляет, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ч. В некоторых вариантах осуществления период времени составляет от 10 ч до 24 ч. В некоторых вариантах осуществления период инкубации составляет 24 ч. Для выделения Т-клеток от пациентов с лейкемией использование более продолжительного времени инкубации, например 24 ч, может увеличить выход клеток. Более длительное время инкубации можно использовать для выделения Т-клеток в любой ситуации, когда Т-клеток мало по сравнению с другими типами клеток, например, при выделении инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (TIL) из опухолевой ткани или от людей с ослабленным иммунитетом. Кроме того, более продолжительное время инкубации может повысить эффективность захвата CD8+ Т-клеток. Таким образом, просто сокращая или увеличивая время, в течение которого Т-клетки получают возможность связываться с гранулами CD3/CD28, и/или увеличивая или сокращая отношение гранул к Т-клеткам, субпопуляции Т-клеток могут быть предпочтительно отобраны за или против при инициировании культивирования или на другие временные точки в процессе. Кроме того, увеличивая или уменьшая соотношение анти-CD3 и/или анти-CD28 антител на гранулах или другой поверхности, субпопуляции Т-клеток можно предпочтительно отобрать за или против инициации культивирования или в другие желаемые временные точки. Квалифицированный специалист в данной области понимает, что также можно использовать несколько раундов отбора в контексте этого изобретения. В некоторых вариантах осуществления может быть желательным выполнить процедуру селекции и использовать «неселектированные» клетки в процессе активации и экспансии (отрицательный отбор). «Неселектированные» клетки также можно подвергнуть дополнительным стадиям отбора.

[0111] Обогащение популяции Т-клеток посредством отрицательной селекции может быть достигнуто с помощью комбинации антител, направленных на поверхностные маркеры, уникальные для отрицательно отобранных клеток. Одним из методов является сортинг и/или селекция клеток с помощью отрицательной магнитной иммуноадгезии или проточной цитометрии, в которой используется смесь моноклональных антител, направленных на маркеры клеточной поверхности, присутствующие на отрицательно отобранных клетках. Например, для обогащения CD4+ клеток посредством отрицательной селекции смесь моноклональных антител обычно включает антитела к CD14, CD20, CD11b, CD 16, HLA-DR и CD8. В некоторых вариантах осуществления может быть желательно обогащение или положительный отбор регуляторных Т-клеток, которые обычно экспрессируют CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+ и FoxP3+. Альтернативно, в некоторых вариантах осуществления Т-регуляторные клетки истощаются с помощью гранул, конъюгированных с анти-CD25, или другими аналогичными методами отбора.

[0112] Для выделения требуемой популяции клеток положительной или отрицательной селекцией можно варьировать концентрацию клеток и поверхности (например, таких частиц, как шарики). В некоторых вариантах осуществления может быть желательным значительно уменьшить объем, в котором гранулы и клетки смешиваются вместе (т.е. увеличить концентрацию клеток), чтобы гарантировать максимальный контакт клеток и гранул. Например, в некоторых вариантах осуществления используется концентрация приблизительно 2 млрд клеток/мл. В некоторых вариантах используется концентрация приблизительно 1 млрд клеток/мл. В некоторых вариантах используется более приблизительно 100 млн. клеток/мл. В некоторых вариантах осуществления используется концентрация клеток приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 млн. клеток/мл. В некоторых вариантах осуществления используется концентрация клеток приблизительно 75, 80, 85, 90, 95 или 100 млн. клеток/мл. В некоторых вариантах осуществления используется концентрация приблизительно 125 или приблизительно 150 млн. клеток/мл. Использование высоких концентраций может привести к увеличению выхода клеток, активации и размножению клеток. Кроме того, применение высоких концентраций клеток позволяет более эффективно захватывать клетки, которые могут слабо экспрессировать представляющие интерес целевые антигены, такие как CD28-отрицательные Т-клетки, или из образцов, где присутствует много опухолевых клеток (например, кровь от пациента с лейкозом, опухолевая ткань и т.д.). Такие популяции клеток могут иметь терапевтическую ценность, и их было бы желательно получить. Например, использование высокой концентрации клеток позволяет более эффективно отбирать CD8+ Т-клетки, которые обычно имеют более слабую экспрессию CD28.

Композиции

[0113] В некоторых аспектах обеспечивается композиция (например, фармацевтическая композиция), содержащая модифицированную Т-клетку, содержащую антиген и адъювант, согласно любому из вариантов осуществления, описанных здесь. В некоторых вариантах осуществления композиция представляет фармацевтическую композицию, содержащую модифицированную Т-клетку и фармацевтически приемлемый носитель.

Способы модуляции иммунного ответа

[0114] В определенных аспектах обеспечивается способ модуляции иммунного ответа у субъекта, включающий введение субъекту модифицированной Т-клетки согласно любому из вариантов осуществления, описанных здесь, композиции согласно любому из вариантов осуществления, описанных здесь, или фармацевтической композиции согласно любому из вариантов осуществления, описанных здесь.

[0115] В некоторых аспектах обеспечивается способ модуляции иммунного ответа у субъекта, включающий: а) пропускание клеточной суспензии, содержащей входную Т-клетку, через деформирующее клетку сужение, где диаметр сужения является функцией диаметра входной Т-клетки в суспензии, что вызывает, тем самым, пертурбации входной Т-клетки, достаточно большие для того, чтобы антиген и адъювант прошли через них, с образованием пертурбированной входной Т-клетки, где антиген содержит иммуногенный эпитоп; b) инкубирование пертурбированной входной Т-клетки с антигеном и адъювантом в течение достаточного периода времени для обеспечения проникновения антигена и адъюванта в пертурбированную входную Т-клетку; с получением, тем самым, модифицированной T-клетки, содержащей антиген и адъювант; и с) введение субъекту модифицированной Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления концентрация антигена, инкубированного с пертурбированной входной Т-клеткой, составляет от приблизительно 1 пМ до 10 мМ и/или концентрация адъюванта, инкубированного с пертурбированной входной Т-клеткой, составляет от приблизительно 1 пМ до 10 мМ. В некоторых вариантах осуществления соотношение антигена и адъюванта, инкубированных с пертурбированной входной Т-клеткой, составляет от приблизительно 10000:1 до приблизительно 1:10000. В некоторых вариантах осуществления концентрация адъюванта, инкубированного с пертурбированной входной Т-клеткой, составляет от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 10 мМ. Например, в некоторых вариантах осуществления концентрация адъюванта, инкубированного с пертурбированной Т-клеткой, составляет ниже приблизительно 1 пМ, приблизительно 10 пМ, приблизительно 100 пМ, приблизительно 1 нМ, приблизительно 10 нМ, приблизительно 100 нМ, приблизительно 1 мкМ, приблизительно 10 мкМ, приблизительно 100 мкМ, приблизительно 1 мМ или приблизительно 10 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация адъюванта, инкубированного с пертурбированной Т-клеткой, составляет выше приблизительно 10 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация антигена, инкубированного с пертурбированной Т-клеткой, составляет от приблизительно 1 пМ до приблизительно 10 пМ, от приблизительно 10 пМ до приблизительно 100 пМ, от приблизительно 100 пМ до приблизительно 1 нМ, от приблизительно 1 нМ до приблизительно 10 нМ, от приблизительно 10 нМ до приблизительно 100 нМ, от приблизительно 100 нМ до приблизительно 1 мкМ, от приблизительно 1 мкМ до приблизительно 10 мкМ, от приблизительно 10 мкМ до приблизительно 100 мкМ, от приблизительно 100 мкМ до приблизительно 1 мМ, или от приблизительно 1 мМ до приблизительно 10 мМ. В некоторых вариантах осуществления молярное соотношение антигена и адъюванта, инкубированных с пертурбированной Т-клеткой, составляет от приблизительно 10000:1 до приблизительно 1:10000. Например, в некоторых вариантах осуществления молярное соотношение антигена и адъюванта, инкубированных с пертурбированной Т-клеткой, составляет приблизительно любое из 10000:1, приблизительно 1000:1, приблизительно 100:1, приблизительно 10: 1, приблизительно 1:1, приблизительно 1:10, приблизительно 1:100, приблизительно 1:1000 или приблизительно 1:10000. В некоторых вариантах осуществления молярное соотношение антигена и адъюванта, инкубированных с пертурбированной Т-клеткой, составляет от приблизительно 10000:1 до приблизительно 1000: 1, от приблизительно 1000:1 до приблизительно 100: 1, от приблизительно 100: 1 до приблизительно 10:1, от приблизительно 10:1 до приблизительно 1:1, от приблизительно 1: 1 до приблизительно 1:10, от приблизительно 1:10 до приблизительно 1:100, от приблизительно 1:100 до приблизительно 1:1000, от приблизительно 1:1000 до приблизительно 1:10000. В некоторых вариантах осуществления антиген и/или адъювант инкапсулирован в наночастице.

[0116] В определенных аспектах обеспечивается способ модуляции иммунного ответа у субъекта, включающий: а) пропускание клеточной суспензии, содержащей входную Т-клетку, содержащую адъювант, через деформирующее клетку сужение, где диаметр сужения является функцией диаметра входной Т-клетки в суспензии, что вызывает, тем самым, пертурбации входной Т-клетки, достаточно большие для того, чтобы антиген прошел через них, с образованием пертурбированной входной Т-клетки; b) инкубирование пертурбированной входной Т-клетки с антигеном в течение достаточного периода времени для обеспечения проникновения антигена в пертурбированную входную Т-клетку; с получением, тем самым, модифицированной T-клетки, содержащей антиген и адъювант; и с) введение субъекту модифицированной Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления концентрация антигена, инкубированного с пертурбированной входной Т-клеткой, составляет от приблизительно 1 пМ до 10 мМ. В некоторых вариантах осуществления антиген инкапсулирован в наночастице.

[0117] В некоторых аспектах обеспечивается способ модуляции иммунного ответа у субъекта, включающий: а) пропускание клеточной суспензии, содержащей входную Т-клетку, содержащую антиген, через деформирующее клетку сужение, где антиген содержит иммуногенный эпитоп, где диаметр сужения является функцией диаметра входной Т-клетки в суспензии, что вызывает, тем самым, пертурбации входной Т-клетки, достаточно большие для того, чтобы адъювант прошел через них, с образованием пертурбированной входной Т-клетки; b) инкубирование пертурбированной входной Т-клетки с адъювантом в течение достаточного периода времени для обеспечения проникновения адъюванта в пертурбированную входную Т-клетку; с получением, тем самым, модифицированной T-клетки, содержащей антиген и адъювант; и с) введение субъекту модифицированной Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления концентрация адъюванта, инкубированного с пертурбированной входной Т-клеткой, составляет от приблизительно 1 пМ до 10 мМ. В некоторых вариантах осуществления адъювант инкапсулирован в наночастицу.

[0118] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с любым из способов модуляции иммунного ответа с использованием модифицированной Т-клетки, модифицированная Т-клетка содержит антиген и адъювант. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка содержит антиген в концентрации от приблизительно 1 пМ до приблизительно 10 мМ. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка содержит адъювант в концентрации от приблизительно 1 пМ до приблизительно 10 мМ. В некоторых вариантах осуществления соотношение антигена и адъюванта в модифицированной Т-клетке составляет от приблизительно 10000:1 до приблизительно 1:10000. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка включает комплекс, содержащий: а) антиген, b) антиген и, по меньшей мере, один другой антиген и/ или с) антиген и адъювант.

[0119] В некоторых аспектах обеспечивается способ модуляции иммунного ответа у субъекта, включающий: a) введение модифицированной Т-клетки, включающей антиген, содержащий аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 18-25, субъекту; и b) введение субъекту адъюванта. В некоторых вариантах осуществления адъювант вводят вместе или одновременно с модифицированной Т-клеткой. В некоторых вариантах осуществления адъювант и модифицированная Т-клетка вводят последовательно. В некоторых вариантах осуществления адъювант вводят до введения модифицированной Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления адъювант вводят после введения модифицированной Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления адъювант вводят системно, например, внутривенно. В некоторых вариантах осуществления адъювант вводят местно, например интратуморально. В некоторых вариантах осуществления адъювант не содержится в клетке, например, адъювант находится в свободном состоянии в растворе. В некоторых вариантах осуществления адъювант содержится в клетке, такой как Т-клетка. В некоторых вариантах осуществления адъювант доставляется в Т-клетку любым из способов внутриклеточной доставки, описанных здесь. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка, содержащая антиген, получена способом, включающим стадии: c) пропускание клеточной суспензии, содержащей входную Т-клетку, через деформирующее клетки сужение, где диаметр сужения является функцией диаметра входной Т-клетки в суспензии, что вызывает, тем самым, пертурбации входной Т-клетки, достаточно большие для того, чтобы антиген прошел через них, с образованием пертурбированной входной Т-клетки; и d) инкубирование пертурбированной входной Т-клетки с антигеном в течение достаточного периода времени для обеспечения проникновения антигена в пертурбированную входную Т-клетку, с получением, тем самым, модифицированной T-клетки, содержащей антиген. В некоторых вариантах осуществления концентрация антигена, инкубированного с пертурбированной входной Т-клеткой, составляет от приблизительно 1 пМ до 10 мМ. В некоторых вариантах осуществления антиген инкапсулирован в наночастице. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка дополнительно содержит адъювант. В некоторых вариантах осуществления адъювант, находящийся в модифицированной Т-клетке, и адъювант на стадии b) представляют собой одно и то же соединение. В некоторых вариантах осуществления адъювант, находящийся в модифицированной Т-клетке, и адъювант на стадии b) представляют собой разные соединения.

[0120] В некоторых аспектах обеспечивается способ модуляции иммунного ответа у субъекта, включающий: а) пропускание клеточной суспензии, содержащей входную Т-клетку, через деформирующее клетку сужение, где диаметр сужения является функцией диаметра входной Т-клетки в суспензии, что вызывает, тем самым, пертурбации входной Т-клетки, достаточно большие для того, чтобы антиген прошел через них, с образованием пертурбированной входной Т-клетки, где антиген содержит иммуногенный эпитоп; b) инкубирование пертурбированной входной Т-клетки с антигеном в течение достаточного периода времени для обеспечения проникновения антигена в пертурбированную входную Т-клетку; с получением, тем самым, модифицированной T-клетки, содержащей антиген; с) введение субъекту модифицированной Т-клетки; и d) введение субъекту адъюванта. В некоторых вариантах осуществления адъювант вводят вместе или одновременно с модифицированной Т-клеткой. В некоторых вариантах осуществления адъювант и модифицированную Т-клетку вводят последовательно. В некоторых вариантах осуществления адъювант вводят до введения модифицированной Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления адъювант вводят после введения модифицированной Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления адъювант вводят системно, например, внутривенно. В некоторых вариантах осуществления адъювант вводят местно, например интратуморально. В некоторых вариантах осуществления адъювант не находится в клетке, например, адъювант находится в свободном состоянии в растворе. В некоторых вариантах осуществления адъювант находится в клетке, такой как Т-клетка. В некоторых вариантах осуществления адъювант доставляется в Т-клетку любым из способов внутриклеточной доставки, описанных здесь. В некоторых вариантах осуществления концентрация антигена, инкубированного с пертурбированной входной Т-клеткой, составляет от приблизительно 1 пМ до 10 мМ. В некоторых вариантах осуществления антиген инкапсулирован в наночастице.

[0121] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с любым из способов модуляции иммунного ответа у субъекта, описанных здесь, иммунный ответ усиливается. В некоторых вариантах осуществления усиленный иммунный ответ направлен на антиген.

[0122] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с любым из способов модуляции иммунного ответа у субъекта, описанных здесь, в способе используется деформирующее клетки сужение, через которое проходит входная Т-клетка. В некоторых вариантах осуществления диаметр сужения меньше диаметра входной Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления диаметр сужения составляет от приблизительно 20% до приблизительно 99% от диаметра входной Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления диаметр сужения составляет от приблизительно 20% до приблизительно 60% от диаметра входной Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления сужение, деформирующее клетки, находится в микрофлюидном канале, таком как любой из микрофлюидных каналов, описанных здесь. Микрофлюидный канал может находиться в любом из микрофлюидных устройств, описанных здесь, например, описанных в разделе «Микрофлюидные устройства» ниже. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления в соответствии с любым из способов модуляции иммунного ответа у субъекта, описанных здесь, с использованием микрофлюидного канала, включающего деформирующее клетки сужение, через которое проходит входная Т-клетка, способ включает пропускание входной Т-клетки через микрофлюидный канал, включающий деформирующее клетки сужение, находящийся в любой из микрофлюидных систем, описанных здесь. В некоторых вариантах осуществления к входной Т-клетке, когда она проходит через сужение, прикладывается деформирующая сила, вызывая тем самым пертурбации входной Т-клетки.

[0123] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с любым из способов модуляции иммунного ответа у субъекта, описанных здесь, в способе используются модифицированные Т-клетки, содержащие антиген и адъювант. В некоторых вариантах осуществления антиген и/или адъювант находятся в цитозоле и/или везикуле модифицированной Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления везикула представляет собой эндосому. В некоторых вариантах осуществления антиген и/или адъювант находятся во многих компартментах модифицированной Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления антиген или иммуногенный эпитоп связывается с поверхностью модифицированной Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка включает одно или более из Т-хелперов, цитотоксических Т-клеток, Т-клеток памяти или естественных Т-клеток-киллеров. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка включает одно или более из CD3+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток, CD45RA+ Т-клеток, CD45RO+ Т-клеток или γδ-Т-клеток.

[0124] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с любым из способов модуляции иммунного ответа у субъекта, описанных здесь, в способе используются модифицированные Т-клетки, содержащие адъювант. В некоторых вариантах осуществления адъювант представляет олигодезоксинуклеотид CpG (ODN), IFN-α, агонисты STING, агонисты RIG-I или поли I:C. В некоторых вариантах осуществления адъювант представляет CpG ODN. В некоторых вариантах осуществления адъювант представляет CpG ODN. В некоторых вариантах осуществления CpG ODN имеет не более чем приблизительно 50 (например, не более чем приблизительно любой из 45, 40, 35, 30, 25, 20 или меньше) нуклеотидов в длину. В некоторых вариантах осуществления CpG ODN представляет CpG ODN класса A, CpG ODN класса B или CpG ODN класса C. В некоторых вариантах осуществления CpG ODN содержит нуклеотидную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 26-37. В некоторых вариантах осуществления CpG ODN содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 30. В некоторых вариантах осуществления CpG ODN содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 31. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка содержит множество различных CpG ODN. Например, в некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка содержит множество различных CpG ODN, выбранных из CpG ODN класса A, класса B и класса C.

[0125] Примеры адъювантов включают, без ограничения, агонисты стимулятора генов интерферона (STING), агонисты гена I индуцируемого ретиноевой кислотой (RIG-I), и агонисты TLR3, TLR4, TLR7, TLR8 и/или TLR9. Примеры адъювантов включают, без ограничения, CpG ODN, интерферон-α (IFN-α), полиинозиновую: полицитидиловую кислоту (поли I:C), имиквимод (R837), резиквимод (R848) или липополисахарид (LPS). В некоторых вариантах осуществления адъювант представляет CpG ODN, LPS, IFN-α, агонисты STING, агонисты RIG-I, поли I:C, R837, R848, агонист TLR3, агонист TLR4 или агонист TLR9. В конкретных вариантах осуществления адъювант представляет CpG ODN. В некоторых вариантах осуществления изобретения адъювант представляет CpG ODN. В некоторых вариантах осуществления CpG ODN представляет CpG ODN класса A, CpG ODN класса B или CpG ODN класса C. В некоторых вариантах осуществления адъювант CpG ODN выбран из группы, состоящей из CpG ODN 1018, CpG ODN 1585, CpG ODN 2216, CpG ODN 2336, CpG ODN 1668, CpG ODN 1826, CPG ODN 2006, CpG ODN 2007, CpG ODN, BW006, CpG ODN D-SL01, CpG ODN 2395, CpG ODN M362, CpG ODN D-SL03. В некоторых вариантах осуществления адъювантом CpG ODN представляет олигонуклеотид CpG ODN 1826 (TCCATGACGTTCCTGACGTT; SEQ ID NO: 30) или CpG ODN 2006 (также известный как CpG ODN 7909) (TCGTCGTTTGTCGTTTTGTCGTT; SEQ ID NO: 30). В некоторых вариантах осуществления адъювант представляет CpG ODN 7909. В некоторых вариантах осуществления агонист RIG-I содержит полиинозиновую:полицитидиловую кислоту (поли I:C). Многочисленные адъюванты также можно использовать в сочетании с антигенами для усиления индукции иммунного ответа. В некоторых вариантах осуществления модифицированные PBMC содержат более одного адъюванта. Многочисленные адъюванты также можно использовать в сочетании с антигенами для усиления индукции иммунного ответа. В некоторых вариантах осуществления модифицированные PBMC содержат более одного адъюванта. В некоторых вариантах осуществления модифицированные PBMC содержат любую комбинацию адъювантов CpG ODN, LPS, IFN-α, агонистов STING, агонистов RIG-I, поли I:C, R837, R848, агониста TLR3, агониста TLR4 или агониста TLR9.

[0126] В любом из вариантов осуществления, описанных здесь, если не указано иное, то адъювант может относиться к (а) адъюванту, который инкубируется с пертурбированными входными Т-клетками и проходит через них, или (b) адъюванту, вводимому совместно с модифицированными Т-клетками субъекту.

[0127] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с любым из способов модуляции иммунного ответа у субъекта, описанных здесь, в способе используется модифицированная Т-клетка, включающая антиген, содержащий иммуногенный эпитоп. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный эпитоп происходит из антигена, ассоциированного с заболеванием. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный эпитоп происходит из пептидов или мРНК, выделенных из патологической клетки. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный эпитоп происходит из белка, эктопически экспрессированного или сверхэкспрессированного в патологической клетке. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный эпитоп происходит из неоантигена, например, неоантигена, ассоциированного с раком. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный эпитоп включает неоэпитоп, например, неоэпитоп, ассоциированный с раком. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный эпитоп происходит из чужеродного антигена. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный эпитоп происходит из мутантного или иным образом измененного аутоантигена. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный эпитоп происходит из опухолевого антигена, вирусного антигена, бактериального антигена или грибкового антигена. В некоторых вариантах осуществления антиген содержит множество иммуногенных эпитопов. В некоторых вариантах осуществления некоторые из множества иммуногенных эпитопов происходят из одного источника. Например, в некоторых вариантах осуществления некоторые из множества иммуногенных эпитопов происходят из одного и того же вирусного антигена. В некоторых вариантах осуществления все множество иммуногенных эпитопов происходит из одного источника. В некоторых вариантах осуществления ни один из множества иммуногенных эпитопов не происходит из одного источника. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка содержит множество различных антигенов.

[0128] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с любым из способов модуляции иммунного ответа у субъекта, описанных здесь, с использованием модифицированной Т-клетки, включающей антиген, содержащий иммуногенный эпитоп, антиген представляет полипептид, и иммуногенный эпитоп представляет иммуногенный пептидный эпитоп. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный пептидный эпитоп слит с N-концевым фланкирующим полипептидом и/или C-концевым фланкирующим полипептидом. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный пептидный эпитоп, слитый с N-концевым фланкирующим полипептидом и/или C-концевым фланкирующим полипептидом, представляет не встречающуюся в природе последовательность. В некоторых вариантах осуществления N-концевые и/или C-концевые фланкирующие полипептиды происходят из иммуногенного синтетического длинного пептида (SLP). В некоторых вариантах осуществления N-концевые и/или C-концевые фланкирующие полипептиды происходят из иммуногенных SLP, ассоциированных с заболеванием. В некоторых вариантах осуществления N-концевой фланкирующий полипептид содержит аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 5-10, и/или C-концевой фланкирующий полипептид содержит аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 11-17.

[0129] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с любым из способов модуляции иммунного ответа, описанных здесь, с использованием модифицированной Т-клетки, включающей антиген, содержащий иммуногенный эпитоп, находящийся в ней антиген или иммуногенный эпитоп происходят из антигена вируса папилломы человека (ВПЧ). В некоторых вариантах осуществления антиген или иммуногенный эпитоп, содержащийся в нем, происходят из любого из ВПЧ-16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73 и 82. В некоторых вариантах осуществления антиген или иммуногенный эпитоп, содержащийся в нем, происходят из антигена ВПЧ-16 или антигена ВПЧ-18. В дополнительных вариантах осуществления антиген или иммуногенный эпитоп, содержащийся в нем, происходят из антигена ВПЧ Е6 (например, антигена ВПЧ-16 или ВПЧ-18 Е6) или антигена ВПЧ Е7 (например, антигена ВПЧ-16 или ВПЧ-18Е7). В некоторых вариантах осуществления антиген включает HLA-A2-рестриктированный пептид, полученный из ВПЧ E6 и/или E7. В некоторых вариантах осуществления антиген содержит фрагмент белка ВПЧ-16 E6 между остатками 29 и 38 (т.е. ВПЧ-16 E6_29-38). В некоторых вариантах осуществления антиген содержит фрагмент белка ВПЧ-16 E6 между остатками 48 и 57 (т.е. ВПЧ-16E6_48-57). В некоторых вариантах осуществления антиген содержит фрагмент белка ВПЧ-16 E7 между остатками 11 и 20 (т.е. ВПЧ-16 E7_11-20). В некоторых вариантах осуществления антиген содержит фрагмент белка ВПЧ-16 E7 между остатками 49 и 57 (т.е. ВПЧ-16 E7_49-57). В некоторых вариантах осуществления антиген содержит аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 1-4. В некоторых вариантах осуществления антиген содержит аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 1-4, фланкированную N-концевым полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 5-10 и C-концевой полипептид, содержащий аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 11-17. В некоторых вариантах осуществления антиген содержит аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 18-25.

[0130] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с любым из способов модуляции иммунного ответа у субъекта, описанных здесь, с использованием модифицированной Т-клетки, включающей антиген, содержащий иммуногенный эпитоп, антиген или иммуногенный эпитоп, содержащийся в нем, происходят из антигена цитомегаловируса человека (HCMV). В некоторых вариантах осуществления HCMV представляет штамм AD169 или штамм Merlin HCMV. В некоторых вариантах осуществления антиген содержит HLA-A2-рестриктированный пептид, полученный из HCMV pUL83. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка содержит множество антигенов, которые содержат множество иммуногенных эпитопов. В некоторых вариантах осуществления после введения субъекту модифицированной Т-клетки, содержащей множество антигенов, которые включают множество иммуногенных эпитопов, ни один из множества иммуногенных эпитопов не снижает иммунный ответ субъекта на любой из других иммуногенных эпитопов. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет полипептид, и иммуногенный эпитоп представляет собой иммуногенный пептидный эпитоп. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный пептидный эпитоп слит с N-концевым фланкирующим полипептидом и/или C-концевым фланкирующим полипептидом. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет полипептид, содержащий иммуногенный пептидный эпитоп и одну или более гетерологичных пептидных последовательностей. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой полипептид, содержащий иммуногенный пептидный эпитоп, который фланкирован на N-конце и/или C-конце гетерологичными пептидными последовательностями. В некоторых вариантах осуществления фланкирующие гетерологичные пептидные последовательности происходят из иммуногенных пептидов, ассоциированных с заболеванием.

[0131] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с любым из способов модуляции иммунного ответа у субъекта, описанных здесь, с использованием модифицированной Т-клетки, включающей антиген, содержащий иммуногенный эпитоп, антиген способен процессироваться в пептид, рестриктированный классом I по МНС и/или пептид, рестриктированный классом II MHC. В некоторых вариантах осуществления антиген способен процессироваться в пептид, рестриктированный классом I MHC. В некоторых вариантах осуществления антиген способен процессироваться в пептид, рестриктированный классом II MHC. В некоторых вариантах осуществления антиген включает множество иммуногенных эпитопов и способен процессироваться в пептид, рестриктированный классом I MHC, и пептид, рестриктированный классом II MHC. В некоторых вариантах осуществления некоторые из множества иммуногенных эпитопов происходят из одного источника. В некоторых вариантах осуществления все множество иммуногенных эпитопов получено из одного источника. В некоторых вариантах осуществления ни один из множества иммуногенных эпитопов не происходит из одного источника.

[0132] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с любым из способов модуляции иммунного ответа у субъекта, описанных здесь, с использованием модифицированной Т-клетки, модифицированная Т-клетка содержит множество антигенов, которые содержат множество иммуногенных эпитопов. В некоторых вариантах осуществления ни один из множества иммуногенных эпитопов не снижает иммунный ответ субъекта на любой из других иммуногенных эпитопов.

[0133] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с любым из способов или композиций, описанных здесь, с использованием модифицированной Т-клетки, модифицированная Т-клетка содержит антиген и адъювант. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка содержит адъювант в концентрации от приблизительно 1 пМ до приблизительно 10 мМ. Например, в некоторых вариантах осуществления концентрация адъюванта в модифицированной Т-клетке составляет ниже приблизительно 1 пМ, приблизительно 10 пМ, приблизительно 100 пМ, приблизительно 1 нМ, приблизительно 10 нМ, приблизительно 100 нМ, приблизительно 1 мкМ, приблизительно 10 мкМ, приблизительно 100 мкМ, приблизительно 1 мМ или приблизительно 10 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация адъюванта в модифицированной Т-клетке составляет выше приблизительно 10 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация антигена в модифицированной Т-клетке составляет от приблизительно 1 пМ до приблизительно 10 пМ, от приблизительно 10 пМ до приблизительно 100 пМ, от приблизительно 100 пМ до приблизительно 1 нМ, от приблизительно 1 нМ до приблизительно 10 нМ, от приблизительно 10 нМ до приблизительно 100 нМ, от приблизительно 100 нМ до приблизительно 1 мкМ, от приблизительно 1 мкМ до приблизительно 10 мкМ, от приблизительно 10 мкМ до приблизительно 100 мкМ, от приблизительно 100 мкМ до приблизительно 1 мМ, или от приблизительно 1 мМ до приблизительно 10 мМ. В некоторых вариантах осуществления молярное соотношение антигена и адъюванта в модифицированной Т-клетке составляет от приблизительно 10000:1 до приблизительно 1: 10000. Например, в некоторых вариантах осуществления молярное соотношение антигена и адъюванта в модифицированной Т-клетке составляет приблизительно 10000:1, приблизительно 1000:1, приблизительно 100:1, приблизительно 10:1, приблизительно 1:1, приблизительно 1:10, приблизительно 1:100, приблизительно 1:1000 или приблизительно 1:10000. В некоторых вариантах осуществления молярное соотношение антигена и адъюванта в модифицированной Т-клетке составляет от приблизительно 10000:1 до приблизительно 1000:1, от приблизительно 1000:1 до приблизительно 100:1, от приблизительно 100:1 до приблизительно 10:1, от приблизительно 10:1 до приблизительно 1:1, от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:10, от приблизительно 1:10 до приблизительно 1:100, от приблизительно 1:100 до приблизительно 1:1000, от приблизительно 1:1000 до приблизительно 1:10000. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка включает комплекс, содержащий: а) антиген, b) антиген и, по меньшей мере, один другой антиген и/или с) антиген и адъювант.

[0134] В некоторых вариантах осуществления, в соответствии с любым из способов или композиций, описанных здесь, с использованием модифицированной Т-клетки, модифицированная Т-клетка дополнительно содержит агент, который повышает жизнеспособность и/или функцию модифицированных Т-клеток по сравнению с соответствующей модифицированной Т-клеткой, которая не содержит агента. В некоторых вариантах осуществления агент представляет стабилизирующий агент или кофактор. В некоторых вариантах осуществления агент представляет альбумин. В некоторых вариантах осуществления альбумин представляет мышиный, бычий или человеческий альбумин. В некоторых вариантах осуществления агент представляет катион двухвалентного металла, глюкозу, АТФ, калий, глицерин, трегалозу, D-сахарозу, PEG1500, L-аргинин, L-глутамин или ЭДТА.

[0135] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с любым из способов или композиций, описанных здесь, с использованием модифицированной Т-клетки, модифицированная Т-клетка включает дополнительную модификацию. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка содержит дополнительную модификацию для модуляции экспрессии молекул MHC класса I. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка содержит дополнительную модификацию для снижения экспрессии молекул MHC класса I. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка содержит дополнительную модификацию для увеличения экспрессии молекул MHC класса I. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка содержит дополнительную модификацию для модуляции экспрессии молекул MHC класса II. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка включает дополнительную модификацию для снижения экспрессии молекул MHC класса II. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка включает дополнительную модификацию для увеличения экспрессии молекул MHC класса II. В некоторых вариантах осуществления в аллогенном контексте врожденный иммунный ответ, развившийся у субъекта в ответ на введение модифицированных Т-клеток, снижен, в аллогенном контексте, по сравнению с врожденным иммунным ответом, развившимся у субъекта в ответ на введение соответствующих модифицированных Т-клеток, которые не содержат дополнительную модификацию. В некоторых вариантах осуществления период полужизни в кровотоке модифицированных Т-клеток у субъекта, которому они были введены, увеличивается по сравнению с периодом полужизни в кровотоке соответствующих модифицированных Т-клеток, которые не содержат дополнительной модификации у субъекта, которому они были введены.

[0136] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с любым из способов модуляции иммунного ответа у субъекта, с использованием модифицированной Т-клетки, описанных здесь, способ включает введение субъекту модифицированной Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка является аллогенной для субъекта. В некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка является аутологичной для субъекта. В некоторых вариантах осуществления субъект предварительно кондиционирован к модуляции воспаления и/или иммунного ответа. В некоторых вариантах осуществления субъект предварительно кондиционирован к снижению воспаления и/или иммунного ответа. В некоторых вариантах осуществления субъект предварительно кондиционирован к усилению воспаления и/или иммунного ответа. В некоторых вариантах осуществления введение модифицированной Т-клетки субъекту приводит к активации и/или экспансии цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL), специфических для антигена. В некоторых вариантах осуществления введение модифицированной Т-клетки субъекту приводит к активации и/или экспансии Т(Th)-хелперов, специфических для антигена. В некоторых вариантах осуществления количество модифицированных Т-клеток, введенных субъекту, составляет от приблизительно 1×10⁶ до приблизительно 1×10¹² клеток. В некоторых вариантах осуществления количество модифицированных Т-клеток, введенных субъекту, меньше, чем приблизительно 1×10⁶, 1×10⁷, 1×10⁸, 1×10⁹, 1×10¹⁰, 1×10¹¹ и приблизительно 1×10¹² клеток. В некоторых вариантах осуществления количество модифицированных Т-клеток, введенных субъекту, составляет от приблизительно 1×10⁶ до приблизительно 1×10⁷, от 1×10⁷ до 1×10⁸, от 1×10⁸ до 1×10⁹, от 1×10⁹ до 1×10¹⁰, от 1×10¹⁰ до 1×10¹¹ и от 1×10¹¹ до 1×10¹² клеток. В некоторых вариантах осуществления способ включает многочисленные введения модифицированных Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления способ включает любое из приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более приблизительно 10 введений. В некоторых вариантах осуществления временной интервал между двумя последовательными введениями модифицированной Т-клетки составляет от приблизительно 1 суток до приблизительно 1 месяца. В некоторых вариантах осуществления введение осуществляется ежедневно, раз в 2 суток, раз в 3 суток, раз в 4 суток, раз в 5 суток, раз в 6 суток, раз в неделю, раз в две недели или раз в месяц. В некоторых вариантах последовательное введение продолжается до одного года или более.

[0137] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с любым из способов модуляции иммунного ответа у субъекта, с использованием модифицированной Т-клетки, описанных здесь, способ дополнительно включает введение субъекту второго адъюванта. В некоторых вариантах осуществления второй адъювант вводят системно, например, внутривенно. В некоторых вариантах осуществления второй адъювант вводят местно, например интратуморально. В некоторых вариантах осуществления второй адъювант не содержится в клетке, например, второй адъювант находится в свободном состоянии в растворе. В некоторых вариантах осуществления второй адъювант представляет IFN-α или CpG ODN. В некоторых вариантах осуществления адъювант, находящийся в модифицированной Т-клетке, и второй адъювант представляют одно и то же соединение. Например, в некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка содержит CpG ODN, и второй адъювант также является CpG ODN. В некоторых вариантах осуществления адъювант, находящийся в модифицированной Т-клетке, и второй адъювант представляют разные соединения. Например, в некоторых вариантах осуществления модифицированная Т-клетка содержит CpG ODN, и второй адъювант представляет IFN-α. В некоторых вариантах осуществления модифицированную Т-клетку и второй адъювант вводят вместе или одновременно. В некоторых вариантах осуществления модифицированную Т-клетку и второй адъювант вводят последовательно. В некоторых вариантах осуществления модифицированную Т-клетку вводят до введения второго адъюванта. В некоторых вариантах осуществления модифицированную Т-клетку вводят после введения второго адъюванта.

[0138] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с любым из способов модуляции иммунного ответа у субъекта, с использованием модифицированной Т-клетки, описанных здесь, способ дополнительно включает введение субъекту ингибитора иммунных контрольных точек. В некоторых вариантах осуществления модифицированную Т-клетку и ингибитор иммунных контрольных точек вводят субъекту вместе. В некоторых вариантах осуществления модифицированную Т-клетку и ингибитор иммунных контрольных точек вводят субъекту одновременно. В некоторых вариантах осуществления модифицированную Т-клетку и ингибитор иммунных контрольных точек вводят субъекту последовательно. В некоторых вариантах осуществления модифицированную Т-клетку вводят субъекту после введения субъекту ингибитора иммунных контрольных точек. В некоторых вариантах осуществления модифицированную Т-клетку вводят субъекту до введения субъекту ингибитора иммунных контрольных точек. В некоторых вариантах осуществления ингибитор иммунных контрольных точек нацелен на любое из PD-1, PD-L1, CTLA-4 и TIM-3. Типичный ингибитор иммунных контрольных точек нацелен, без ограничения, на PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG3 или TIM-3. В некоторых вариантах осуществления ингибитор иммунных контрольных точек нацелен на одно или более из PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG3 или TIM-3. В некоторых вариантах осуществления ингибитор иммунных контрольных точек представляет одно или более из: антитела, которое связывается с PD-1, антитела, которое связывается с PD-L1, антитела, которое связывается с CTLA-4, антитела, которое связывается с LAG3, или антитела, которое связывается с TIM-3. В дополнительных вариантах осуществления антитело может представлять полноразмерное антитело или любой вариант, например, не ограничиваясь этим, фрагмент антитела, одноцепочечный вариабельный фрагмент (ScFv) или антигенсвязывающий фрагмент (Fab). В дополнительных вариантах осуществления антитело может быть биспецифическим, триспецифическим или мультиспецифическим. В некоторых вариантах осуществления ингибитор иммунных контрольных точек представляет одно или более химических соединений, которые связываются с одним или более из PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG3 или TIM-3 и/или ингибируют их. В некоторых вариантах осуществления ингибитор иммунных контрольных точек представляет один или более пептидов, которые связываются и/или ингибируют одно или более из PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG3 или TIM-3.

[0139] Другой примерный ингибитор иммунных контрольных точек нацелен, без ограничения, на TIGIT, VISTA, TIM1, B7-H4 (VTCN1) или BTLA. В некоторых вариантах осуществления ингибитор иммунных контрольных точек нацелен на одно или более из TIGIT, VISTA, TIM1, B7-H4(VTCN1) или BTLA. В некоторых вариантах осуществления ингибитор иммунных контрольных точек представляет одно или более из: антитела, которое связывается с TIGIT, антитела, которое связывается с VISTA, антитела, которое связывается с TIM1, антитела, которое связывается с B7-H4 (VTCN1), или антитела, которое связывается с BTLA. В дополнительных вариантах осуществления антитело может представлять полноразмерное антитело или любой вариант, например, не ограничиваясь этим, фрагмент антитела, одноцепочечный вариабельный фрагмент (ScFv) или антигенсвязывающий фрагмент (Fab). В дополнительных вариантах осуществления антитело может быть биспецифическим, триспецифическим или мультиспецифическим. В некоторых вариантах осуществления ингибитор иммунных контрольных точек представляет одно или более химических соединений, которые связываются и/или ингибируют одно или более из PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG3, TIM-3, TIGIT, VISTA, TIM1, B7-H4 (VTCN1) или BTLA. В некоторых вариантах осуществления ингибитор иммунных контрольных точек представляет один или несколько пептидов, которые связываются и/ или ингибируют одно или более из PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG3, TIM-3, TIGIT, VISTA, TIM1, B7-H4(VTCN1) или BTLA.

[0140] Химиотерапию можно использовать в комбинации с любой из модифицированных Т-клеток, описанных здесь, для достижения аддитивных или синергических эффектов против рака, например, рака, ассоциированного с ВПЧ. В некоторых вариантах осуществления композицию, содержащую модифицированные Т-клетки, вводят в комбинации с введением химиотерапевтического препарата. В некоторых вариантах осуществления композицию, содержащую модифицированные Т-клетки, и химиотерапевтический препарат вводят одновременно. В некоторых вариантах осуществления композицию, содержащую модифицированные Т-клетки, и химиотерапевтический препарат вводят последовательно. В некоторых вариантах осуществления композицию, содержащую модифицированные Т-клетки, вводят в комбинации с введением химиотерапевтического препарата и в комбинации с ингибитором иммунных контрольных точек.

[0141] В некоторых вариантах осуществления композицию, содержащую модифицированные Т-клетки, вводят до введения химиотерапевтического препарата. В некоторых вариантах осуществления композицию, содержащую модифицированные Т-клетки, вводят после введения химиотерапевтического препарата. Например, композицию, содержащую модифицированные Т-клетки, вводят за от приблизительно 1 ч до приблизительно 1 недели до введения химиотерапевтического препарата. Например, в некоторых вариантах осуществления композицию, содержащую модифицированные Т-клетки, вводят приблизительно за 1 ч, приблизительно 2 ч, приблизительно 3 ч, приблизительно 4 ч, приблизительно 6 ч, приблизительно 8 ч, приблизительно 10 ч, приблизительно 12 ч, приблизительно 14 ч, приблизительно 16 ч, приблизительно 18 ч, приблизительно 20 ч, приблизительно 24 ч, приблизительно 30 ч, приблизительно 36 ч, приблизительно 42 ч, приблизительно 48 ч, приблизительно 60 ч, приблизительно 3 суток, приблизительно 4 суток, приблизительно 5 суток, приблизительно за 6 суток или приблизительно за 7 суток до введения химиотерапевтического препарата. В некоторых вариантах осуществления композицию, содержащую модифицированные иммунные клетки, вводят приблизительно за от 1 ч до приблизительно 2 ч, от приблизительно 2 ч до приблизительно 3 ч, от приблизительно 3 ч до приблизительно 4 ч, от приблизительно 4 ч до приблизительно 6 ч, от приблизительно 6 ч до приблизительно 8 ч, от приблизительно 8 ч до приблизительно 10 ч, от приблизительно 10 ч до приблизительно 12 ч, от приблизительно 12 ч до приблизительно 14 ч, от приблизительно 14 ч до приблизительно 16 ч, от приблизительно 16 ч до приблизительно 18 ч, от приблизительно 18 ч до приблизительно 20 ч, от приблизительно 20 ч до приблизительно 24 ч, от приблизительно 24 ч до приблизительно 30 ч, от приблизительно 30 ч до приблизительно 36 ч, от приблизительно 36 ч до приблизительно 42 ч, от приблизительно 42 ч до приблизительно 48 ч, от приблизительно 48 ч до приблизительно 60 ч, от приблизительно 60 ч до приблизительно 3 суток, от приблизительно 3 суток до приблизительно 4 суток, или от приблизительно 4 суток до приблизительно 5 суток, от приблизительно 5 суток до приблизительно 6 суток, от приблизительно 6 суток до приблизительно 7 суток до введения химиотерапевтического препарата.

[0142] В некоторых вариантах осуществления композицию, содержащую модифицированные Т-клетки, вводят после введения химиотерапевтического препарата. Например, композицию, содержащую модифицированные Т-клетки, вводят через от приблизительно 1 ч до приблизительно 1 недели после введения химиотерапевтического препарата. Например, в некоторых вариантах осуществления композицию, содержащую модифицированные Т-клетки, вводят через приблизительно 1 ч, приблизительно 2 ч, приблизительно 3 ч, приблизительно 4 ч, приблизительно 6 ч, приблизительно 8 ч, приблизительно 10 ч, приблизительно 12 ч, приблизительно 14 ч. ч, приблизительно 16 ч, приблизительно 18 ч, приблизительно 20 ч, приблизительно 24 ч, приблизительно 30 ч, приблизительно 36 ч, приблизительно 42 ч, приблизительно 48 ч, приблизительно 60 ч, приблизительно 3 суток, приблизительно 4 суток, приблизительно 5 суток, приблизительно через 6 суток или приблизительно через 7 суток после введения химиотерапевтического препарата. В некоторых вариантах осуществления композицию, содержащую модифицированные иммунные клетки, вводят через от приблизительно 1 ч до приблизительно 2 ч, от приблизительно 2 ч до приблизительно 3 ч, от приблизительно 3 ч до приблизительно 4 ч, от приблизительно 4 ч до приблизительно 6 ч, от приблизительно 6 ч до приблизительно 8 ч, от приблизительно 8 ч до приблизительно 10 ч, от приблизительно 10 ч до приблизительно 12 ч, от приблизительно 12 ч до приблизительно 14 ч, от приблизительно 14 ч до приблизительно 16 ч, от приблизительно 16 ч до приблизительно 18 ч, от приблизительно 18 ч до приблизительно 20 ч, от приблизительно 20 ч до приблизительно 24 ч, от приблизительно 24 ч до приблизительно 30 ч, от приблизительно 30 ч до приблизительно 36 ч, от приблизительно 36 ч до приблизительно 42 ч, от приблизительно 42 ч до приблизительно 48 ч, от приблизительно 48 ч до приблизительно 60 ч, от приблизительно 60 ч до приблизительно 3 суток, от приблизительно 3 суток до приблизительно 4 суток, или от приблизительно 4 суток до приблизительно 5 суток, от приблизительно 5 суток до приблизительно 6 суток, от приблизительно 6 суток до приблизительно 7 суток после введения химиотерапевтического препарата.

[0143] В некоторых вариантах осуществления способ включает многократное введение композиции, содержащей модифицированные Т-клетки, и/или многократное введение химиотерапевтического препарата. Например, в некоторых вариантах осуществления способ включает два введения, три введения, четыре введения, пять введений, шесть введений, семь введений, восемь введений, девять введений, десять введений, одиннадцать введений, двенадцать введений, тринадцать введений, четырнадцать введений или пятнадцать введений композиции, содержащей модифицированные Т-клетки, и/или введений химиотерапевтического препарата. Например, в некоторых вариантах осуществления способ включает менее пяти введений, менее десяти введений, менее пятнадцати введений, менее двадцати введений, менее двадцати пяти введений, менее тридцати введений, менее пятидесяти введений, менее чем семидесяти пять введений, менее ста или менее двухсот введений композиции, содержащей модифицированные Т-клетки, и/или введений химиотерапевтического препарата.

[0144] Типичная химиотерапия может быть зависимой от клеточного цикла или независимой от клеточного цикла. В некоторых вариантах осуществления химиотерапия включает один или более химиотерапевтических препаратов. В некоторых вариантах осуществления химиотерапевтический препарат может быть нацелен на одно или более из клеточного деления, ДНК или метаболизма в опухоли. В некоторых вариантах осуществления химиотерапевтический препарат представляет препарат на основе платины, такой как, не ограничиваясь этим, цисплатин, оксалиплатин или карбоплатин. В некоторых вариантах осуществления химиотерапевтический препарат представляет таксан (такой как доцетаксел или паклитаксел). В некоторых вариантах осуществления химиотерапевтический препарат представляет 5-фторурацил, доксорубицин или иринотекан. В некоторых вариантах осуществления химиотерапевтический препарат представляет одно или более из следующего: алкилирующий агент, антиметаболит, противоопухолевый антибиотик, ингибитор топоизомеразы или ингибитор митоза. В некоторых вариантах осуществления химиотерапия включает цисплатин.

[0145] Лучевую терапию можно использовать в комбинации с любой из модифицированных Т-клеток, описанных здесь, для достижения аддитивных или синергических эффектов против рака, например, рака, ассоциированного с ВПЧ. В некоторых вариантах осуществления композицию, содержащую модифицированные Т-клетки, вводят в комбинации с лучевой терапией. В некоторых вариантах осуществления композицию, содержащую модифицированные Т-клетки, вводят и лучевую терапию проводят одновременно. В некоторых вариантах осуществления композицию, содержащую модифицированные Т-клетки, вводят и лучевую терапию проводят последовательно. В некоторых вариантах осуществления композицию, содержащую модифицированные Т-клетки, вводят в комбинации с лучевой терапией, в комбинации с химиотерапией и/или в комбинации с ингибитором иммунных контрольных точек.

[0146] В некоторых вариантах осуществления композицию, содержащую модифицированные Т-клетки, вводят до проведения лучевой терапии. В некоторых вариантах осуществления композицию, содержащую модифицированные Т-клетки, вводят после лучевой терапии. Например, композицию, содержащую модифицированные Т-клетки, вводят за от приблизительно 1 ч до приблизительно 1 недели до проведения лучевой терапии. Например, в некоторых вариантах осуществления композицию, содержащую модифицированные Т-клетки, вводят за приблизительно 1 ч, приблизительно 2 ч, приблизительно 3 ч, приблизительно 4 ч, приблизительно 6 ч, приблизительно 8 ч, приблизительно 10 ч, приблизительно 12 ч, приблизительно 14 ч, приблизительно 16 ч, приблизительно 18 ч, приблизительно 20 ч, приблизительно 24 ч, приблизительно 30 ч, приблизительно 36 ч, приблизительно 42 ч, приблизительно 48 ч, приблизительно 60 ч, приблизительно 3 суток, приблизительно 4 суток, приблизительно 5 суток, приблизительно за 6 суток или приблизительно за 7 суток до проведения лучевой терапии. В некоторых вариантах осуществления композицию, содержащую модифицированные Т-клетки, вводят за от приблизительно 1 ч до приблизительно 2 ч, от приблизительно 2 ч до приблизительно 3 ч, от приблизительно 3 ч до приблизительно 4 ч, от приблизительно 4 ч до приблизительно 6 ч, от приблизительно 6 ч до приблизительно 8 ч, от приблизительно 8 ч до приблизительно 10 ч, от приблизительно 10 ч до приблизительно 12 ч, от приблизительно 12 ч до приблизительно 14 ч, от приблизительно 14 ч до приблизительно 16 ч, от приблизительно 16 ч до приблизительно 18 ч, от приблизительно 18 ч до приблизительно 20 ч, от приблизительно 20 ч до приблизительно 24 ч, от приблизительно 24 ч до приблизительно 30 ч, от приблизительно 30 ч до приблизительно 36 ч, от приблизительно 36 ч до приблизительно 42 ч, от приблизительно 42 ч до приблизительно 48 ч, от приблизительно 48 ч до приблизительно 60 ч, от приблизительно 60 ч до приблизительно 3 суток, от приблизительно 3 суток до приблизительно 4 дня, от приблизительно 4 суток до приблизительно 5 суток, от приблизительно 5 суток до приблизительно 6 суток, от приблизительно 6 суток до приблизительно 7 суток до проведения лучевой терапии.

[0147] В некоторых вариантах осуществления композицию, содержащую модифицированные Т-клетки, вводят после проведения лучевой терапии. Например, композицию, содержащую модифицированные Т-клетки, вводят через от приблизительно 1 ч до приблизительно 1 недели после проведения лучевой терапии. Например, в некоторых вариантах осуществления композицию, содержащую модифицированные Т-клетки, вводят через приблизительно 1 ч, приблизительно 2 ч, приблизительно 3 ч, приблизительно 4 ч, приблизительно 6 ч, приблизительно 8 ч, приблизительно 10 ч, приблизительно 12 ч, приблизительно 14 ч, приблизительно 16 ч, приблизительно 18 ч, приблизительно 20 ч, приблизительно 24 ч, приблизительно 30 ч, приблизительно 36 ч, приблизительно 42 ч, приблизительно 48 ч, приблизительно 60 ч, приблизительно 3 суток, приблизительно 4 суток, приблизительно 5 суток, приблизительно 6 суток или приблизительно 7 суток после проведения лучевой терапии. В некоторых вариантах осуществления композицию, содержащую модифицированные Т-клетки, вводят через от приблизительно 1 ч до приблизительно 2 ч, от приблизительно 2 ч до приблизительно 3 ч, от приблизительно 3 ч до приблизительно 4 ч, от приблизительно 4 ч до приблизительно 6 ч, от приблизительно 6 ч до приблизительно 8 ч, от приблизительно 8 ч до приблизительно 10 ч, от приблизительно 10 ч до приблизительно 12 ч, от приблизительно 12 ч до приблизительно 14 ч, от приблизительно 14 ч до приблизительно 16 ч, от приблизительно 16 ч до приблизительно 18 ч, от приблизительно 18 ч до приблизительно 20 ч, от приблизительно 20 ч до приблизительно 24 ч, от приблизительно 24 ч до приблизительно 30 ч, от приблизительно 30 ч до приблизительно 36 ч, от приблизительно 36 ч до приблизительно 42 ч, от приблизительно 42 ч до приблизительно 48 ч, от приблизительно 48 ч до приблизительно 60 ч, от приблизительно 60 ч до приблизительно 3 суток, от приблизительно 3 суток до приблизительно 4 суток, от приблизительно 4 суток и приблизительно 5 суток, от приблизительно 5 суток до приблизительно 6 суток, от приблизительно 6 суток до приблизительно 7 суток после проведения лучевой терапии.

[0148] В некоторых вариантах осуществления способ включает многократное введение композиции, содержащей модифицированные Т-клетки, и/или многократное проведение лучевой терапии. Например, в некоторых вариантах осуществления способ включает два введения, три введения, четыре введения, пять введений, шесть введений, семь введений, восемь введений, девять введений, десять введений, одиннадцать введений, двенадцать введений, тринадцать введений, четырнадцать введений или пятнадцать введений композиции, содержащей модифицированные Т-клетки, и/или проведений лучевой терапии. Например, в некоторых вариантах осуществления способ включает менее пяти введений, менее десяти введений, менее пятнадцати введений, менее двадцати введений, менее двадцати пяти введений, менее тридцати введений, менее пятидесяти введений, менее чем семидесяти пять введений, менее ста или менее двухсот введений композиции, содержащей модифицированные Т-клетки, и/или проведений лучевой терапии.

[0149] В некоторых аспектах обеспечивается способ модуляции иммунного ответа у субъекта, включающий: введение субъекту модифицированной Т-клетки, ассоциированной с антигеном, где модифицированную Т-клетку получают способом, включающим стадии: а) инкубирование входной Т-клетки с i) антигеном или ii) и антигеном и адъювантом в течение достаточного периода времени для обеспечения связывания антигена с клеточной поверхностью входной Т-клетки, где антиген содержит иммуногенный эпитоп, тем самым получая модифицированную Т-клетку, ассоциированную с антигеном; и b) введение модифицированной Т-клетки субъекту.

[0150] В некоторых аспектах обеспечивается модифицированная Т-клетка для применения в способе лечения, где указанный способ включает: а) пропускание клеточной суспензии, содержащей входную Т-клетку, содержащую антиген, через деформирующее клетку сужение, где диаметр сужения является функцией диаметра входной Т-клетки в суспензии, что вызывает, тем самым, пертурбации входной Т-клетки, достаточно большие для того, чтобы адъювант прошел через них, с образованием пертурбированной входной Т-клетки; и b) инкубирование пертурбированной входной Т-клетки с адъювантом в течение достаточного периода времени для обеспечения проникновения адъюванта в пертурбированную входную Т-клетку; с получением, тем самым, модифицированной T-клетки, содержащей антиген и адъювант; и с) введение модифицированной Т-клетки субъекту. В некоторых вариантах осуществления концентрация адъюванта, инкубированного с пертурбированной входной Т-клеткой, составляет от приблизительно 1 пМ до 10 мМ. В некоторых вариантах осуществления адъювант инкапсулирован в наночастице.

[0151] В некоторых аспектах обеспечивается модифицированная Т-клетка для применения в лечении рака, инфекционного заболевания или заболевания, ассоциированного с вирусом, у субъекта, где указанный способ включает: а) пропускание клеточной суспензии, содержащей входную Т-клетку, содержащую антиген, через деформирующее клетку сужение, где антиген содержит иммуногенный эпитоп, где диаметр сужения является функцией диаметра входной Т-клетки в суспензии, что вызывает, тем самым, пертурбации входной Т-клетки, достаточно большие для того, чтобы адъювант прошел через них, с образованием пертурбированной входной Т-клетки; b) инкубирование пертурбированной входной Т-клетки с адъювантом в течение достаточного периода времени для обеспечения проникновения адъюванта в пертурбированную входную Т-клетку; с получением, тем самым, модифицированной T-клетки, содержащей антиген и адъювант; и с) введение субъекту модифицированной Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления антиген ассоциирован с раком, инфекционным заболеванием или заболеванием, ассоциированным с вирусом. В некоторых вариантах осуществления концентрация адъюванта, инкубированного с пертурбированной входной Т-клеткой, составляет от приблизительно 1 пМ до 10 мМ. В некоторых вариантах осуществления адъювант инкапсулирован в наночастице.

[0152] В некоторых вариантах осуществления модифицированные Т-клетки по настоящему изобретению не вызывают толерогенности у субъекта. В некоторых вариантах осуществления модифицированные Т-клетки не подавляют иммунный ответ у субъекта. В некоторых вариантах осуществления модифицированные Т-клетки не содержат толерогенного фактора. В некоторых вариантах осуществления модифицированные Т-клетки не вводят в комбинации с толерогенным фактором. В некоторых вариантах осуществления модифицированные Т-клетки не вводят до, одновременно или после введения толерогенного фактора.

Антигены

[0153] В некоторых вариантах осуществления изобретения используется доставка антигенов для модуляции иммунного ответа, где антиген доставляется к Т-клетке любым из способов, описанных здесь. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет единственный антиген. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой смесь антигенов. Антиген представляет вещество, которое стимулирует специфический иммунный ответ, такой как иммунный ответ, опосредованный клетками или антителами. Антигены связываются с рецепторами, экспрессированными иммунными клетками, такими как рецепторы Т-клеток (TCR), которые специфичны для определенного антигена. Затем связывание антиген-рецептор запускает внутриклеточные сигнальные пути, которые приводят к нижестоящим иммунным эффекторным путям, таким как активация клеток, продукция цитокинов, миграция клеток, секреция цитотоксических факторов и продукция антител.

[0154] В некоторых вариантах осуществления антиген представляет полипептидный антиген. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет антиген, ассоциированный с заболеванием. В некоторых вариантах осуществления антигены происходят из чужеродных источников, таких как бактерии, грибы, вирусы или аллергены. В некоторых вариантах осуществления антигены происходят из внутренних источников, таких как собственные белки (т.е. аутоантигены) или фрагмент собственного белка. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет мутированный или иным образом измененный аутоантиген. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет опухолевый антиген. В некоторых вариантах осуществления антиген находится в клеточном лизате. Аутоантигены представляют антигены, находящиеся на или в собственных клетках организма. Аутоантигены обычно не стимулируют иммунный ответ, но могут стимулировать в контексте аутоиммунных заболеваний, таких как диабет I типа или ревматоидный артрит, или когда они чрезмерно экспрессируются или экспрессируются неравномерно/эктопически.

[0155] В некоторых вариантах осуществления антиген ассоциирован с вирусом. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет вирусный антиген. Примеры вирусных антигенов включают антигены ВПЧ, антигены HCMV, антигены SARS-CoV и антигены вируса гриппа.

[0156] В некоторых вариантах осуществления антиген ассоциирован с микроорганизмом; например, бактерией. В некоторых вариантах осуществления модулированный иммунный ответ включает усиленный патогенный иммунный ответ на микроорганизм; например, бактерию.

[0157] В некоторых аспектах в изобретении используются способы доставки антигена в Т-клетку, где способ включает пропускание клеточной суспензии, содержащей Т-клетку, через сужение, где указанное сужение деформирует Т-клетку, что вызывает, тем самым, пертурбацию клетки таким образом, что антиген проникает в клетку, где указанная клеточная суспензия контактирует с антигеном. В некоторых вариантах осуществления антиген доставляется в Т-клетку in vitro, ex vivo или in vivo.

[0158] В некоторых вариантах осуществления доставляемый антиген очищен. В некоторых вариантах осуществления антиген составляет, по меньшей мере, приблизительно 60% по массе (сухая масса) представляющего интерес антигена. В некоторых вариантах осуществления очищенный антиген составляет, по меньшей мере, приблизительно 75%, 90% или 99% представляющего интерес антигена. В некоторых вариантах осуществления очищенный антиген составляет, по меньшей мере, приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 98%, 99% или 100% (мас./мас.) представляющего интерес антигена. Чистоту определяют любыми известными методами, включая, помимо прочего, колоночную хроматографию, тонкослойную хроматографию (ТСХ), высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), спектроскопию ядерного магнитного резонанса (ЯМР), масс-спектрометрию или гель-электрофорез в SDS-PAGE. Очищенная ДНК или РНК определяется как ДНК или РНК, не содержащая экзогенных нуклеиновых кислот, углеводов и липидов.

Адъюванты

[0159] Адъюванты можно использовать для усиления ответа иммунных клеток (например, Т-клеточного ответа), такого как иммунный ответ на антиген. Многочисленные адъюванты также можно использовать для усиления иммунного ответа и можно использовать в сочетании с антигенами, например, для усиления иммунного ответа на антигены по сравнению с иммунным ответом только на одни антигены. В некоторых вариантах осуществления в изобретении используется доставка адъювантов для усиления иммунного ответа, где адъювант доставляется к Т-клетке любым из способов, описанных здесь. В некоторых вариантах осуществления адъювант усиливает иммунный ответ на антиген. Например, адъювант может способствовать иммуногенной презентации антигена антигенпрезентирующей клеткой. В некоторых вариантах осуществления адъювант вводят одновременно с антигеном. В некоторых вариантах осуществления адъювант и антиген вводят последовательно. В некоторых вариантах осуществления адъювант вводят до введения антигена. В некоторых вариантах осуществления адъювант вводят после введения антигена. В некоторых вариантах осуществления адъювант изменяет хоминг Т-клеток (например, хоминг Т-клеток в ткани-мишени, такие как опухоль) по сравнению с хомингом Т-клеток в отсутствии адъюванта. В некоторых вариантах осуществления адъювант повышает пролиферацию Т-клеток по сравнению с пролиферацией Т-клеток в отсутствие адъюванта.

[0160] В некоторых аспектах в изобретении используются способы получения иммуногенной антигенпрезентирующей Т-клетки, содержащей антиген из входной Т-клетки, где входная Т-клетка проходит через сужение, где указанное сужение деформирует входную Т-клетку, вызывая тем самым пертурбацию клетки, так что антиген проникает во входную Т-клетку, тем самым получая иммуногенную антигенпрезентирующую Т-клетку, содержащую антиген.

[0161] В некоторых аспектах в изобретении используются способы доставки адъюванта в Т-клетку, где способ включает пропускание клеточной суспензии, содержащей Т-клетку, через сужение, где указанное сужение деформирует Т-клетку, вызывая тем самым пертурбацию Т-клетки, так что адъювант проникает в клетку, где указанная клеточная суспензия контактирует с адъювантом. В некоторых вариантах осуществления адъювант доставляется в Т-клетку in vitro, ex vivo или in vivo.

Микрофлюидные системы и их компоненты

Микрофлюидные каналы для обеспечения сужений, деформирующих клетки

[0162] В некоторых вариантах осуществления изобретение обеспечивает способы модуляции иммунного ответа пропусканием клеточной суспензии, содержащей Т-клетку, через сужение, где сужение деформирует Т-клетку, вызывая тем самым пертурбацию Т-клетки так, что антиген и/или адъювант проникает в Т-клетку, где сужение находится в микрофлюидном канале. В некоторых вариантах осуществления несколько сужений могут быть размещены параллельно и/или последовательно внутри микрофлюидного канала. Типичные микрофлюидные каналы, содержащие сужения, деформирующие клетки, для применения в способах, раскрытых здесь, описаны в WO2013059343. Примеры поверхностей, имеющих поры, для применения в способах, раскрытых здесь, описаны в WO2017041050.

[0163] В некоторых вариантах осуществления микрофлюидный канал включает просвет и сконфигурирован таким образом, что Т-клетка, суспендированная в буфере, может проходить через него, где микрофлюидный канал имеет сужение. Микрофлюидный канал может быть изготовлен из любого из ряда материалов, включая кремний, металл (например, нержавеющую сталь), пластик (например, полистирол), керамику, стекло, кристаллические подложки, аморфные подложки или полимеры (например, полиметилметакрилат (PMMA), PDMS, циклический олефиновый сополимер (COC) и т.д.). Изготовление микрофлюидного канала может быть выполнено любым методом, известным в данной области техники, включая сухое травление, влажное травление, фотолитографию, литье под давлением, лазерную абляцию или шаблоны SU-8.

[0164] В некоторых вариантах осуществления сужение внутри микрофлюидного канала включает входной участок, центральную точку и выходной участок. В некоторых вариантах осуществления длина, глубина и ширина сужения внутри микрофлюидного канала могут варьироваться. В некоторых вариантах осуществления диаметр сужения внутри микрофлюидного канала является функцией диаметра Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления диаметр сужения внутри микрофлюидного канала составляет от приблизительно 20% до приблизительно 99% от диаметра Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления диаметр сужения составляет приблизительно 20%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90% или приблизительно 99% от диаметра Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления диметр сужения составляет приблизительно 20%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90% или приблизительно 99% от минимального поперечного сечения Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления канал имеет ширину сужения от приблизительно 2 мкм до приблизительно 10 мкм или любую ширину или диапазон ширин между ними. Например, ширина сужения может составлять приблизительно 2 мкм, приблизительно 3 мкм, приблизительно 4 мкм, приблизительно 5 мкм, приблизительно 6 мкм или приблизительно 7 мкм. В некоторых вариантах осуществления канал имеет длину сужения приблизительно 10 мкм и ширину сужения приблизительно 4 мкм. Поперечное сечение канала, входная часть, центральная точка и выходная часть также могут варьировать. Например, поперечные сечения могут быть круглыми, эллиптическими, удлиненными, квадратными, шестиугольными или треугольными по форме. Входной участок определяет угол сужения, где угол сужения оптимизирован для уменьшения закупорки канала и оптимизирован для улучшенной доставки соединения в Т-клетку. Угол выходной части также может варьировать. Например, угол выходного участка конфигурирован так, чтобы снизить вероятность турбулентности, которая может привести к отсутствию ламинарного потока. В некоторых вариантах осуществления стенки входного участка и/или выходного участка являются линейными. В других вариантах осуществления стенки входного участка и/или выходного участка изогнуты.

[0165] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с любым из способов или композиций, описанных здесь, диаметр сужения является функцией диаметра Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления диаметр Т-клетки измеряется минимальным поперечным сечением Т-клетки.

[0166] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с любым из способов или композиций, описанных здесь, диаметр сужения составляет от приблизительно 10% до приблизительно 99% от среднего диаметра входных Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления диаметр сужения составляет от приблизительно 10% до приблизительно 90%, от приблизительно 10% до приблизительно 80%, от приблизительно 10% до приблизительно 70%, от приблизительно 20% до приблизительно 60%, от приблизительно 40% до приблизительно 60% или от приблизительно 30% до приблизительно 45% от среднего диаметра входных Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления диаметр сужения составляет от приблизительно 10% до приблизительно 20%, от приблизительно 20% до приблизительно 30%, от приблизительно 30% до приблизительно 40%, от приблизительно 40% до приблизительно 50%, от приблизительно 50% до приблизительно 60%, от приблизительно 60% до приблизительно 70%, от приблизительно 70% до приблизительно 80%, от приблизительно 80% до приблизительно 90% или от приблизительно 90% до приблизительно 99% от среднего диаметра входных Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления диаметр сужения составляет приблизительно 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% от среднего диаметра входных Т-клеток.

[0167] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с любым из способов или композиций, описанных здесь, диаметр сужения составляет от приблизительно 1,5 мкм до приблизительно 10 мкм. В некоторых вариантах осуществления диаметр сужения составляет от приблизительно 2 мкм до приблизительно 8 мкм. В некоторых вариантах осуществления диаметр сужения составляет от приблизительно 2,5 мкм до приблизительно 6 мкм. В некоторых вариантах осуществления диаметр сужения составляет от приблизительно 3 мкм до приблизительно 5 мкм. В некоторых вариантах осуществления диаметр сужения составляет от приблизительно 3 мкм до приблизительно 4 мкм. В некоторых вариантах осуществления диаметр сужения составляет от приблизительно 1,5 мкм до приблизительно 10 мкм, от приблизительно 1,75 мкм до приблизительно 9 мкм, от приблизительно 2 мкм до приблизительно 8 мкм, от приблизительно 2,25 мкм до приблизительно 7 мкм, от приблизительно 2,5 мкм до приблизительно 6 мкм, от приблизительно 2,75 мкм до приблизительно 5,5 мкм, от приблизительно 3 мкм до приблизительно 5 мкм, от приблизительно 3 мкм до приблизительно 4 мкм, от приблизительно 3,1 мкм до приблизительно 3,9 мкм, от приблизительно 3,2 мкм до приблизительно 3,8 мкм, от приблизительно 3,3 мкм до приблизительно 3,7 мкм или от приблизительно 3,7 мкм до приблизительно 3,6 мкм. В некоторых вариантах осуществления диаметр сужения составляет приблизительно 1,0 мкм, 1,2 мкм, 1,4 мкм, 1,6 мкм, 1,8 мкм, 2,0 мкм, 2,2 мкм, 2,4 мкм, 2,6 мкм, 2,8 мкм, 3,0 мкм, 3,2 мкм, 3,4 мкм, 3,6 мкм, 3,8 мкм, 4,0 мкм, 4,2 мкм, 4,4 мкм, 4,6 мкм, 4,8 мкм, 5,0 мкм, 5,5 мкм, 6,0 мкм, 6,5 мкм, 7,0 мкм, 8,0 мкм, 9,0 или 10,0 мкм. В некоторых вариантах осуществления диаметр сужения составляет приблизительно 3,5 мкм.

[0168] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с любым из способов или композиций, описанных здесь, диаметр сужения составляет от приблизительно 3 мкм до приблизительно 15 мкм. В некоторых вариантах осуществления диаметр сужения составляет от приблизительно 3 мкм до приблизительно 10 мкм. В некоторых вариантах осуществления диаметр сужения составляет от приблизительно 4 мкм до приблизительно 10 мкм. В некоторых вариантах осуществления диаметр сужения составляет от приблизительно 4,2 мкм до приблизительно 6 мкм. В некоторых вариантах осуществления диаметр сужения составляет от приблизительно 4,2 мкм до приблизительно 4,8 мкм. В некоторых вариантах осуществления диаметр сужения составляет от приблизительно 2 мкм до приблизительно 14 мкм, от приблизительно 4 мкм до приблизительно 12 мкм, от приблизительно 6 мкм до приблизительно 9 мкм, от приблизительно 4 мкм до приблизительно 6 мкм, от приблизительно 4 мкм до приблизительно 6 мкм, от приблизительно 3,5 мкм до приблизительно 7 мкм, от приблизительно 3,5 мкм до приблизительно 6,3 мкм, от приблизительно 3,5 мкм до приблизительно 5,6 мкм, от приблизительно 3,5 мкм до приблизительно 4,9 мкм, от приблизительно 4,2 мкм до приблизительно 6,3 мкм, от приблизительно 4,2 мкм до приблизительно 5,6 мкм или от приблизительно 4,2 мкм до приблизительно 4,9 мкм. В некоторых вариантах осуществления диаметр сужения составляет приблизительно 2 мкм, 2,5 мкм, 3 мкм, 3,5 мкм, 4 мкм, 4,5 мкм, 5 мкм, 5,5 мкм, 6 мкм, 6,5 мкм, 7 мкм, 7,5 мкм, 8 мкм, 8,5 мкм, 9 мкм, 9,5 мкм, 10 мкм, 10,5 мкм, 11 мкм, 11,5 мкм, 12 мкм, 12,5 мкм, 13 мкм, 13,5 мкм, 14 мкм, 14,5 мкм или 15 мкм. В некоторых вариантах осуществления диаметр сужения составляет приблизительно 4,0 мкм, 4,1 мкм, 4,2 мкм, 4,3 мкм, 4,4 мкм, 4,5 мкм, 4,6 мкм, 4,7 мкм, 4,8 мкм, 4,9 мкм или 5,0 мкм. В некоторых вариантах осуществления диаметр сужения составляет приблизительно 4,5 мкм.

[0169] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с любым из способов или композиций, описанных здесь, входная Т-клетка проходит через сужение со скоростью потока от приблизительно 0,001 мл/мин до приблизительно 200 мл/мин или с любой скоростью или диапазоном скоростей между ними. В некоторых вариантах осуществления скорость потока составляет от приблизительно 0,001 мл/мин до приблизительно 175 мл/мин, от приблизительно 0,001 мл/мин до приблизительно 150 мл/мин, от приблизительно 0,001 мл/мин до приблизительно 125 мл/мин, от приблизительно 0,001 мл/мин до приблизительно 100 мл/мин, от приблизительно 0,001 мл/мин до приблизительно 50 мл/мин, от приблизительно 0,001 мл/мин до приблизительно 25 мл/мин, от приблизительно 0,001 мл/мин до приблизительно 10 мл/мин, от приблизительно 0,001 мл/мин до приблизительно 7,5 мл/мин, от приблизительно 0,001 мл/мин до приблизительно 5,0 мл/мин, от приблизительно 0,001 мл/мин до приблизительно 2,5 мл/мин, от приблизительно 0,001 мл/мин до приблизительно 1 мл/мин, от приблизительно 0,001 мл/мин до приблизительно 0,1 мл/мин или от приблизительно 0,001 мл/мин до приблизительно 0,01 мл/мин. В некоторых вариантах осуществления скорость потока составляет от приблизительно 0,001 мл/мин до приблизительно 200 мл/мин, от приблизительно 0,01 мл/мин до приблизительно 200 мл/мин, от приблизительно 0,1 мл/мин до приблизительно 200 мл/мин от приблизительно 1 мл/мин до приблизительно 200 мл/мин, от приблизительно 10 мл/мин до приблизительно 200 мл/мин, от приблизительно 50 мл/мин до приблизительно 200 мл/мин, от приблизительно 75 мл/мин до приблизительно 200 мл/мин, от приблизительно 100 мл/мин до приблизительно 200 мл/мин, от приблизительно 150 мл/мин до приблизительно 200 мл/мин, от приблизительно 0,5 мл/мин до приблизительно 200 мл/мин, от приблизительно 1 мл/мин до приблизительно 200 мл/мин, от приблизительно 2,5 мл/мин до приблизительно 200 мл/мин, от приблизительно 5 мл/мин до приблизительно 200 мл/мин, от приблизительно 7,5 мл/мин до приблизительно 200 мл/мин, от приблизительно 10 мл/мин до приблизительно 200 мл/мин, от приблизительно 25 мл/мин до приблизительно 200 мл/мин или от приблизительно 175 мл/мин до приблизительно 200 мл/мин. В некоторых вариантах осуществления входная Т-клетка проходит через сужение со скоростью потока от приблизительно 10 мл/мин до приблизительно 200 мл/мин. В некоторых вариантах осуществления входная Т-клетка проходит через сужение со скоростью приблизительно 100 мл/мин.

[0170] В некоторых вариантах осуществления в соответствии с любым из способов или композиций, описанных здесь, сужение может иметь любую форму, известную в данной области; например, 3-мерную форму или 2-мерную форму. 2-мерная форма, такая как форма поперечного сечения, сужения может быть, без ограничения, круглой, эллиптической, сферической, квадратной, звездообразной, треугольной, многоугольной, пятиугольной, шестиугольной, семиугольной или восьмиугольной. 3-мерная форма сужения может быть, без ограничения, цилиндрической, конической или кубоидальной. В некоторых вариантах осуществления форма поперечного сечения сужения представляет собой прямоугольник. В некоторых вариантах осуществления форма поперечного сечения сужения представляет щель. В некоторых вариантах осуществления форма поперечного сечения сужения представляет собой щель, имеющую ширину от приблизительно 2,5 мкм до приблизительно 10 мкм и/или глубину от приблизительно 1 мкм до приблизительно 200 мкм. В некоторых вариантах осуществления форма поперечного сечения сужения представляет собой щель, имеющую ширину от приблизительно 3 мкм до приблизительно 6 мкм и/или глубину от приблизительно 20 мкм до приблизительно 120 мкм. В некоторых вариантах осуществления форма поперечного сечения сужения представляет собой щель, имеющую ширину от приблизительно 3 мкм до приблизительно 6 мкм и/или глубину от приблизительно 20 мкм до приблизительно 120 мкм. В некоторых вариантах осуществления форма поперечного сечения сужения представляет собой щель, имеющую ширину от приблизительно 3,2 мкм до приблизительно 4 мкм и/или глубину от приблизительно 40 мкм до приблизительно 120 мкм. В некоторых вариантах осуществления форма поперечного сечения сужения представляет щель, имеющую ширину от приблизительно 4,2 мкм до приблизительно 6 мкм и/или глубину от приблизительно 20 мкм до приблизительно 80 мкм. В некоторых вариантах осуществления форма поперечного сечения сужения представляет собой щель, имеющую ширину приблизительно 4,5 мкм и/или глубину приблизительно 80 мкм. В некоторых вариантах осуществления щель имеет длину от приблизительно 5 мкм до приблизительно 50 мкм. В некоторых вариантах осуществления щель имеет длину от приблизительно 10 мкм до приблизительно 30 мкм. В некоторых вариантах осуществления щель имеет длину от приблизительно 2 мкм до приблизительно 50 мкм. В некоторых вариантах осуществления щель имеет длину от приблизительно 2 мкм до приблизительно 5 мкм, от приблизительно 5 мкм до приблизительно 10 мкм, от приблизительно 10 мкм до приблизительно 15 мкм, от приблизительно 15 мкм до приблизительно 20 мкм, от приблизительно 20 мкм до приблизительно 25 мкм, от приблизительно 25 мкм до приблизительно 30 мкм, от приблизительно 30 мкм до приблизительно о 35 мкм, от приблизительно 35 мкм до приблизительно 40 мкм, от приблизительно 40 мкм до приблизительно 45 мкм или от приблизительно 45 мкм до приблизительно 50 мкм. В некоторых вариантах осуществления щель имеет длину приблизительно 10 мкм.

Поверхность, имеющая поры для обеспечения сужений, деформирующих клетки

[0171] В некоторых вариантах осуществления изобретение обеспечивает способы модуляции иммунного ответа пропусканием клеточной суспензии, содержащей Т-клетку, через сужение, где сужение деформирует Т-клетку, вызывая тем самым пертурбацию Т-клетки так, что антиген и/или адъювант проникает в Т-клетку, где сужение представляет пору или находится внутри поры. В некоторых вариантах осуществления пора находится на поверхности. Примеры поверхностей, имеющих поры, для применения в способах, раскрытых здесь, описаны в WO2017041050.

[0172] Поверхности, описанные здесь, могут быть изготовлены из любого из множества материалов и принимать любую из множества форм. В некоторых вариантах осуществления поверхность представляет фильтр. В некоторых вариантах осуществления поверхность представляет мембрану. В некоторых вариантах осуществления фильтр представляет тангенциальный фильтр с поперечным потоком. В некоторых вариантах осуществления поверхность представляет губку или губчатую матрицу. В некоторых вариантах поверхность представляет матрицу.

[0173] В некоторых вариантах осуществления поверхность представляет поверхность с извилистыми линиями. В некоторых вариантах осуществления поверхность с извилистыми линиями содержит ацетат целлюлозы. В некоторых вариантах осуществления поверхность содержит материал, выбранный, без ограничения, из синтетических или природных полимеров, поликарбоната, кремния, стекла, металла, сплава, нитрата целлюлозы, серебра, ацетата целлюлозы, нейлона, полиэфира, полиэфирсульфона, полиакрилонитрила (PAN), полипропилена, PVDF, политетрафторэтилена, смешанного эфира целлюлозы, фарфора и керамики.

[0174] Поверхность, описанная здесь, может иметь любую форму, известную в данной области техники; например 3-мерную форму. 2-мерная форма поверхности может быть, без ограничения, круглой, эллиптической, сферической, квадратной, звездообразной, треугольной, многоугольной, пятиугольной, шестиугольной, семиугольной или восьмиугольной. В некоторых вариантах осуществления поверхность имеет круглую форму. В некоторых вариантах осуществления 3-мерная форма поверхности является цилиндрической, конической или кубической.

[0175] Поверхность может иметь различную ширину и толщину поперечного сечения. В некоторых вариантах осуществления ширина поперечного сечения поверхности составляет от приблизительно 1 мм до приблизительно 1 м или любая ширина поперечного сечения или диапазон ширины поперечного сечения между ними. В некоторых вариантах осуществления поверхность имеет определенную толщину. В некоторых вариантах осуществления толщина поверхности одинакова. В некоторых вариантах осуществления толщина поверхности может варьировать. Например, в некоторых вариантах осуществления участки поверхности могут быть толще или тоньше, чем другие участки поверхности. В некоторых вариантах осуществления толщина поверхности варьируется от приблизительно 1% до приблизительно 90% или любого процента или диапазона процентов между ними. В некоторых вариантах осуществления поверхность имеет толщину от приблизительно 0,01 мкм до приблизительно 5 мм или любую толщину или диапазон толщины между ними.

[0176] В некоторых вариантах осуществления сужение представляет пору или находится внутри поры. Ширина поперечного сечения пор связана с типом Т-клетки, подлежащей обработке. В некоторых вариантах осуществления размер пор является функцией диаметра Т-клетки или кластера Т-клеток, подлежащих обработке. В некоторых вариантах осуществления размер пор является таким, что Т-клетка подвергается пертурбации при прохождении через пору. В некоторых вариантах осуществления размер пор меньше диаметра Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления размер пор составляет от приблизительно 10% до приблизительно 99% от диаметра Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления размер пор составляет приблизительно 10%, приблизительно 15%, приблизительно 20%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90% или приблизительно 99% от диаметра Т-клетки. Оптимальный размер пор или ширина поперечного сечения пор могут варьироваться в зависимости от области применения и/или типа Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления размер пор составляет от приблизительно 2 мкм до приблизительно 14 мкм. В некоторых вариантах осуществления размер пор составляет приблизительно 2 мкм, приблизительно 3 мкм, приблизительно 4 мкм, приблизительно 5 мкм, приблизительно 8 мкм, приблизительно 10 мкм, приблизительно 12 мкм или приблизительно 14 мкм. В некоторых вариантах осуществления ширина поперечного сечения составляет от приблизительно 2 мкм до приблизительно 14 мкм. В некоторых вариантах осуществления поперечное сечение пор составляет приблизительно 2 мкм, приблизительно 3 мкм, приблизительно 4 мкм, приблизительно 5 мкм, приблизительно 8 мкм, приблизительно 10 мкм, приблизительно 12 мкм или приблизительно 14 мкм.

[0177] Входы и выходы канала поры могут иметь разные углы. Угол поры может быть выбран для минимизации закупорки поры при прохождении через нее Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления скорость потока через пору составляет от приблизительно 0,001 мл/см²/с до приблизительно 100 л/см²/с или любая скорость или диапазон скоростей между ними. Например, угол входа или выхода может составлять от приблизительно 0 до приблизительно 90 градусов. В некоторых вариантах осуществления входной или выходной участок может составлять более 90 градусов. В некоторых вариантах осуществления поры имеют одинаковые углы входа и выхода. В некоторых вариантах осуществления поры имеют разные углы входа и выхода. В некоторых вариантах осуществления грань поры гладкая, например округлая или изогнутая. Гладкая грань поры имеет непрерывную, плоскую и ровную поверхность без выступов, гребней или неровностей. В некоторых вариантах осуществления грань поры острая. Острая грань поры имеет тонкий край, заостренный или под острым углом. В некоторых вариантах осуществления канал для пор является прямым. Прямой канал поры не содержит искривлений, изгибов, углов или других неровностей. В некоторых вариантах осуществления канал поры изогнут. Изогнутый канал поры изогнут или отклоняется от прямой линии. В некоторых вариантах осуществления канал поры имеет несколько изгибов, например, приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более изгибов.

[0178] Поры могут иметь любую форму, известную в данной области техники, в том числе 2-мерную или 3-мерную форму. Форма поры (например, форма поперечного сечения) может быть, без ограничения, круглой, эллиптической, сферической, квадратной, звездообразной, треугольной, многоугольной, пятиугольной, шестиугольной, семиугольной и восьмиугольной. В некоторых вариантах осуществления поперечное сечение поры имеет круглую форму. В некоторых вариантах осуществления 3-мерная форма поры является цилиндрической или конической. В некоторых вариантах осуществления пора имеет рифленую форму входа и выхода. В некоторых вариантах осуществления форма пор является однородной (т.е. постоянной или регулярной) среди пор на данной поверхности. В некоторых вариантах осуществления форма пор является неоднородной (т.е. смешанной или варьирующей) среди пор на данной поверхности.

[0179] Поверхности, описанные здесь, могут иметь диапазон общего числа пор. В некоторых вариантах осуществления поры составляют от приблизительно 10% до приблизительно 80% от общей площади поверхности. В некоторых вариантах осуществления поверхность содержит в целом от приблизительно 1,0×10⁵ до приблизительно 1,0×10³⁰ пор или любое количество или диапазон чисел между ними. В некоторых вариантах осуществления поверхность содержит от приблизительно 10 до приблизительно 1,0×10¹⁵ пор/мм² площади поверхности.

[0180] Поры могут быть распределены многочисленными способами на данной поверхности. В некоторых вариантах осуществления поры распределены параллельно на данной поверхности. В одном таком примере поры распределены рядом друг с другом в одном направлении и на одинаковом расстоянии друг от друга в пределах данной поверхности. В некоторых вариантах осуществления распределение пор является упорядоченным или однородным. В одном таком примере поры распределены в регулярном системном порядке или на одинаковом расстоянии друг от друга на данной поверхности. В некоторых вариантах осуществления распределение пор является произвольным или неоднородным. В одном таком примере поры распределены в нерегулярном, неупорядоченном порядке или на разных расстояниях друг от друга на данной поверхности. В некоторых вариантах осуществления несколько поверхностей распределены последовательно. Многочисленные поверхности могут быть однородными или неоднородными по размеру, форме и/или шероховатости поверхности. Многочисленные поверхности могут дополнительно содержать поры с однородным или неоднородным размером пор, формой и/или количеством, тем самым обеспечивая одновременную доставку ряда соединений в различные типы Т-клеток.

[0181] В некоторых вариантах осуществления индивидуальная пора имеет одинаковый размер по ширине (т. е. постоянную ширину по длине канала поры). В некоторых вариантах осуществления индивидуальная пора имеет переменную ширину (т.е. увеличивающуюся или уменьшающуюся ширину по длине канала поры). В некоторых вариантах осуществления поры на данной поверхности имеют одинаковую индивидуальную глубину пор. В некоторых вариантах осуществления поры на данной поверхности имеют разную индивидуальную глубину пор. В некоторых вариантах осуществления поры непосредственно примыкают друг к другу. В некоторых вариантах осуществления поры удалены друг от друга на расстоянии. В некоторых вариантах осуществления поры отделены друг от друга на расстоянии от приблизительно 0,001 мкм до приблизительно 30 мм или любом расстоянии или диапазоне расстояний между ними.

[0182] В некоторых вариантах осуществления поверхность покрыта материалом. Материал может быть выбран из любого материала, известного в данной области техники, включая, помимо прочего, тефлон, адгезивное покрытие, поверхностно-активные вещества, белки, молекулы адгезии, антитела, антикоагулянты, факторы, которые модулируют клеточную функцию, нуклеиновые кислоты, липиды, углеводы или трансмембранные белки. В некоторых вариантах осуществления поверхность покрыта поливинилпирролидоном (ПВП). В некоторых вариантах осуществления материал ковалентно присоединен к поверхности. В некоторых вариантах осуществления материал нековалентно присоединен или адсорбирован на поверхности. В некоторых вариантах осуществления поверхностные молекулы высвобождаются, когда Т-клетки проходят через поры.

[0183] В некоторых вариантах осуществления поверхность имеет модифицированные химические свойства. В некоторых вариантах поверхность является полярной. В некоторых вариантах поверхность является гидрофильной. В некоторых вариантах осуществления поверхность является неполярной. В некоторых вариантах поверхность является гидрофобной. В некоторых вариантах поверхность заряжена. В некоторых вариантах осуществления поверхность заряжена положительно и/или отрицательно. В некоторых вариантах осуществления поверхность может быть заряжена положительно в некоторых участках и отрицательно заряжена в других участках. В некоторых вариантах осуществления поверхность имеет общий положительный или общий отрицательный заряд. В некоторых вариантах осуществления поверхность может быть любой: гладкой, электрополированной, шероховатой или обработанной плазмой. В некоторых вариантах осуществления поверхность содержит цвиттер-ионное или диполярное соединение. В некоторых вариантах осуществления поверхность обработана плазмой.

[0184] В некоторых вариантах осуществления поверхность находится в более крупном модуле. В некоторых вариантах осуществления поверхность находится внутри шприца, такого как пластиковый или стеклянный шприц. В некоторых вариантах осуществления поверхность находится внутри держателя пластикового фильтра. В некоторых вариантах осуществления поверхность находится внутри наконечника пипетки.

Пертурбации клеток

[0185] В некоторых вариантах осуществления изобретение обеспечивает способы модуляции иммунного ответа пропусканием клеточной суспензии, содержащей Т-клетку, через сужение, что вызывает, тем самым, пертурбацию Т-клетки, так что антиген и/или адъювант проникает в Т-клетку, где пертурбация в иммунной клетке представляет отверстие в Т-клетке, которое позволяет веществу снаружи Т-клетки перемещаться в Т-клетку (например, щель, разрыв, полость, апертуру, пору, разрыв, брешь, перфорацию). В некоторых вариантах осуществления к входной клетке прикладывается деформирующая сила, когда она проходит через сужение. Деформация может быть вызвана, например, механической деформацией и/или усилиями сдвига. В некоторых вариантах осуществления пертурбация представляет собой пертурбацию мембраны иммунной клетки. В некоторых вариантах осуществления пертурбация носит временный характер. В некоторых вариантах осуществления пертурбация Т-клетки продолжается от приблизительно 1,0×10^-9 с до приблизительно 2 ч или любое время или диапазон времени между ними. В некоторых вариантах осуществления пертурбация Т-клетки продолжается от приблизительно 1,0×10^-9 с до приблизительно 1 с, от приблизительно 1 с до приблизительно 1 мин или от приблизительно 1 мин до приблизительно 1 ч. В некоторых вариантах осуществления пертурбация Т-клетки продолжается в пределах от приблизительно 1,0×10^-9 до приблизительно 1,0×10^-1, от приблизительно 1,0×10^-9 до приблизительно 1,0×10^-2, от приблизительно 1,0×10^-9 до приблизительно 1,0×10^-3, от приблизительно 1,0×10^-9 до приблизительно 1,0×10^-4, от приблизительно 1,0×10^-9 до приблизительно 1,0×10^-5, от приблизительно 1,0×10^-9 до приблизительно 1,0×10^-6, от приблизительно 1,0×10^-9 до приблизительно 1,0×10^-7 или от приблизительно 1,0×10^-9 до приблизительно 1,0×10^-8 с. В некоторых вариантах осуществления пертурбация Т-клетки продолжается в течение любого из значений от приблизительно 1,0×10^-8 до приблизительно 1,0×10^-1, от приблизительно 1,0×10^-7 до приблизительно 1,0×10^-1, от приблизительно 1,0×10^-6 до приблизительно 1,0×10^-1, от приблизительно 1,0×10^-5 до приблизительно 1,0×10^-1, от приблизительно 1,0×10^-4 до приблизительно 1,0×10^-1, от приблизительно 1,0×10^-3 до приблизительно 1,0×10^-1 или от приблизительно 1,0×10^-2 до приблизительно 1,0×10^-1 с. Пертурбации Т-клетки (например, поры или отверстия), создаваемые способами, описанными здесь, не образуются в результате сборки белковых субъединиц с образованием мультимерной пористой структуры, такой как структура, созданная комплементом или бактериальными гемолизинами.

[0186] Когда Т-клетка проходит через сужение, то сужение временно приводит к нарушению мембраны Т-клетки, что делает возможным пассивную диффузию вещества через пертурбацию. В некоторых вариантах осуществления Т-клетка деформируется только в течение короткого периода времени, порядка 100 мкс, чтобы минимизировать вероятность активации апоптотических путей посредством клеточных сигнальных механизмов, хотя возможны другие интервалы продолжительности (например, в диапазоне от наносекунд до часов). В некоторых вариантах осуществления Т-клетка деформируется в течение от приблизительно 1,0×10^-9 с до приблизительно 2 ч или в течение любого времени или в диапазоне времени между ними. В некоторых вариантах осуществления Т-клетка деформируется в течение от приблизительно 1,0×10^-9 с до приблизительно 1 с, от приблизительно 1 с до приблизительно 1 мин или от приблизительно 1 мин до приблизительно 1 ч. В некоторых вариантах осуществления Т-клетка деформируется в пределах от приблизительно 1,0×10^-9 до приблизительно 11,0×10^-1, от приблизительно 1,0×10^-9 до приблизительно 1,0×10^-2, от приблизительно 1,0×10^-9 до приблизительно 1,0×10^-3, от приблизительно 1,0×10^-9 до приблизительно 1,0×10^-4, от приблизительно 1,0×10^-9 до приблизительно 1,0×10^-5, от приблизительно 1,0×10^-9 до приблизительно 1,0×10^-6, от приблизительно 1,0×10^-9 до приблизительно 1,0×10^-7 или от приблизительно 1,0×10^-9 до приблизительно 1,0×10^-8 с. В некоторых вариантах осуществления Т-клетка деформируется в течение любого из значений времени от приблизительно 1,0×10^-8 до приблизительно 1,0×10^-1, от приблизительно 1,0×10^-7 до приблизительно 1,0×10^-1, от приблизительно 1,0×10^-6 до приблизительно 1,0×10^-1, от приблизительно 1,0×10^-5 до приблизительно 1,0×10^-1, от приблизительно 1,0×10^-4 до приблизительно 1,0×10^-1, от приблизительно 1,0×10^-3 до приблизительно 1,0×10^-1 или от приблизительно 1,0×10^-2 до приблизительно 1,0×10^-1 с. В некоторых вариантах осуществления деформация Т-клетки включает деформацию Т-клетки в течение времени в диапазоне, без ограничения, от приблизительно 1 мкс до, по меньшей мере, приблизительно 750 мкс, например, по меньшей мере, приблизительно 1 мкс, 10 мкс, 50 мкс, 100 мкс, 500 мкс или 750 мкс.

[0187] В некоторых вариантах осуществления изобретения проникновение антигена и/или адъюванта в Т-клетку происходит одновременно с прохождением Т-клетки через сужение и/или пертурбацией Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления прохождение соединения в Т-клетку происходит после того, как Т-клетка проходит через сужение. В некоторых вариантах осуществления изобретения проникновение соединения в Т-клетку происходит приблизительно через несколько минут после того, как Т-клетка проходит через сужение. В некоторых вариантах осуществления прохождение соединения в Т-клетку происходит в течение от приблизительно 1,0×10^-2 с, по меньшей мере, до приблизительно 30 мин после того, как Т-клетка проходит через сужение. Например, проникновение соединения в Т-клетку происходит в течение от приблизительно 1,0×10^-2 с до приблизительно 1 с, от приблизительно 1 с до приблизительно 1 мин или от приблизительно 1 мин до приблизительно 30 мин после того, как иммунная клетка проходит через сужение. В некоторых вариантах осуществления проникновение соединения в Т-клетку происходит в течение от приблизительно 1,0×10^-2 с до приблизительно 10 мин, от приблизительно 1,0×10^-2 с до приблизительно 5 мин, от приблизительно 1,0×10^-2 с до приблизительно 1 мин, от приблизительно 1,0×10^-2 с до приблизительно 50 с, от приблизительно 1,0×10^-2 с до приблизительно 30 с, от приблизительно 1,0×10^-2 с до приблизительно 10 с, от приблизительно 1,0×10^-2 с до приблизительно 1 с или от приблизительно 1,0×10^-2 с до приблизительно 0,1 с после того, как Т-клетка прошла через сужение. В некоторых вариантах осуществления изобретения проникновение соединения в Т-клетку происходит в течение от приблизительно 1,0×10^-1 с до приблизительно 10 мин, от приблизительно 1 с до приблизительно 10 мин, от приблизительно 10 с до приблизительно 10 мин, от приблизительно 50 с до приблизительно 10 мин, от приблизительно 1 мин до 10 мин или от приблизительно 5 мин до приблизительно 10 мин после того, как Т-клетка прошла через сужение. В некоторых вариантах осуществления пертурбация в Т-клетке после того, как она прошла через сужение, устраняется в пределах порядка пяти минут после того, как Т-клетка прошла через сужение.

[0188] В некоторых вариантах осуществления жизнеспособность клеток после прохождения через сужение составляет от приблизительно 5% до приблизительно 100%. В некоторых вариантах осуществления жизнеспособность клеток после прохождения через сужение составляет, по меньшей мере, приблизительно 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99%. В некоторых вариантах осуществления жизнеспособность клеток измеряется в течение от приблизительно 1,0×10^-2 с до, по меньшей мере, приблизительно 10 суток после того, как Т-клетка прошла через сужение. Например, жизнеспособность клеток измеряется в течение от приблизительно 1,0×10^-2 с до приблизительно 1 с, от приблизительно 1 с до приблизительно 1 мин, от приблизительно 1 мин до приблизительно 30 мин или от приблизительно 30 мин до приблизительно 2 ч после того, как Т-клетка прошла через сужение. В некоторых вариантах осуществления жизнеспособность клеток измеряется в течение от приблизительно 1,0×10^-2 с до приблизительно 2 ч, от приблизительно 1,0×10^-2 с до приблизительно 1 ч, от приблизительно 1,0×10^-2 с до приблизительно 30 мин, от приблизительно 1,0×10^-2 с до приблизительно 1 мин, от приблизительно 1,0×10^-2 с до приблизительно 30 с, от приблизительно 1,0×10^-2 с до приблизительно 1 с или от приблизительно 1,0×10^-2 с до приблизительно 0,1 с после того, как Т-клетка прошла через сужение. В некоторых вариантах осуществления жизнеспособность клеток измеряется в течение от приблизительно 1,5 ч до приблизительно 2 ч, от приблизительно 1 ч до приблизительно 2 ч, от приблизительно 30 мин до приблизительно 2 ч, от приблизительно 15 мин до приблизительно 2 ч, от приблизительно 1 мин до приблизительно 2 ч, от приблизительно 30 с до приблизительно 2 ч или от приблизительно 1 с до приблизительно 2 ч после того, как Т-клетка прошла через сужение. В некоторых вариантах осуществления жизнеспособность клеток измеряется в течение от приблизительно 2 ч до приблизительно 5 ч, от приблизительно 5 ч до приблизительно 12 ч, от приблизительно 12 ч до приблизительно 24 ч или от приблизительно 24 ч до приблизительно 10 суток после того, как Т-клетка прошла через сужение.

Параметры доставки

[0189] Ряд параметров может оказывать влияние на доставку соединения к Т-клетке для модуляции иммунного ответа способами, описанными здесь. В некоторых вариантах осуществления суспензия клеток контактирует с соединением до, одновременно или после прохождения через сужение. Т-клетка может проходить через сужение, будучи суспендированной в растворе, который включает доставляемое соединение, хотя соединение может быть добавлено к клеточной суспензии после того, как Т-клетки прошли через сужение. В некоторых вариантах осуществления доставляемое соединение находится в покрытии, нанесенном на сужение.

[0190] Примеры параметров, которые могут влиять на доставку соединения в Т-клетку, включают, помимо прочего, размеры сужения, угол входа в сужение, поверхностные свойства сужений (например, шероховатость, химическая модификация, гидрофильное, гидрофобное и т. д.), рабочие скорости потока (например, время прохождения клетки через сужение), концентрация Т-клеток, концентрация соединения в клеточной суспензии и время, в течение которого Т-клетка восстанавливается или инкубируется после прохождения через сужение, могут влиять на прохождение доставленного соединения в Т-клетку. Дополнительные параметры, влияющие на доставку соединения в Т-клетку, могут включать скорость прохождения Т-клетки в сужении, скорость сдвига в сужении, вязкость клеточной суспензии, компонент скорости, перпендикулярный скорости потока, и время нахождения в сужении. Такие параметры могут быть разработаны для контроля доставки соединения. В некоторых вариантах осуществления концентрация Т-клеток находится в диапазоне от приблизительно 10 до, по меньшей мере, приблизительно 10¹² клеток/мл или любая концентрация или диапазона концентраций между ними. В некоторых вариантах осуществления концентрации соединения для доставки могут находиться в диапазоне от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 1 г/мл или любая концентрация или диапазон концентраций между ними. В некоторых вариантах осуществления концентрации соединения для доставки могут находиться в диапазоне от приблизительно 1 пМ до, по меньшей мере, приблизительно 2 М или любая концентрация или диапазон концентраций между ними.

[0191] Температуру, используемую в способах по настоящему изобретению, можно регулировать, чтобы оказывать влияние на доставку соединения и жизнеспособность клеток. В некоторых вариантах осуществления способ проводят при температуре от приблизительно -5°C до приблизительно 45°C. Например, способы можно проводить при комнатной температуре (например, приблизительно 20°C), физиологической температуре (например, приблизительно 37°C), более высокой, чем физиологическая температура (например, выше, чем от приблизительно 37°С до 45°C или выше), или пониженной температуре (например, от приблизительно -5°C до приблизительно 4°C), или температуре между этими примерными температурами.

[0192] Для подачи Т-клеток для прохождения через сужения можно использовать различные методы. Например, давление может создаваться насосом на входной стороне (например, компрессором), вакуум может создаваться вакуумным насосом на выходной стороне, капиллярное действие может прилагаться через трубку и/или система может быть с гравитационной подачей. Также можно использовать проточные системы с вытеснением (например, шприцевой насос, перистальтический насос, ручной шприц или пипетка, поршни и т. д.). В некоторых вариантах осуществления Т-клетки проходят через сужения за счет создания положительного или отрицательного давления. В некоторых вариантах осуществления Т-клетки пропускают через сужения за счет создания постоянного или переменного давления. В некоторых вариантах осуществления давление создают с помощью шприца. В некоторых вариантах осуществления положительное давление создают с использованием газа (например, из газового баллона). В некоторых вариантах осуществления давление прикладывают с помощью насоса. В некоторых вариантах осуществления насос представляет перистальтический насос или диафрагменный насос. В некоторых вариантах осуществления давление создают с помощью вакуума. В некоторых вариантах осуществления иммунные клетки проходят через сужения за счет g-силы. В некоторых вариантах осуществления Т-клетки проходят через сужения за счет центробежной силы. В некоторых вариантах осуществления Т-клетки проходят через сужения под действием капиллярного давления.

[0193] В некоторых вариантах осуществления поток жидкости направляет Т-клетки через сужения. В некоторых вариантах осуществления поток жидкости представляет собой турбулентный поток до того, как Т-клетки проходят через сужение. Турбулентный поток представляет поток жидкости, скорость которого в данной точке неравномерно изменяется по величине и направлению. В некоторых вариантах осуществления поток жидкости через сужение является ламинарным. Ламинарный поток представляет собой непрерывный поток в жидкости вблизи твердой границы, где направление потока в каждой точке остается постоянным. В некоторых вариантах осуществления поток жидкости представляет собой турбулентный поток после того, как Т-клетки прошли через сужение. Скорость, с которой иммунные клетки проходят через сужения, можно варьировать. В некоторых вариантах осуществления Т-клетки проходят через сужения с постоянной скоростью. В некоторых вариантах осуществления Т-клетки проходят через сужения с переменной скоростью клеток.

[0194] В еще одних вариантах осуществления используется комбинированная обработка для модуляции иммунного ответа пропусканием клеточной суспензии, содержащей Т-клетку, через сужение, где сужение деформирует Т-клетку, что вызывает, тем самым, пертурбацию Т-клетки так, что антиген и/или адъювант проникает в Т-клетку, например, способами, описанными здесь, с последующим воздействием электрического поля ниже сужения. В некоторых вариантах осуществления Т-клетка проходит через электрическое поле, создаваемое, по меньшей мере, одним электродом после прохождения через сужение. В некоторых вариантах осуществления электрическое поле способствует доставке соединений во вторую область внутри Т-клетки, такую как ядро Т-клетки. Например, комбинация деформирующего клетки сужения и электрического поля доставляет плазмиду, кодирующую антитело, в Т-клетку (например, ядро клетки), что приводит к продукции антитела de novo. В некоторых вариантах осуществления один или несколько электродов находятся вблизи сужения, деформирующего клетку, для создания электрического поля. В некоторых вариантах осуществления электрическое поле составляет от приблизительно 0,1 кВ/м до приблизительно 100 МВ/м или любое число или диапазон чисел между ними. В некоторых вариантах осуществления используется интегральная схема для подачи электрического сигнала для возбуждения электродов. В некоторых вариантах осуществления Т-клетки подвергаются воздействию электрического поля в течение длительности импульса от приблизительно 1 нс до приблизительно 1 с и в течение периода от приблизительно 100 нс до приблизительно 10 с или любое время или диапазон времени между указанными значениями.

Клеточные суспензии для доставки в Т-клетки

[0195] Клеточная суспензия может представлять собой смешанную или очищенную популяцию Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления суспензия клеток представляет смешанную популяцию клеток, например цельную кровь или PBMC. В дополнительных вариантах осуществления смешанная популяция клеток представляет смесь определенных или очищенных популяций. В некоторых вариантах осуществления суспензия клеток представляет очищенную популяцию клеток, например очищенную популяцию Т-клеток.

[0196] Состав клеточной суспензии (например, осмолярность, концентрация соли, содержание сыворотки, титр клеток, pH и т. д.) может оказывать влияние на доставку соединения для модуляции иммунного ответа. В некоторых вариантах осуществления суспензия содержит цельную кровь. Альтернативно клеточная суспензия представляет собой смесь клеток в физиологическом растворе или физиологической среде, отличной от крови. В некоторых вариантах осуществления клеточная суспензия содержит водный раствор. В некоторых вариантах осуществления водный раствор содержит клеточную культуральную среду (забуференный фосфатом физиологический раствор) PBS, соли, ионы металлов, сахара, факторы роста, продукты животного происхождения, наполнители, поверхностно-активные вещества, смазывающие агенты, липиды, витамины, аминокислоты, белки, ингибиторы клеточного цикла и/или агент, влияющий на полимеризацию актина. В некоторых вариантах осуществления среда для культивирования клеток представляет X-VIVOTM 10, X-VIVOTM 15, DMEM, Opti-MEM®, IMDM или RPMI. Кроме того, буферный раствор может включать один или более смазывающих агентов (плюроники или другие поверхностно-активные вещества), которые могут быть разработаны, например, для снижения или устранения закупоривания сужения и повышения жизнеспособности клеток. Примеры поверхностно-активных веществ включают, без ограничения, полоксамер, полисорбаты, сахара или сахарные спирты, такие как маннит, сорбит, сыворотку животного и белок альбумин.

[0197] В некоторых конфигурациях с определенными типами Т-клеток, Т-клетки можно инкубировать в одном или нескольких растворах, которые способствуют доставке соединения внутрь Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления водный раствор содержит агент, влияющий на полимеризацию актина. В некоторых вариантах осуществления агент, влияющий на полимеризацию актина, представляет собой латрункулин A, цитохалазин и/или колхицин. Например, иммунные клетки можно инкубировать в растворе для деполимеризации, таком как раствор лантрункулина A (0,1 мкг/мл), в течение 1 ч перед доставкой для деполимеризации актинового цитоскелета. В качестве дополнительного примера, Т-клетки можно инкубировать в 10 мкМ растворе колхицина (Sigma) в течение 2 ч перед доставкой для деполимеризации сети микротрубочек.

[0198] В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток обогащают перед использованием в раскрытых способах. Например, клетки получают из жидкости организма, например периферической крови, и необязательно обогащают или очищают для концентрирования иммунных клеток. Клетки могут быть обогащены любыми способами, известными в данной области, включая, помимо прочего, магнитное разделение клеток, сортинг флуоресцентно-активированных клеток (FACS) или центрифугирование в градиенте плотности.

[0199] Вязкость клеточной суспензии также может оказывать влияние на способы, раскрытые здесь. В некоторых вариантах осуществления вязкость клеточной суспензии находится в диапазоне от приблизительно 8,9×10^-4 Па·с до приблизительно 4,0×10^-3 Па·с или любое значение или диапазон значений между ними. В некоторых вариантах осуществления вязкость находится в диапазоне от приблизительно 8,9×10^-4 Па·с до приблизительно 4,0×10^-3 Па·с или любое значение или диапазон значений между ними. В некоторых вариантах вязкость находится в диапазоне от приблизительно 8,9×10^-4 Па·с до приблизительно 4,0×10^-3 Па·с, от приблизительно 8,9×10^-4 Па·с до приблизительно 3,0×10^-3 Па·с, от приблизительно 8,9×10^-4 Па·с до приблизительно 2,0×10^-3 Па·с или от приблизительно 8,9×10^-3 Па·с до приблизительно 1,0×10^-3 Па·с. В некоторых вариантах осуществления вязкость находится в диапазоне от приблизительно 0,89 сП до приблизительно 4,0 сП, от приблизительно 0,89 сП до приблизительно 3,0 сП, от приблизительно 0,89 сП до приблизительно 2,0 сП или от приблизительно 0,89 сП до приблизительно 1,0 сП. В некоторых вариантах осуществления наблюдается истончение сдвига, при котором вязкость клеточной суспензии уменьшается в условиях деформации сдвига. Вязкость можно измерить любым методом, известным в данной области техники, включая, помимо прочего, вискозиметры, такие как стеклянный капиллярный вискозиметр, или реометры. Вискозиметр измеряет вязкость при одном условии потока, в то время как реометр используется для измерения вязкости, которая изменяется в зависимости от условий потока. В некоторых вариантах осуществления вязкость измеряется для жидкости с истончением сдвига, такой как кровь. В некоторых вариантах осуществления вязкость измеряется при температуре в диапазоне от приблизительно -5°C до приблизительно 45°C. Например, вязкость измеряется при комнатной температуре (например, приблизительно 20°C), физиологической температуре (например, приблизительно 37°C), при температуре выше, чем физиологическая температура (например, от приблизительно 37°C до 45°C или выше), пониженной температуре (например, от приблизительно -5°C до приблизительно 4°C) или при температуре между этими примерными значениями температуры.

Системы и наборы

[0200] В некоторых аспектах изобретение обеспечивает систему, содержащую один или более компонентов в сужении, суспензии Т-клеток, антигены или адъюванты для применения в способах, раскрытых здесь. Система может включать любой вариант осуществления, описанный для композиций и способов, раскрытых выше, включая описанные выше в разделе «Микрофлюидные системы и их компоненты». В некоторых вариантах осуществления деформирующие клетку сужения по размеру рассчитаны на доставку в Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления параметры доставки, такие как рабочие скорости потока, концентрация клеток и соединений, температура, скорость клетки в сужении и состав клеточной суспензии (например, осмолярность, концентрация соли, содержание сыворотки, концентрация клеток, pH, и т.д.) оптимизированы для максимального ответа соединения для модуляции иммунного ответа.

[0201] Также обеспечиваются наборы или промышленные изделия для применения в модуляции иммунного ответа у субъекта. В некоторых вариантах осуществления набор включает модифицированную Т-клетку, содержащую антиген и адъювант. В некоторых вариантах осуществления набор включает одно или более из сужения, суспензии Т-клеток, антигенов или адъювантов для применения в создании модифицированных Т-клеток для применения в модуляции иммунного ответа у субъекта. В некоторых вариантах осуществления наборы включают компоненты, описанные здесь (например, микрофлюидный канал или поверхность, содержащую поры, клеточные суспензии и/или соединения) в подходящей упаковке. Подходящие упаковочные материалы известны в данной области и включают, например, флаконы (такие как герметичные флаконы), сосуды, ампулы, бутыли, банки, гибкую упаковку (например, герметичные майларовые или пластиковые пакеты) и тому подобное. Данные промышленные изделия можно дополнительно стерилизовать и/или герметично закрыть.

[0202] Изобретение также обеспечивает наборы, включающие компоненты способов, описанных здесь, и они могут дополнительно содержать инструкции по осуществлению указанных способов для модуляции иммунного ответа у субъекта и/или инструкции по введению антигена и/или адъюванта в Т-клетку. Наборы, описанные здесь, могут дополнительно включать другие материалы, включая буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и вкладыши с инструкциями по выполнению любого из описанных здесь способов; например, инструкции по модуляции иммунного ответа у субъекта или инструкции по модификации Т-клетки для включения антигена и/или адъюванта.

Примерные варианты осуществления

[0203] Вариант осуществления 1. Модифицированная Т-клетка, содержащая антиген и адъювант, где антиген является экзогенным по отношению к модифицированной Т-клетке и содержит иммуногенный эпитоп, и где адъювант находится внутриклеточно.

[0204] Вариант осуществления 2. Модифицированная Т-клетка, содержащая антиген, содержащий аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 18-25.

[0205] Вариант осуществления 3. Модифицированная Т-клетка, содержащая антиген и адъювант, где антиген содержит иммуногенный эпитоп, полученный способом, включающим стадии: а) пропускание клеточной суспензии, содержащей входную Т-клетку, через деформирующее клетку сужение, где диаметр сужения является функцией диаметра входной Т-клетки в суспензии, что вызывает, тем самым, пертурбации входной Т-клетки, достаточно большие для того, чтобы антиген и адъювант прошли через них, с образованием пертурбированной входной Т-клетки; и b) инкубирование пертурбированной входной Т-клетки с антигеном и адъювантом в течение достаточного периода времени для обеспечения проникновения антигена и адъюванта в пертурбированную входную Т-клетку; с получением, тем самым, модифицированной T-клетки, содержащей антиген и адъювант.

[0206] Вариант осуществления 4. Модифицированная Т-клетка согласно варианту 3, где концентрация антигена, инкубированного с пертурбированной входной Т-клеткой, составляет от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 1 мМ, и/или концентрация адъюванта, инкубированного с пертурбированной входной Т-клеткой, составляет от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 1 мМ.

[0207] Вариант осуществления 5. Модифицированная Т-клетка согласно варианту осуществления 3 или 4, где соотношение антигена и адъюванта, инкубированных с пертурбированной входной Т-клеткой, составляет от приблизительно 10000:1 до приблизительно 1:10000.

[0208] Вариант осуществления 6. Модифицированная Т-клетка, содержащая антиген и адъювант, где антиген содержит иммуногенный эпитоп, полученный способом, включающим стадии: а) пропускание клеточной суспензии, содержащей входную Т-клетку, содержащую адъювант, через деформирующее клетку сужение, где диаметр сужения является функцией диаметра входной Т-клетки в суспензии, что вызывает, тем самым, пертурбации входной Т-клетки, достаточно большие для того, чтобы антиген прошел через них, с образованием пертурбированной входной Т-клетки; и b) инкубирование пертурбированной входной Т-клетки с антигеном в течение достаточного периода времени для обеспечения проникновения антигена в пертурбированную входную Т-клетку; с получением, тем самым, модифицированной T-клетки, содержащей антиген и адъювант.

[0209] Вариант осуществления 7. Модифицированная Т-клетка согласно варианту осуществления 6, где концентрация антигена, инкубированного с пертурбированной входной Т-клеткой, составляет от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 1 мМ.

[0210] Вариант осуществления 8. Модифицированная Т-клетка, содержащая антиген и адъювант, где антиген содержит иммуногенный эпитоп, полученный способом, включающим стадии: а) пропускание клеточной суспензии, содержащей входную Т-клетку, содержащую антиген, через деформирующее клетку сужение, где диаметр сужения является функцией диаметра входной Т-клетки в суспензии, что вызывает, тем самым, пертурбации входной Т-клетки, достаточно большие для того, чтобы адъювант прошел через них, с образованием пертурбированной входной Т-клетки; и b) инкубирование пертурбированной входной Т-клетки с адъювантом в течение достаточного периода времени для обеспечения проникновения адъюванта в пертурбированную входную Т-клетку; с получением, тем самым, модифицированной T-клетки, содержащей антиген и адъювант.

[0211] Вариант осуществления 9. Модифицированная Т-клетка согласно варианту осуществления 8, где концентрация адъюванта, инкубированного с пертурбированной входной Т-клеткой, составляет от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 1 мМ.

[0212] Вариант осуществления 10. Модифицированная Т-клетка согласно любому из вариантов осуществления 3-9, где к входной Т-клетке прикладывается деформирующая сила, когда она проходит через сужение, что вызывает, тем самым, пертурбации входной Т-клетки.

[0213] Вариант осуществления 11. Модифицированная Т-клетка согласно любому из вариантов осуществления 3-10, где способ дополнительно включает стадию инкубирования входной Т-клетки и/или модифицированной Т-клетки с агентом, который повышает жизнеспособность и/или функцию модифицированной Т-клетки по сравнению с соответствующей модифицированной Т-клеткой, полученной без дополнительной стадии инкубирования.

[0214] Вариант осуществления 12. Модифицированная Т-клетка согласно варианту осуществления 11, где агент представляет соединение, которое усиливает эндоцитоз или функционирует в качестве стабилизирующего агента или кофактора.

[0215] Вариант осуществления 13. Модифицированная Т-клетка согласно любому из вариантов осуществления 3-12, где диаметр сужения меньше диаметра входной Т-клетки.

[0216] Вариант осуществления 14. Модифицированная Т-клетка согласно варианту осуществления 13, где диаметр сужения составляет от приблизительно 20% до приблизительно 99% от диаметра входной Т-клетки.

[0217] Вариант осуществления 15. Модифицированная Т-клетка по варианту осуществления 14, где диаметр сужения составляет от приблизительно 20% до приблизительно 60% от диаметра входной Т-клетки.

[0218] Вариант осуществления 16. Модифицированная Т-клетка согласно любому из вариантов осуществления 1-15, где антиген и/или адъювант находится в цитозоле и/или везикуле модифицированной Т-клетки.

[0219] Вариант осуществления 17. Модифицированная Т-клетка согласно любому из вариантов осуществления 1-16, где везикула представляет эндосому.

[0220] Вариант осуществления 18. Модифицированная Т-клетка согласно любому из вариантов осуществления 1-17, где антиген и/или адъювант находятся во многих компартментах модифицированной Т-клетки.

[0221] Вариант осуществления 19. Модифицированная Т-клетка согласно любому из вариантов осуществления 1-18, где антиген или иммуногенный эпитоп связывается с поверхностью модифицированной Т-клетки.

[0222] Вариант осуществления 20. Модифицированная Т-клетка согласно любому из вариантов осуществления 1-19, где адъювант представляет CpG-олигодезоксинуклеотид (ODN), IFN-α, агонисты STING, агонисты RIG-I, поли I:C, имиквимод, резиквимод или липополисахарид (LPS).

[0223] Вариант осуществления 21. Модифицированная Т-клетка согласно варианту осуществления 20, где адъювант представляет CpG ODN.

[0224] Вариант осуществления 22. Модифицированная Т-клетка согласно варианту осуществления 21, где CpG ODN представляет CpG ODN класса A, CpG ODN класса B или CpG ODN класса C.

[0225] Вариант осуществления 23. Модифицированная Т-клетка согласно любому из вариантов осуществления 1-22, где иммуногенный эпитоп происходит из антигена, ассоциированного с заболеванием.

[0226] Вариант осуществления 24. Модифицированная Т-клетка согласно варианту осуществления 23, где иммуногенный эпитоп происходит из пептидов или мРНК, выделенных из патологической клетки.

[0227] Вариант осуществления 25. Модифицированная Т-клетка согласно любому из вариантов осуществления 1-24, где иммуногенный эпитоп происходит из чужеродного антигена.

[0228] Вариант осуществления 26. Модифицированная Т-клетка согласно любому из вариантов осуществления изобретения 1-25, где иммуногенный эпитоп происходит из опухолевого антигена, вирусного антигена, бактериального антигена или грибкового антигена.

[0229] Вариант осуществления 27. Модифицированная Т-клетка согласно варианту осуществления 26, где иммуногенный эпитоп происходит из антигена вируса папилломы человека (ВПЧ).

[0230] Вариант осуществления 28. Модифицированная Т-клетка согласно варианту осуществления 27, где ВПЧ представляет ВПЧ-16 или ВПЧ-18.

[0231] Вариант осуществления 29. Модифицированная Т-клетка согласно варианту осуществления 27 или 28, где антиген включает HLA-A2-рестриктированный пептид, полученный из ВПЧ E6 и/или E7.

[0232] Вариант осуществления 30. Модифицированная Т-клетка согласно варианту осуществления 29, где HLA-A2-рестриктированный пептид содержит аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 1-4.

[0233] Вариант осуществления 31. Модифицированная Т-клетка согласно варианту осуществления 30, где антиген содержит аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 18-25.

[0234] Вариант осуществления 32. Модифицированная Т-клетка согласно любому из вариантов осуществления 1-30, где модифицированная Т-клетка содержит множество антигенов, которые содержат множество иммуногенных эпитопов.

[0235] Вариант осуществления 33. Модифицированная Т-клетка согласно варианту осуществления 32, где после введения субъекту модифицированной Т-клетки, содержащей множество антигенов, которые содержат множество иммуногенных эпитопов, ни один из множества иммуногенных эпитопов не снижает иммунный ответ у субъекта к любому из других иммуногенных эпитопов.

[0236] Вариант осуществления 34. Модифицированная Т-клетка согласно любому из вариантов осуществления 1-33, где антиген представляет полипептид, и иммуногенный эпитоп представляет иммуногенный пептидный эпитоп.

[0237] Вариант осуществления 35. Модифицированная Т-клетка согласно варианту осуществления 30, где иммуногенный пептидный эпитоп слит с N-концевым фланкирующим полипептидом и/или C-концевым фланкирующим полипептидом.

[0238] Вариант осуществления 36. Модифицированная Т-клетка согласно варианту осуществления 30, где антиген представляет полипептид, содержащий иммуногенный пептидный эпитоп и одну или более гетерологичных пептидных последовательностей.

[0239] Вариант осуществления 37. Модифицированная Т-клетка согласно варианту осуществления 34, где антиген представляет полипептид, содержащий иммуногенный пептидный эпитоп, фланкированный на N-конце и/или C-конце гетерологичными пептидными последовательностями.

[0240] Вариант осуществления 38. Модифицированная Т-клетка согласно варианту осуществления 35, где фланкирующие гетерологичные пептидные последовательности происходят из иммуногенных пептидов, ассоциированных с заболеванием.

[0241] Вариант осуществления 39. Модифицированная Т-клетка согласно варианту осуществления 35, где N-концевой фланкирующий полипептид содержит аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 5-10 и/или C-концевой фланкирующий полипептид содержит аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 11-17.

[0242] Вариант осуществления 40. Модифицированная Т-клетка по любому из вариантов осуществления 1-39, где антиген способен процессироваться в пептид, рестриктированный классом I MHC, и/или пептид, рестриктированный классом II MHC.

[0243] Вариант осуществления 41. Модифицированная Т-клетка согласно любому из вариантов осуществления 1-40, где модифицированная Т-клетка содержит адъювант в концентрации от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 1 мМ.

[0244] Вариант осуществления 42. Модифицированная Т-клетка по любому из вариантов осуществления 1-41, где модифицированная Т-клетка содержит антиген в концентрации от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 1 мМ.

[245] Вариант осуществления 43. Модифицированная Т-клетка согласно любому из вариантов осуществления 1-42, где соотношение антигена и адъюванта составляет от приблизительно 10000:1 до приблизительно 1:10000.

[0246] Вариант осуществления 44. Модифицированная Т-клетка по любому из вариантов осуществления 1-43, где модифицированная Т-клетка включает комплекс, содержащий: а) антиген, b) антиген и, по меньшей мере, один другой антиген, и/или c) антиген и адъювант.

[0247] Вариант осуществления 45. Модифицированная Т-клетка согласно любому из вариантов осуществления 1-44, где модифицированная Т-клетка дополнительно содержит агент, который повышает жизнеспособность и/или функцию модифицированной Т-клетки по сравнению с соответствующей модифицированной Т-клеткой, которая не содержит агента.

[0248] Вариант осуществления 46. Модифицированная Т-клетка согласно варианту осуществления 45, где агент представляет соединение, усиливающее эндоцитоз, стабилизирующий агент или кофактор.

[0249] Вариант осуществления 47. Модифицированная Т-клетка согласно варианту осуществления 45, где агент представляет альбумин.

[0250] Вариант осуществления 48. Модифицированная Т-клетка согласно варианту осуществления 47, где альбумин представляет мышиный, бычий или человеческий альбумин.

[0251] Вариант осуществления 49. Модифицированная Т-клетка согласно варианту осуществления 45, где агент представляет катион двухвалентного металла, глюкозу, АТФ, калий, глицерин, трегалозу, D-сахарозу, PEG1500, L-аргинин, L-глутамин или ЭДТА.

[0252] Вариант осуществления 50. Модифицированная Т-клетка согласно варианту осуществления 49, где агент включает сывороточный альбумин мыши (MSA).

[0253] Вариант осуществления 51. Модифицированная Т-клетка по любому из вариантов осуществления 1-50, где клетки дополнительно модифицированы для увеличения экспрессии одной или более костимулирующих молекул.

[0254] Вариант осуществления 52. Модифицированная Т-клетка согласно варианту осуществления 51, где костимулирующая молекула представляет B7-H2(ICOSL), B7-1(CD80), B7-2 (CD86), CD70, LIGHT, HVEM, CD40, 4-1BBL, OX40L, TL1A, GITRL, CD30L, TIM4, SLAM, CD48, CD58, CD155 или CD112.

[0255] Вариант осуществления 53. Модифицированная Т-клетка согласно вариантам осуществления 51 или 52, где клетка содержит нуклеиновую кислоту, которая приводит к повышенной экспрессии одной или более костимулирующих молекул.

[0256] Вариант осуществления 54. Модифицированная Т-клетка по любому из вариантов осуществления 1-53, где модифицированная Т-клетка содержит дополнительную модификацию для модуляции экспрессии молекул MHC класса I.

[0257] Вариант осуществления 55. Модифицированная Т-клетка согласно любому из вариантов осуществления 1-54, где модифицированная Т-клетка содержит дополнительную модификацию для модуляции экспрессии молекул MHC класса II.

[0258] Вариант осуществления 56. Модифицированная Т-клетка согласно варианту осуществления 54, где в аллогенном контексте врожденный иммунный ответ, развившийся у субъекта в ответ на введение модифицированных Т-клеток, снижен, в аллогенном контексте, по сравнению с врожденным иммунным ответом, развившимся у субъекта в ответ на введение соответствующих модифицированных Т-клеток, которые не содержат дополнительную модификацию.

[0259] Вариант осуществления 57. Модифицированная Т-клетка согласно варианту осуществления 54 или 56, где период полужизни в кровотоке модифицированных Т-клеток у субъекта, которому они были введены, увеличивается по сравнению с периодом полужизни в кровотоке соответствующих модифицированных Т-клеток, которые не включают дополнительную модификацию, у субъекта, которому они были введены.

[0260] Вариант осуществления 58. Модифицированная Т-клетка по любому из вариантов осуществления 1-57, где модифицированная Т-клетка включает одно или более из Т-хелперных, цитотоксических Т-клеток, Т-клеток памяти или естественных Т-клеток-киллеров.

[0261] Вариант осуществления 59. Модифицированная Т-клетка согласно любому из вариантов осуществления 1-58, где модифицированная Т-клетка включает одно или более из CD3+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток, CD45RA+ Т-клеток, CD45RO+ Т-клеток или γδ-Т-клеток.

[0262] Вариант осуществления 60. Композиция, содержащая модифицированные Т-клетки по любому из вариантов 1-59.

Вариант осуществления 61. Фармацевтическая композиция, содержащая модифицированные Т-клетки по любому из вариантов 1-59 и фармацевтически приемлемый носитель.

[0263] Вариант осуществления 62. Способ модуляции иммунного ответа у субъекта, включающий введение субъекту модифицированных Т-клеток согласно любому из вариантов осуществления 1-59, композиции согласно варианту осуществления 60 или фармацевтической композиции согласно варианту осуществления 61.

[0264] Вариант осуществления 63. Способ модуляции иммунного ответа у субъекта, включающий: a) введение субъекту модифицированной Т-клетки, включающей антиген, содержащий аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 18-25; и b) введение субъекту адъюванта.

[0265] Вариант осуществления 64. Способ модуляции иммунного ответа у субъекта, включающий: а) пропускание клеточной суспензии, содержащей входную Т-клетку, через деформирующее клетку сужение, где диаметр сужения является функцией диаметра входной Т-клетки в суспензии, что вызывает, тем самым, пертурбации входной Т-клетки, достаточно большие для того, чтобы антиген и адъювант прошли через них, с образованием пертурбированной входной Т-клетки; b) инкубирование пертурбированной входной Т-клетки с антигеном и адъювантом в течение достаточного периода времени для обеспечения проникновения антигена и адъюванта в пертурбированную входную Т-клетку, где антиген содержит иммуногенный эпитоп; с получением, тем самым, модифицированной T-клетки, содержащей антиген и адъювант; и с) введение субъекту модифицированной Т-клетки.

[0266] Вариант осуществления 65. Способ согласно варианту осуществления 64, где концентрация антигена, инкубированного с пертурбированной входной Т-клеткой, составляет от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 1 мМ, и/или концентрация адъюванта, инкубированного с пертурбированной входной Т-клеткой, составляет от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 1 мМ.

[0267] Вариант осуществления 66. Способ согласно варианту осуществления 64 или 65, где соотношение антигена и адъюванта, инкубированных с пертурбированной входной Т-клеткой, составляет от приблизительно 10000:1 до приблизительно 1:10000.

[0268] Вариант осуществления 67. Способ модуляции иммунного ответа у субъекта, включающий: а) пропускание клеточной суспензии, содержащей входную Т-клетку, содержащую адъювант, через деформирующее клетку сужение, где диаметр сужения является функцией диаметра входной Т-клетки в суспензии, что вызывает, тем самым, пертурбации входной Т-клетки, достаточно большие для того, чтобы антиген прошел через них, с образованием пертурбированной входной Т-клетки, где антиген содержит иммуногенный эпитоп; b) инкубирование пертурбированной входной Т-клетки с антигеном в течение достаточного периода времени для обеспечения проникновения антигена в пертурбированную входную Т-клетку; с получением, тем самым, модифицированной T-клетки, содержащей антиген и адъювант; и с) введение субъекту модифицированной Т-клетки.

[0269] Вариант осуществления 68. Способ согласно варианту осуществления 67, где концентрация антигена, инкубированного с пертурбированной входной Т-клеткой, составляет от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 1 мМ.

[0270] Вариант осуществления 69. Способ модуляции иммунного ответа у субъекта, включающий: а) пропускание клеточной суспензии, содержащей входную Т-клетку, содержащую антиген, через деформирующее клетку сужение, где антиген содержит иммуногенный эпитоп, где диаметр сужения является функцией диаметра входной Т-клетки в суспензии, что вызывает, тем самым, пертурбации входной Т-клетки, достаточно большие для того, чтобы адъювант прошел через них, с образованием пертурбированной входной Т-клетки; b) инкубирование пертурбированной входной Т-клетки с адъювантом в течение достаточного периода времени для обеспечения проникновения адъюванта в пертурбированную входную Т-клетку; с получением, тем самым, модифицированной T-клетки, содержащей антиген и адъювант; и с) введение субъекту модифицированной Т-клетки.

[0271] Вариант осуществления 70. Способ согласно варианту осуществления 69, где концентрация адъюванта, инкубированного с пертурбированной входной Т-клеткой, составляет от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 1 мМ.

[0272] Вариант осуществления 71. Способ согласно любому из вариантов осуществления 64-70, где модифицированная Т-клетка содержит антиген в концентрации от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 1 мМ.

[0273] Вариант осуществления 72. Способ согласно любому из вариантов воплощения 64-71, где модифицированная Т-клетка содержит адъювант в концентрации от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 1 мМ.

[0274] Вариант осуществления 73. Способ согласно любому из вариантов осуществления 64-72, где соотношение антигена и адъюванта в модифицированной Т-клетке составляет от приблизительно 10000:1 до приблизительно 1:10000.

[0275] Вариант осуществления 74. Способ согласно любому из вариантов осуществления 64-73, где модифицированная Т-клетка включает комплекс, содержащий: а) антиген, b) антиген и, по меньшей мере, один другой антиген, и/или c) антиген и адъювант.

[0276] Вариант 75. Способ модуляции иммунного ответа у субъекта, включающий: а) пропускание клеточной суспензии, содержащей входную Т-клетку, через деформирующее клетку сужение, где диаметр сужения является функцией диаметра входной Т-клетки в суспензии, что вызывает, тем самым, пертурбации входной Т-клетки, достаточно большие для того, чтобы антиген прошел через них, с образованием пертурбированной входной Т-клетки, где антиген содержит иммуногенный эпитоп; b) инкубирование пертурбированной входной Т-клетки с антигеном в течение достаточного периода времени для обеспечения проникновения антигена в пертурбированную входную Т-клетку; с получением, тем самым, модифицированной T-клетки, содержащей антиген и адъювант; и с) введение субъекту модифицированной Т-клетки; и d) введение субъекту адъюванта.

[0277] Вариант осуществления 76. Способ согласно варианту осуществления 75, где концентрация антигена, инкубированного с пертурбированной входной Т-клеткой, составляет от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 1 мМ.

[0278] Вариант осуществления 77. Способ согласно любому из вариантов осуществления 64-76, где к входной Т-клетке прикладывается деформирующая сила, когда она проходит через сужение, что вызывает тем самым пертурбации входной Т-клетки.

[0279] Вариант осуществления 78. Способ согласно любому из вариантов осуществления 64-77, дополнительно содержащий стадию инкубирования входной Т-клетки и/или модифицированной Т-клетки с агентом, который повышает жизнеспособность и/или функцию модифицированной Т-клетки по сравнению с соответствующей модифицированной Т-клеткой, полученной без дополнительной стадии инкубирования.

[0280] Вариант осуществления 79. Способ согласно варианту осуществления 78, где агент представляет соединение, усиливающее эндоцитоз, стабилизирующий агент или кофактор.

[0281] Вариант осуществления 80. Способ согласно любому из вариантов осуществления 64-79, где иммунный ответ усиливается.

[0282] Вариант осуществления изобретения 81. Способ согласно варианту осуществления 80, где усиленный иммунный ответ направлен на антиген.

[0283] Вариант 82. Способ согласно любому из вариантов 64-81, где диаметр сужения меньше диаметра входной Т-клетки.

[0284] Вариант осуществления 83. Способ согласно варианту 82, где диаметр сужения составляет от приблизительно 20% до приблизительно 99% от диаметра входной Т-клетки.

[0285] Вариант осуществления 84. Способ согласно варианту осуществления 83, где диаметр сужения составляет от приблизительно 20% до приблизительно 60% от диаметра входной Т-клетки.

[0286] Вариант осуществления 85. Способ согласно любому из вариантов осуществления 64-84, где антиген и/или адъювант находятся в цитозоле и/или везикуле модифицированной Т-клетки.

[0287] Вариант осуществления 86. Способ согласно любому из вариантов осуществления 64-85, где везикула представляет эндосому.

[0288] Вариант осуществления 87. Способ согласно любому из вариантов осуществления 64-86, где антиген и/или адъювант находятся во многих компартментах модифицированной Т-клетки.

[0289] Вариант осуществления 88. Способ согласно любому из вариантов осуществления 64-87, где антиген или иммуногенный эпитоп связывается с поверхностью модифицированной Т-клетки.

[0290] Вариант осуществления 89. Способ согласно любому из вариантов осуществления 64-88, где адъювант представляет CpG ODN, IFN-α, агонисты STING, агонисты RIG-I, поли I:C, имиквимод, резиквимод и/или липополисахарид (LPS).

[0291] Вариант осуществления 90. Способ согласно варианту осуществления 89, где адъювант представляет CpG ODN.

[0292] Вариант осуществления 91. Способ согласно варианту осуществления 90, где CpG ODN представляет CpG ODN класса A, CpG ODN класса B или CpG ODN класса C.

[0293] Вариант осуществления 92. Способ согласно любому из вариантов осуществления 64-91, где иммуногенный эпитоп происходит из антигена, ассоциированного с заболеванием.

[0294] Вариант осуществления 93. Способ согласно варианту осуществления 92, где иммуногенный эпитоп происходит из пептидов или мРНК, выделенных из патологической клетки.

[0295] Вариант осуществления 94. Способ согласно любому из вариантов осуществления 64-93, где иммуногенный эпитоп происходит из чужеродного антигена.

[0296] Вариант осуществления 95. Способ согласно любому из вариантов осуществления 64-94, где иммуногенный эпитоп происходит из опухолевого антигена, вирусного антигена, бактериального антигена или грибкового антигена.

[0297] Вариант осуществления изобретения 96. Способ согласно варианту осуществления изобретения 95, где иммуногенный эпитоп происходит из антигена вируса папилломы человека (ВПЧ).

[0298] Вариант осуществления 97. Способ согласно варианту осуществления 96, где ВПЧ представляет ВПЧ-16 или ВПЧ-18.

[0299] Вариант осуществления 98. Способ согласно варианту осуществления 96 или 97, где антиген включает HLA-A2-рестриктированный пептид, полученный из ВПЧ E6 и/или E7.

[0300] Вариант осуществления 99. Способ согласно варианту осуществления 98, где HLA-A2-рестриктированный пептид содержит аминокислотную последовательность из любой из SEQ ID NO: 1-4.

[0301] Вариант осуществления 100. Способ согласно варианту осуществления 99, где антиген содержит аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 18-25.

[0302] Вариант осуществления 101. Способ согласно любому из вариантов осуществления 64-100, где модифицированная Т-клетка содержит множество антигенов, которые содержат множество иммуногенных эпитопов.

[0303] Вариант осуществления 102. Способ согласно варианту осуществления 64-101, где ни один из множества иммуногенных эпитопов не снижает иммунный ответ у субъекта на любой из других иммуногенных эпитопов.

[0304] Вариант осуществления 103. Способ согласно любому из вариантов осуществления 64-102, где антиген представляет полипептид, и иммуногенный эпитоп представляет иммуногенный пептидный эпитоп.

[0305] Вариант осуществления 104. Способ согласно варианту осуществления 103, где иммуногенный пептидный эпитоп слит с N-концевым фланкирующим полипептидом и/или C-концевым фланкирующим полипептидом.

[0306] Вариант осуществления 105. Модифицированная Т-клетка согласно варианту осуществления 104, где иммуногенный пептидный эпитоп, слитый с N-концевым фланкирующим полипептидом и/или C-концевым фланкирующим полипептидом, представляет не встречающуюся в природе последовательность.

[0307] Вариант осуществления изобретения 106. Способ согласно варианту осуществления изобретения 105, где N-концевые и/или C-концевые фланкирующие полипептиды происходят из иммуногенного синтетического длинного пептида (SLP).

[0308] Вариант осуществления 107. Способ согласно варианту осуществления 105, где N-концевые и/или C-концевые фланкирующие полипептиды происходят из иммуногенного SLP, ассоциированного с заболеванием.

[0309] Вариант осуществления 108. Способ согласно варианту осуществления 105, где N-концевой фланкирующий полипептид содержит аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 5-10, и/или С-концевой фланкирующий полипептид содержит аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 11-17.

[0310] Вариант осуществления 109. Способ согласно любому из вариантов осуществления 64-108, где антиген способен процессироваться в пептид, рестриктированный классом I MHC, и/или пептид, рестриктированный классом II MHC.

[0311] Вариант осуществления 110. Способ согласно любому из вариантов осуществления 64-109, где модифицированная Т-клетка дополнительно содержит агент, который повышает жизнеспособность и/или функцию модифицированной Т-клетки по сравнению с соответствующей модифицированной Т-клеткой, которая не содержат агента.

[0312] Вариант осуществления 111. Модифицированная Т-клетка согласно варианту осуществления 110, где агент представляет соединение, усиливающее эндоцитоз, стабилизирующий агент или кофактор.

[0313] Вариант осуществления 112. Модифицированная Т-клетка согласно варианту осуществления 111, где агент представляет альбумин.

[0314] Вариант осуществления 113. Модифицированная Т-клетка согласно варианту осуществления 112, где альбумин представляет мышиный, бычий или человеческий альбумин.

[0315] Вариант осуществления 114. Модифицированная Т-клетка согласно варианту осуществления 110, где агент представляет катион двухвалентного металла, глюкозу, АТФ, калий, глицерин, трегалозу, D-сахарозу, PEG1500, L-аргинин, L-глутамин или ЭДТА.

[0316] Вариант осуществления 115. Способ согласно любому из вариантов осуществления 64-114, где модифицированная Т-клетка содержит дополнительную модификацию для модуляции экспрессии молекул MHC класса I.

[0317] Вариант осуществления 116. Способ согласно любому из вариантов осуществления 64-115, где модифицированная Т-клетка содержит дополнительную модификацию для модуляции экспрессии молекул MHC класса II.

[0318] Вариант осуществления 117. Способ согласно варианту осуществления 115, где в аллогенном контексте врожденный иммунный ответ, развившийся у субъекта в ответ на введение модифицированных Т-клеток, снижен, в аллогенном контексте, по сравнению с врожденным иммунным ответом, развившимся у субъекта в ответ на введение соответствующих модифицированных Т-клеток, которые не содержат дополнительную модификацию.

[0319] Вариант осуществления 118. Способ согласно варианту осуществления 115 или 117, где период полужизни в кровотоке модифицированных Т-клеток у субъекта, которому они были введены, увеличивается по сравнению с периодом полужизни в кровотоке соответствующих модифицированных Т-клеток, которые не включают дополнительную модификацию у субъекта, которому они были введены.

[0320] Вариант осуществления 119. Способ согласно любому из вариантов осуществления 64-118, где модифицированная Т-клетка включает одно или более из Т-хелперов, цитотоксических Т-клеток, Т-клеток памяти или естественных Т-клеток-киллеров.

[0321] Вариант осуществления 120. Способ согласно любому из вариантов осуществления 64-119, где модифицированная Т-клетка включает одно или более из CD3+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток, CD45RA+ Т-клеток, CD45RO+ Т-клеток или γδ-Т клеток.

[0322] Вариант осуществления 121. Способ по любому из вариантов осуществления 64-120, где модифицированная Т-клетка является аллогенной для субъекта.

[0323] Вариант 122. Способ по любому из вариантов 64-121, где модифицированная Т-клетка является аутологичной для субъекта.

[0324] Вариант осуществления 123. Способ согласно любому из вариантов осуществления 64-122, где субъект предварительно кондиционирован для модуляции воспаления и/или иммунного ответа.

[0325] Вариант осуществления 124. Способ согласно любому из вариантов осуществления 64-123, дополнительно включающий введение субъекту второго адъюванта.

[0326] Вариант 125. Способ согласно варианту 124, где второй адъювант представляет IFN-α, LPS или CpG ODN.

[0327] Вариант осуществления 126. Способ согласно варианту осуществления 124 или 125, где модифицированную Т-клетку и второй адъювант вводят вместе или одновременно.

[0328] Вариант осуществления 127. Способ согласно варианту воплощения 124 или 125, где модифицированную Т-клетку и второй адъювант вводят последовательно.

[0329] Вариант осуществления 128. Способ согласно вариантам осуществления 124-127, где модифицированную Т-клетку вводят до введения второго адъюванта.

[0330] Вариант осуществления 129. Способ согласно вариантам осуществления 124-128, где модифицированную Т-клетку вводят после введения второго адъюванта.

[0331] Вариант осуществления 130. Способ согласно вариантам осуществления 64-129, где модифицированную Т-клетку вводят до, одновременно или после введения ингибитора иммунных контрольных точек.

[0332] Вариант осуществления 131. Способ согласно варианту осуществления 130, где ингибитор иммунных контрольных точек нацелен на любое из PD-1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, LAG3, VISTA, TIM1, B7-H4 (VTCN1) или BTLA.

[0333] Вариант осуществления 132. Способ согласно вариантам осуществления 64-131, где модифицированную Т-клетку вводят до, одновременно или после введения химиотерапевтического препарата.

[0334] Вариант осуществления 133. Способ согласно варианту осуществления 132, где химиотерапия включает цисплатин.

[0335] Вариант осуществления 134. Способ по любому из пп. 64-133, где введение модифицированной Т-клетки субъекту приводит к активации и/или экспансии цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL), специфических для антигена.

[0336] Вариант осуществления 135. Способ согласно любому из вариантов осуществления 64-134, где введение модифицированной Т-клетки субъекту приводит к активации и/или экспансии Т(Th)-хелперов, специфических для антигена.

[337] Вариант осуществления 136. Способ по любому из вариантов осуществления 64-135, где количество модифицированных Т-клеток, введенных субъекту, составляет от приблизительно 1×10⁶ до приблизительно 1×10¹² клеток.

[338] Вариант осуществления 137. Способ по любому из вариантов осуществления 64-136, где способ включает многократные введения модифицированной Т-клетки.

[339] Вариант осуществления 138. Способ согласно варианту осуществления 137, где интервал времени между двумя последовательными введениями модифицированной Т-клетки составляет от приблизительно 1 суток до приблизительно 30 суток.

[340] Вариант осуществления 139. Способ модуляции иммунного ответа у субъекта, включающий: введение субъекту модифицированной Т-клетки, ассоциированной с антигеном, где модифицированную Т-клетку получают способом, включающим стадии: а) инкубирование входной Т-клетки с антигеном и/или адъювантом в течение достаточного периода времени для обеспечения связывания антигена с клеточной поверхностью входной Т-клетки, где антиген включает иммуногенный эпитоп, тем самым получая модифицированную Т-клетку, ассоциированную с антигеном; и b) введение субъекту модифицированной Т-клетки.

[0341] Вариант осуществления 140. Способ согласно варианту осуществления 139, где антиген ВПЧ содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере, с 90% сходством с любой из SEQ ID NO: 18-25.

[0342] Вариант осуществления 141. Способ согласно варианту осуществления 140, где антиген ВПЧ содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23.

[0343] Вариант осуществления 142. Способ согласно любому из вариантов осуществления 139-141, где адъювант представляет CpG ODN или LPS.

[0344] Вариант осуществления 143. Способ согласно варианту осуществления 142, где CpG ODN представляет CpG ODN 1018, CpG ODN 1826 или CpG ODN 2006.

[0345] Вариант осуществления 144. Композиция, содержащая модифицированную Т-клетку согласно любому из вариантов осуществления 1-59, для применения в способе лечения организма человека или животного хирургическим путем, терапией или диагностикой.

[0346] Вариант осуществления 145. Композиция, содержащая модифицированную Т-клетку согласно любому из вариантов осуществления 1-59, для применения в способе модуляции иммунного ответа у субъекта, где способ включает введение субъекту модифицированной Т-клетки.

[0347] Вариант осуществления 146. Композиция, содержащая модифицированную Т-клетку, для применения в способе лечения организма человека или животного хирургическим путем, терапией или диагностикой, где модифицированная Т-клетка содержит антиген, содержащий аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 18-25.

[0348] Вариант осуществления 147. Композиция, содержащая модифицированную Т-клетку для применения в способе модуляции иммунного ответа у субъекта, где модифицированная Т-клетка содержит антиген, содержащий аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 18-25.

[0349] Вариант осуществления 148. Композиция, содержащая модифицированную Т-клетку, для применения в способе лечения организма человека или животного хирургическим путем, терапией или диагностикой, где модифицированные Т-клетки получают способом, включающим: а) пропускание клеточной суспензии, содержащей входную Т-клетку, через деформирующее клетку сужение, где диаметр сужения является функцией диаметра входной Т-клетки в суспензии, что вызывает, тем самым, пертурбации входной Т-клетки, достаточно большие для того, чтобы антиген и адъювант прошли через них, с образованием пертурбированной входной Т-клетки, где антиген содержит иммуногенный эпитоп; и b) инкубирование пертурбированной входной Т-клетки с антигеном и адъювантом в течение достаточного периода времени для обеспечения проникновения антигена и адъюванта в пертурбированную входную Т-клетку; с получением, тем самым, модифицированной T-клетки, содержащей антиген и адъювант.

[0350] Вариант осуществления 149. Композиция, содержащая модифицированные Т-клетки, для применения в способе модуляции иммунного ответа у субъекта, где модифицированные Т-клетки получают способом, включающим: а) пропускание клеточной суспензии, содержащей входную Т-клетку, через деформирующее клетку сужение, где диаметр сужения является функцией диаметра входной Т-клетки в суспензии, что вызывает, тем самым, пертурбации входной Т-клетки, достаточно большие для того, чтобы антиген и адъювант прошли через них, с образованием пертурбированной входной Т-клетки, где антиген содержит иммуногенный эпитоп; и b) инкубирование пертурбированной входной Т-клетки с антигеном и адъювантом в течение достаточного периода времени для обеспечения проникновения антигена и адъюванта в пертурбированную входную Т-клетку; с получением, тем самым, модифицированной T-клетки, содержащей антиген и адъювант.

Примеры

[0351] Специалисты в данной области техники понимают, что несколько вариантов осуществления возможны в пределах объема и сущности этого изобретения. Далее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на следующие неограничивающие примеры. Следующие приведенные ниже примеры дополнительно иллюстрируют изобретение, но, конечно, они не должны рассматриваться как ограничивающие его объем.

Пример 1

[0352] Для определения минимальной эффективной клеточной дозы T_APC, необходимой для ингибирования роста опухолей в терапевтическом опыте, тестировали четыре различных дозы T_APC по схеме прайм/буст на опухолевой модели TC1, где строили график зависимости площади опухолей от времени.

[0353] Самкам мышей C57BL/6J в заднюю область правого бока вводили опухолевые клетки TC1 (50 тыс. клеток/мышь) на сутки 0. На сутки 4 (прайм) и 7 (буст), выделяли Т-клетки от самок мышей-доноров C57BL/6J и с использованием устройства SQZ нагружали 200 мкг/мл CpG ODN 1826 и предварительно приготовленным комплексом 40 мкМ E7 SLP (GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR; SEQ ID NO: 25) + 40 мкМ сывороточного альбумина мыши (MSA). Животным (10 мышей/группу) внутривенно вводили соответствующую дозу Т-клеток, нагруженных E7 + MSA + CpG (50 тыс. клеток/мл), и рост опухолей TC-1 измеряли через 1 неделю после имплантации опухолей два раза в неделю и сравнивали с ростом опухолей у необработанных мышей. Репрезентативная схема по группам обработки и схема опыта приведены на фиг. 1А.

[0354] Результаты оценки роста опухолей, измеренного по формуле ((длина× ширина²)/2), сравнивали с ростом опухолей у мышей из необработанной группы (без адоптивного переноса Т-клеток), и из групп обработки B-E, показанных на фиг. 1В, представлены на фиг. 1A. Все опытные условия обработки приводили к полному уменьшению опухолей, что свидетельствует о том, что в самой низкой испытанной дозе клеток (2,5 тыс. клеток на стадии прайм, 1 тыс. клеток на стадии буст) можно было достичь аналогичного уменьшения опухолей, что и с более высокими дозами клеток, где с каждой дозой достигалась статистическая значимость по сравнению с необработанными контрольными мышами на сутки 18 (#P <0,0001).

Пример 2

[0355] Для определения в конструировании E7 SLP, два разных E7 SLP, нативный E7 SLP и один, в нативной последовательности которой все цистеины заменяли серином, обработывались SQZ’d с получением T APC вместе с совместным введением CpG, и каждое условие опыта оценивали на продукцию IFN-γ с использованием ICS.

[0356] Выделяли Т-клетки от самок мышей-доноров C57BL/6J и нагружали с использованием устройства SQZ различными дозами (слева - 200 мкг/мл, справа - 25 мкг/мл) CpG ODN 1826 и предварительно приготовленным комплексом 40 мкМ нативного E7 или классического SLP + 40 мкМ сывороточного альбумина мыши (MSA), или Т-клетки инкубировали в тех же условиях в отсутствии обработки SQZ и использовали в качестве отрицательного контроля (Endo - группы B и D). Животным (5 мышей/группу) внутривенно вводили 5 тыс. нагруженных или инкубированных Т-клеток в объеме 100 мкл (50 тыс. клеток/мл). На сутки 8 отбирали селезенки и количественно определяли процент CD8+ Т-клеток, продуцирующих IFN-γ, с использованием ICS. Репрезентативная схема по группам обработки и схема опыта приведены на фиг. 2A.

[0357] Процент CD8+ Т-клеток, продуцирующих IFN-γ, был самым высоким в контрольной группе Endo с использованием cE7, что достоверно не отличалось от SQZ с cE7 или Endo с nE7. Неожиданно отсутствовали преимущества SQZ по сравнению с Endo, но наблюдали заметное снижение % CD8+ Т-клеток, продуцирующих IFN-γ, с SQZ nE7 по сравнению со всеми другими вариантами опыта. Полученные данные показывают, что последовательность SLP оказывает влияние на % CD8+ Т-клеток, продуцирующих IFN-γ, генерируемых в ответ на вакцинацию Т APC, особенно когда антиген нагружали в Т-клетку с использованием устройства SQZ.

Пример 3

[0358] Для определения способности E6 SLP индуцировать антигенспецифический иммунный ответ в Т-клетках E6 респондерах на человеческой модели in vitro, первичные человеческие Т-клетки нагружали E6 SLP, и измеряли секрецию IFN-γ клетками-респондерами с помощью ELISA.

[0359] Человеческие Т-клетки выделяли из PBMC HLA-A02+ доноров (10 тыс. клеток/мл), и 50 мкМ E6 SLP, содержащего HLA-A02-рестриктированный минимальный эпитоп E629-38 (LPQLSTELQTTIHDIILECVYSKQQQLLRREVYDFAF; SEQ ID NO: 18) доставляли внутриклеточно с помощью устройства SQZ, и уровень IFN-γ, измеренный с помощью ELISA, сравнивали между опытными условиями с SQZ и контролем, где E6 SLP инкубировали с T_APC в отсутствии обработки SQZing (Endo). Затем T_APC совместно культивировали с E6-специфическими CD8+ клетками-респондерами в соотношении стимулятор:эффектор 1:1 и культивировали в присутствии IL-2 (100 Е/мл). Через 18 ч супернатант собирали из каждого опытного условия и уровень продукции IFN-γ оценивали с помощью ELISA IFN-γ (Biolegend).

[0360] Тестированный E6 SLP при внутриклеточной доставке с использованием устройства SQZ приводил к >10-кратному увеличению продукции IFN-γ при совместном культивировании с CD8+ T-клетками-респондерами E6 (#P <0,0001), как показано на фиг. 3. Полученные данные показывают способность Т APC индуцировать антигенспецифический иммунный ответ на несколько антигенов ВПЧ (E6 и E7).

Пример 4

[0361] Для определения способности E7 SLP индуцировать антигенспецифический иммунный ответ в Т-клетках E7_11-20 респондерах, а также влияния последовательности SLP на активацию SQZ APC Т-клеток (Tapc) на человеческой модели in vitro, первичные человеческие Т-клетки от нескольких доноров нагружали разными E7 SLP, и измеряли секрецию IFN-γ клетками-респондерами с помощью ELISA.

[0362] Человеческие Т-клетки выделяли из PBMC HLA-A02+доноров (10 тыс. клеток/мл), и 50 мкМ OL-E7_1-35 (MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEE; SEQ ID NO: 22) или E7.6 (QLCTELQTYMLDLQQPET:QLCTELQTYMLDLQQPET; 23) SLP доставляли внутриклеточно с помощью устройства SQZ, и уровень IFN-γ, измеренный с помощью ELISA, сравнивали между условиями с SQZ и контролем, где E7 SLP инкубировали с T_apc в отсутствии обработки SQZing (Endo). Затем T_APC совместно культивировали с E7_11-20-специфическими CD8+ клетками-респондерами в соотношении стимулятор:эффектор 4:1 и культивировали в присутствии IL-2 (100 Е/мл). Через 24 ч супернатант собирали из каждого опытного условия и оценивали уровень продукции IFN-γ с помощью ELISA IFN-γ (Biolegend).

[0363] Нативный OL-E7_1-35 SLP вызывал минимальную ответную выработку IFN-γ при доставке с использованием SQZ по сравнению с Endo (фиг. 4). Однако E7.6, который содержит минимальный эпитоп E7 (YMLDLQPETT; SEQ ID NO: 3), вставленный между фланкирующими областями другого реактивного SLP (E6_21-45 - QLCTELQTXXXXXXXXXXYCKQQLL), индуцировал более высокую ответную выработку IFN-γ по сравнению с сопоставимым контролем Endo для всех трех тестированных доноров по сравнению с контролями Endo (*P <0,05, **P <0,01; #P <0,0001). Полученные результаты подчеркивают значение последовательности фланкирующей области для иммуногенности SLP и обеспечивают поддержку того, что фланкирующие области других SLP, о которых известно, что они являются реактивными, можно использовать в сочетании с ортогональными минимальными эпитопами для достижения повышенных иммунных ответов.

Пример 5

[0364] Для определения дозы антигена для SQZ Т-клеток APC на человеческой модели in vitro, первичные Т-клетки человека нагружали E7 SLP в различных дозах и оценивали на IFN-γ с помощью ELISA.

[0365] Человеческие Т-клетки выделяли из PBMC HLA-A02+ доноров (10 тыс. клеток/мл), и различные дозы (50 и 100 мкМ) E7 SLP (QLCTELQTYMLDLQPETTYCKQQLL; SEQ ID NO: 23) доставляли внутриклеточно с помощью устройства SQZ, и уровень IFN-γ, измеренный с помощью ELISA, сравнивали между опытными условиями с SQZ и контролем, где E7 SLP инкубировали с T APC в отсутствии SQZing (Endo). Затем Т APC совместно культивировали с E7_11-20-специфичными CD8+ клетками-респондерами в соотношении стимулятор:эффектор 4:1 и культивировали в присутствии IL-2 (100 Е/мл). Через 24 ч супернатант собирали из каждого опытного условия и оценивали уровень продукции IFN-γ с помощью ELISA IFN-γ (Biolegend). Кроме того, использовали активированный пептидом положительный контроль, где клетки B-LCL инкубировали в присутствии минимального эпитопа E7 (YMLDLQPETT; SEQ ID NO: 3) в течение 1 ч перед постановкой ELISA.

[0366] Для трех тестированных доноров последовательное увеличение продуцированного IFN-γ имело место во всех опытных условиях с SQZ по сравнению с сопоставимым контролем (Endo), где SLP инкубировали с Т-клеткой в отсутствии SQZ (фиг. 5). Доноры 1 и 3 демонстрировали статистически значимое увеличение при использовании 50 мкМ E7 SLP (8668 - *P <0,05; 8299 - #P <0,0001) и тенденцию к достижению статистической значимости при более высоком уровне 100 мкМ E7 SLP. Несмотря на то, что отсутствовала статистически значимая разница между дозами 50 и 100 мкМ для любого донора, ответная выработка IFN-γ на 50 мкМ E7 SLP была неизменно равной или более высокой.

Пример 6

[0367] Для определения варибельности доноров для SQZ T-клеток APC на человеческой модели in vitro, а также определения оптимальных комбинаций и доз E6 и E7 SLP, которые индуцируют достоверный иммунный ответ против E7, первичные Т-клетки человека от нескольких HLA-A02+ доноров нагружали E6 и E7 SLP и оценивали на продукцию IFN-γ с помощью ELISA.

[0368] Человеческие Т-клетки выделяли из PBMC HLA-A02+ доноров (10 тыс. клеток/мл), и 25 или 50 мкМ E6 SLP (QLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLL) и E7.6 SLP (QLCTELQTYMLDLQPETTYCKQQLL); SEQ ID NO: 23 доставляли внутриклеточно с использованием устройства SQZ, и уровни IFN-γ, измеренные с помощью ELISA, сравнивали между опытными условиями с SQZ и контролем, где SLP инкубировали с T_APC в отсутствии SQZing (Endo). Применяли активированный пептидом положительный контроль, где клетки B-LCL инкубировали в присутствии минимального эпитопа E7 (YMLDLQPETT; SEQ ID NO: 3) одновременно с генерацией T_APC. Затем T_APC и положительный контроль совместно культивировали с E7_11-20-специфическими CD8+ клетками-респондерами в соотношении стимулятор:эффектор 4:1 и культивировали в присутствии IL-2 (100 Е/мл). Через 24 ч супернатант собирали из каждого опытного условия и оценивали уровень продукции IFN-γ с помощью ELISA IFN-γ (Biolegend).

[0369] Пять из семи доноров демонстрировали последовательное увеличение продукции IFN-γ при обработке SQZ E6+E7 SLP по сравнению с сопоставимым контролем (Endo), где SLP инкубировали с Т-клеткой в отсутствии SQZ (доноры 1-3, 5-6: *P <0,05, **P <0,01, ***P <0,005), как показано на фиг. 6. Из двух доноров, у которых не было статистически значимого увеличения при обработке SQZ'd T APC относительно контроля Endo, у обоих доноров (доноры 4 и 7) имела место ситуация, при которой наблюдали детектируемое увеличение с одной дозой тестированных SQZ'd T APC (донор 4 - 50 мкМ, донор 7 - 25 мкМ), имеющая тенденцию к достижению статистической значимости. В совокупности полученные данные показывают, что, хотя разные донорные Т APC обладают разной иммуностимулирующей активностью, очевидно, что последовательное увеличение продукции IFN-γ у нескольких доноров и что E7-специфический иммунный ответ все еще является достоверным в сочетании с несколькими антигенами/SLP, в данном случае антигеном Е6, специфическим для ВПЧ.

Пример 7

[0370] Для определения адъюванта, который приводит к наиболее сильному иммунному ответу, исследовали влияние двух адъювантов, которые функционируют на разных путях, на способность Т АРС индуцировать антигенспецифический ответ in vivo. Данный эффект количественно оценивали с помощью окрашивания на тетрамер и ICS с использованием проточной цитометрии.

[0371] Выделяли Т-клетки от самок мышей-доноров C57BL/6J и нагружали с использованием устройства SQZ 400 мкг/мл Ova + различными концентрациями высокомолекулярной и низкомолекулярной поли I:C (10, 30, 100, 300, 1000 мкг/мл) и сравнивали с Т-клетками, инкубированными в тех же условиях в отсутствии обработки SQZ в качестве отрицательного контроля (Endo - группы C и E). Т-клетки SQZ’d с Ova + 200 мкг/мл CpG использовали в качестве положительного контроля (группа F). На сутки 0 мышам (5 мышей/группу, 3 необработанных) вводили 5 тыс. нагруженных или инкубированных Т-клеток в объеме 100 мкл (50 тыс. клеток/мл). На сутки 7 отбирали селезенки и определяли количественно Ova-специфические Т-клетки окрашиванием на тетрамер с использованием проточной цитометрии, также некоторые спленоциты пермеабилизовали и фиксировали в течение ночи. На следующий сутки (сутки 8) определяли уровни IFN-γ с помощью ICS, где PMA/иономицин использовали в качестве положительного контроля. Репрезентативная схема по группам обработки и схема опыта приведены на фиг. 7A.

[0372] % CD8+ Т-клеток, продуцирующих тетрамер или IFN-γ, был самым высоким в группе с адъювантом CpG, тогда как все условия с адъювантом высокомолекулярной и низкомолекулярной поли I:C не увеличивали процент Ova-специфических или IFN-γ-продуцирующих CD8+ Т-клеток по сравнению с необработанным контролем (фиг. 7B). Поскольку поли I:C является агонистом TLR3, и CpG является агонистом TLR9, то полученные данные подтверждают преимущество CpG над поли I:C при использовании в качестве адъюванта в вакцинации T APC, одновременно предполагая, что активация TLR3 может быть неблагоприятной в таких условиях.

Пример 8

[0373] Для определения концентрации адъюванта CpG, которая приводит к наиболее сильному иммунному ответу, тестировали влияние нескольких доз CpG на способность T APC индуцировать антигенспецифический ответ in vivo. Данный эффект количественно оценивали с помощью окрашивания на тетрамер и ICS с использованием проточной цитометрии.

[0374] Т-клетки выделяли от самок мышей-доноров C57BL/6J и нагружали с использованием устройства SQZ 400 мкг/мл Ova + различными концентрациями CpG 1826 (50, 100, 200 мкг/мл) и сравнивали с Т-клетками, инкубированными в тех же условиях в отсутствии SQZ в качестве отрицательного контроля (Endo - группы B, D и F). На сутки 0 мышам (5 мышей/группу, 3 необработанных) вводили 5 тыс. нагруженных или инкубированных Т-клеток в объеме 100 мкл (50 тыс. клеток/мл). На сутки 7 отбирали селезенки и определяли количественно Ova-специфические Т-клетки окрашиванием на тетрамер с использованием проточной цитометрии, также некоторые спленоциты пермеабилизовали и фиксировали в течение ночи. На следующие сутки (сутки 8) определяли уровни IFN-γ с помощью ICS, где PMA/иономицин использовали в качестве положительного контроля. Репрезентативная схема по группам обработки и схема опыта приведены на фиг. 8A.

[0375] % CD8+ Т-клеток, продуцирующих тетрамер или IFN-γ, был самым высоким в группе с 200 мкг/мл CpG и достоверно отличался от соответствующего контроля Endo (*P <0,05 для тетрамера, #P <0,0001 для IFN-γ), для пептида класса I/MHC-I, в то время как во всех других опытных условиях отсутствовала индукция достоверного ответа по сравнению с необработанным контролем или их соответствующим контролем Endo (фиг. 8B). Активацию Ova-специфических Т-клеток наблюдали только с пептидом I класса, что поддерживает представление о прямой презентации антигенов Ova для осуществления ответа CD8+ Т-клеток.

Пример 9

[0376] Для оценки схемы введения адъюванта CpG, которая приводит к сильному иммунному ответу, исследовали влияние нескольких схем введения CpG на способность T APC индуцировать антигенспецифический ответ in vivo. Данный эффект количественно оценивали с помощью окрашивания на тетрамер и ICS с использованием проточной цитометрии.

[0377] Т-клетки выделяли от самок мышей-доноров C57BL/6J и нагружали с использованием SQZ 400 мкг/мл Ova, и мышам (5 мышей/ группу, 3 необработанных) вводили 5 тыс. нагруженных или инкубированных Т-клеток в объеме 100 мкл (50 тыс. клеток/мл). Системное совместное введение CpG 1826 (25 мкг/мл) мышам-донорам проводили в то же время, что и праймирование T APC (сутки 0) или через 1 или 2 суток после праймирования (сутки 1 или 2 соответственно) и сравнивали с T-клетками, инкубированными в тех же условиях в отсутствии SQZ, которые использовали в качестве отрицательного контроля (группы B, D и F). Т-клетки, подвергшиеся обработке SQZ’d с (Ova + 200 мкг/мл CpG) использовали в качестве положительного контроля (группа H). На сутки 7 отбирали селезенки и определяли количественно Ova-специфические Т-клетки окрашиванием на тетрамер с использованием проточной цитометрии, также некоторые спленоциты пермеабилизовали и фиксировали в течение ночи. На следующие сутки (сутки 8) определяли уровни IFN-γ с помощью ICS, где PMA/иономицин использовали в качестве положительного контроля. Репрезентативная схема по группам обработки и схема опыта приведены на фиг. 9A.

[0378] % тетрамер- или IFN-γ-продуцирующих CD8+ Т-клеток был самым высоким в группе, где Ova и CpG совместно доставляли в T APC, в то время как совместное введение в тот же день, когда проводили праймирование (группа B), было единственным совместным введением в группе с CpG, когда имел место некоторый уровень специфической активации для Ova, имеющий тенденцию к статистической значимости (фиг. 9B). Однако полученные данные подтверждают наблюдение о том, что совместная доставка антигена + CpG может привести к наиболее высокой активации Ova-специфических CD8+ Т-клеток, в то время как отсрочка системного введения CpG приводит к более низким ответам по сравнению с одновременным праймированием и совместным введением адъюванта.

Пример 10

[0379] Для определения комбинации внутриклеточного и системного введения адъюванта для проявления противоопухолевой активности T APC, в сравнительном аспекте оценивали несколько способов введения CpG в сравнении с IFN-γ в сочетании с E7-специфическими T APC по изобретению у мышей в опыте по оценке профилактического эффекта на опухолевой модели TC-1. Антигенспецифические Т-клеточные ответы измеряли окрашиванием на тетрамер и использованием проточной цитометрией, в то время как противоопухолевый эффект измеряли по предупреждению роста опухолей.

[0380] На сутки -14 (прайм) и -7 (буст) выделяли Т-клетки от самок мышей-доноров C57BL/6J и нагружали с использованием устройства SQZ предварительно приготовленным комплексом 40 мкМ SLP E7 (GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR; SEQ ID NO: 25) + 40 мкМ сывороточного альбумина мыши (MSA) (группы B и C) или E7 SLP + MSA + 200 мкг/мл CpG ODN 1826 (группы D, E и F). Самкам мышей-реципиентов C57BL/6J (10 мышей/группу) внутривенно вводили 100 мкл нагруженных Т-клеток (5 тыс. клеток/животное), в то время как животные групп B и E также получали внутривенно CpG (25 мкг), и мыши из групп C и F получали внутривенно IFN-γ (10 тыс. МЕ). На сутки -8 и -3 у мышей отбирали 100 мкл крови и количественно определяли % E7-специфических CD8+ Т-клеток окрашиванием на тетрамер и проточной цитометрией. На сутки 0 мышам-реципиентам прививали в заднюю область правого бока опухолевые клетки TC1 (100 тыс. клеток/мышь), и измеряли рост опухолей TC-1 два раза в неделю, начиная с суток 11, и сравнивали с ростом опухолей у необработанных мышей. Репрезентативная схема по группам обработки и схема опыта приведены на фиг. 10А.

[0381] Процент E7-специфических Т-клеток измеряли у мышей окрашиванием на тетрамер E7 после введения прайм-дозы (сутки -8) и буст-дозы (сутки -3) E7 + MSA или E7 + MSA + CpG SQZ'd T-клеток +/- одновременное введение CpG или IFN-γ (фиг. 10B). Наиболее высокую относительную долю E7-специфических Т-клеток отмечали в группах с совместным введением SQZ E7 + CpG и SQZ (E7 + CpG) + IFN-γ. Относительное количество E7-специфических CD8+ T-клеток после введения прайм-дозы было неожиданно ниже при совместном введении SQZ (E7 + CpG) + CpG по сравнению с совместным введением SQZ E7 + CpG (*P <0,05), тогда как совместное введение IFN-γ с SQZ (E7 + CpG) T-клетками приводило к достоверно большему количеству E7-специфических T-клеток, чем совместное введение CpG с SQZ (E7 + CpG) T-клетками (* P <0,05). После введения буст-дозы (сутки -3) наблюдали аналогичную тенденцию, когда в группах с совместным введением SQZ E7 + CpG и группах с совместным введением SQZ (E7 + CpG) + IFN-γ имел место наиболее высокий % E7-специфических Т-клеток. Однако самый высокий ответ получали в группе с совместным введением SQZ (E7 + CpG) + IFN-γ, что было достоверно выше, чем при совместном введении SQZ E7 + IFN-γ и одновременном введении SQZ (E7 + CpG) + CpG, показывая, что совместное введение IFN-γ приводит к более высокому проценту антигенспецифических Т-клеток при использовании в сочетании с SQZ (E7 + CpG) T-клетками. Результаты оценки роста опухолей, измеренного по формуле ((длина × ширина²)/2), сравнивали с мышами из необработанной группы (без адоптивного переноса Т-клеток) и из обработанных групп B-F, и они приведены на фиг. 10C. Наиболее высокое снижение роста опухолей и повышение выживаемости в группе с совместным введением SQZ (E7 + CpG) + IFN-γ хорошо согласуется с окрашиванием на тетрамер, показывая, что наиболее высокая индукция E7-специфических Т-клеток приводит к наиболее высокой противоопухолевой активности. Интересно отметить, что, несмотря на низкий % E7-специфических Т-клеток в группе SQZ (E7 + CpG), такая обработка также обеспечивала очень высокий уровень противоопухолевой активности, и это была единственная другая группа (в дополнение к SQZ (E7 + CpG) + совместное введение IFN-γ), в которой увеличивалась выживаемость всех мышей в период последних 60 суток. Несмотря, что это было несколько ниже, чем в ранее указанных группах D и F, в группах C и E наблюдали заметное повышение выживаемости и ингибирование роста опухолей. На сутки 78 7 мышам без опухолей из группы D повторно прививали 50 тыс. клеток в противоположный бок (слева) и сравнивали с необработанными животными соответствующего возраста (10 мышей) (фиг. 10D). У мышей из группы D после повторной прививки наблюдали достоверное снижение роста опухолей по сравнению с необработанными мышами, получившими первую прививку (*** P <0,005), подтверждая, что данный противоопухолевый эффект сохраняется в течение последних 2 месяцев.

Пример 11

[0382] Для определения эффекта комбинирования нескольких антигенов ВПЧ в проявлении противоопухолевой активности T APC, синтетические длинные пептиды E6 и E7 (SLP) по отдельности и в комбинации с E7-специфическими T APC по изобретению оценивали на профилактический эффект на мышиной опухолевой модели TC-1. Е7-специфические Т-клеточные ответы измеряли окрашиванием на тетрамер и проточной цитометрией, тогда как противоопухолевый эффект измеряли по предупреждению роста опухолей.

[0383] На сутки -14 (прайм) и -8 (буст) выделяли Т-клетки от самок мышей-доноров C57BL/6J и нагружали с использованием устройства SQZ предварительно приготовленным комплексом 20 мкМ мышиного сывороточного альбумина (MSA) + 20 мкМ E6 (VYSKQQLLRREVYDFAFRDLSIVYRDGNPYAVSDK; SEQ ID NO: 21) и/или E7 SLP (GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR; SEQ ID NO: 25) или комбинацией обоих +/- 200 мкг/мл CpG ODN 1826 в соответствии с таблицей XX. Т-клетки, инкубированные в аналогичных условиях, что и группа B, в отсутствии SQZ, использовали в качестве отрицательного контроля (группа C). Самкам мышей-реципиентов C57BL/6J (5-10 мышей/группу) внутривенно вводили 100 мкл нагруженных Т-клеток (5 тыс. клеток/животное). На сутки -3 у мышей отбирали 100 мкл крови и количественно определяли % E7-специфических CD8+ Т-клеток с использованием окрашивания на тетрамер и проточной цитометрии. На сутки 0 мышам-реципиентам прививали в заднюю область правого бока опухолевые клетки TC1 (100 тыс. клеток/мышь), и рост опухолей TC-1 измеряли два раза в неделю, начиная с суток 11, и сравнивали с ростом опухолей у необработанных мышей. Репрезентативная схема по группам обработки и схема опыта приведены на фиг. 11A.

[0384] Процент E7-специфических Т-клеток измеряли у мышей по окрашиванию на тетрамер E7 после введения буст-дозы (сутки -3), где наиболее высокий эффект наблюдали с CpG + E7 SQZ T APC (группа B), как показано на фиг. 11B. Интересно отметить, что ответы в группе B были достоверно выше, чем ответные реакции в вариантах опыта без обработки и с комбинацией E7 и E6 (группа F - #P <0,0001), свидетельствуя о том, что добавление E6 SLP «притупляет» E7-специфический ответ. Группа B достоверно отличалась от других групп обработки, за исключением контрольной группы Endo (группа C), когда результаты по группе B были заметно выше и имели тенденцию к статистической значимости. Как показано на фиг. 11C, рост опухолей, измеренный по формуле ((длина × ширина²)/2), сравнивали с мышами из необработанной группы (без адоптивного переноса Т-клеток) и с группами обработки B-G, представленной на фиг. 11А. Предупреждение интенсивного роста опухолей имело место в группах с Т-клетками SQZ’d с E7 + CpG, а также с Т-клетками, которые инкубировали в присутствии E7 + CpG в отсутствии SQZ. В группах D-F имел место некоторый уровень ингибирования роста опухолей по сравнению с необработанными (группа A) и E6 + CpG SQZ’d Т-клетками (группа G), но во всех была меньшая эффективность, чем в группах B и C.

Пример 12

[0385] Для определения значения пути введения адъюванта CpG для проявления противоопухолевой активности E7-специфических Т APC, SLP E7 доставляли в Т-клетки в комбинации с CpG или только доставляли в Т-клетки, или совместно вводили системно животному-реципиенту, и противоопухолевый эффект оценивали по ингибированию роста опухоли.

[0386] На сутки 0 мышам-реципиентам вводили в заднюю область правого бока опухолевые клетки TC1 (50 тыс. клеток/мышь). На сутки 10 (прайм) и 20 (буст) выделяли Т-клетки от самок мышей-доноров C57BL/6J и нагружали с использованием SQZ предварительно приготовленным комплексом 20 мкМ мышиного сывороточного альбумина (MSA) + 20 мкМ E7 (GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR; SEQ ID NO: 25), и ODN 1826 совместно доставляли (группа D) с помощью SQZ в дозе 200 мкг/мл или совместно вводили животным системно в дозе 25 мкг/мышь (группа C), и сравнивали с необработанным контролем (группа A) и с системным введением только CpG (группа B). Мышей-реципиентов (8-10 мышей/группу) обрабатывали 100 мкл нагруженных Т-клеток (5 тыс. клеток/животное). Рост опухолей ТС-1 измеряли два раза в неделю, начиная с суток 10. Репрезентативная схема по группам обработки и схема опыта приведены на фиг. 12А.

[0387] На модели ВПЧ-ассоциированной опухоли (TC-1), используемой для оценки терапевтического эффекта, T APC, которые были обработаны SQZ'd с E7 SLP, приводили к достоверному снижению опухолевой нагрузки по сравнению с необработанным контролем и введением только CpG (сутки 17: группа C - P <0,05; сутки 20: группы C и D - P <0,0001) (фиг. 12B). Полученные данные показывают, что в опыте с оценкой терапевтической эффективности, как системное совместное введение, так и внутриклеточная доставка адъюванта CpG приводит к достоверному снижению опухолевой нагрузки по сравнению с необработанным контролем или введением одного адъюванта.

Пример 13

[0388] Для оценки способности совместно вводимых адъювантов приводить к инфильтрации опухоли E7-специфическими Т-клетками, сравнивали CpG по сравнению с IFN-γ в комбинации с E7-специфическими T APC по изобретению, на мышиной опухолевой модели TC-1 оценивали терапевтическую активность. Антигенспецифические Т-клеточные ответы измеряли в инфильтрирующих опухоль лимфоцитах по окрашиванию на тетрамер и проточной цитометрией.

[0389] На сутки 0 мышам-реципиентам прививали в заднюю область правого бока опухолевые клетки TC1 (50 тыс. клеток/мышь). На сутки 10 выделяли Т-клетки от самок мышей-доноров C57BL/6J и нагружали с помощью SQZ предварительно приготовленным комплексом 20 мкМ E7 SLP (GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR; SEQ ID NO: 25) + 20 мкМ сывороточного альбумина мыши (MSA). Нагруженные SQZ Т-клетки (5 тыс. клеток/животное) вводили отдельно (группа C), в комбинации с CpG ODN 1826 (25 мкг/мышь - группа D) или IFN-γ (10 тыс. МЕ/мышь - группа E) и вводили внутривенно в общем объеме 100 мкл. Мышам также вводили системно CpG (25 мкг - группа A) или только IFN-γ (10 тыс. МЕ - группа B). На сутки 17 опухоли отбирали, выделяли CD8+ инфильтрирующие опухоль Т-клетки и оценивали E7-специфическую реактивность окрашиванием на тетрамер. Репрезентативная схема по группам обработки и схема опыта приведены на фиг. 13.

[0390] Процент E7-специфических CD8+ Т-клеток измеряли у мышей окрашиванием на тетрамер E7 через 7 суток после праймирования (сутки 17), и репрезентативный пример процента E7-специфических Т-клеток из CD8+ клеток показан на нижней панели на фиг. 13. Несмотря на то, что инъекция только адъювантов не генерировала заметного количества E7-специфических Т-клеток, SQZ-опосредованная доставка E7 SLP приводила к 40% увеличению E7-специфических T-клеток, и E7-специфические T-клетки в комбинации с CpG и IFN-γ приводили к еще более высокому проценту антигенспецифических Т-клеток (70% и 80% соответственно). Полученные данные показывают, что более сильный Е7-специфический Т-клеточный ответ генерируется, когда Т-клетки, нагруженные E7 SLP, вводят в комбинации с системными адъювантами, такими как CpG или IFN-γ.

Пример 14

[0391] Для определения схемы вакцинации в режиме прайм-буст T APC, нагруженные синтетическим длинным пептидом E7 (SLP) + CpG, использовали на мышиной опухолевой модели TC-1 для оценки терапевтической активности, с обработкой вакциной T APC по изобретению на разные временные точки и с разным числом буст-обработок. Противоопухолевый эффект оценивали по ингибированию роста опухолей.

[0392] На сутки 0 мышам-реципиентам прививали в заднюю область правого бока опухолевые клетки TC1 (50 тыс. клеток/мышь), и рост опухолей TC-1 измеряли два раза в неделю, начиная с суток 11, и сравнивали с ростом опухолей у необработанных контрольных мышей. На сутки 3 или 6 выделяли Т-клетки от самок мышей-доноров C57BL/6J и нагружали с использованием SQZ предварительно приготовленным комплексом 20 мкМ мышиного сывороточного альбумина (MSA) + 20 мкМ E7 SLP (GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR; SEQ ID NO: 25) + 200 мкг/мл CpG ODN 1826 в соответствии с таблицей XX с последующей внутривенной инъекцией мышам-реципиентам 100 мкл нагруженных Т-клеток (5 тыс. клеток/животное). Репрезентативная схема по группам обработки и схема опыта приведены на фиг. 14A.

[0393] Ингибирование роста опухолей имело место во всех группах с Т-клетками SQZ’d с E7 + CpG, при этом статистическую значимость по сравнению с необработанным контролем наблюдали на сутки 20 (сутки 20 - все группы P <0,05; сутки 24 - все группы P <0,0001). Полученные данные показывают, что схема введения вакцины T APC может «работать» одинаково хорошо при праймировании на сутки 6 по сравнению с сутками 3, и не было заметного положительного эффекта от добавления второй буст-дозы на сутки 21.

Пример 15

[0394] Для лучшего понимания механизма презентации антигена Т-клетками, в которые был внутриклеточно доставлен антиген с помощью SQZ, Ova доставляли в Т-клетки или инкубировали в отсутствии SQZ с Т-клетками дикого типа, и вводили мышам дикого типа или мышам с нокаутом MHC-I. Отбирали селезенки и количественно определяли уровень пролиферации Ova-специфических Т-клеток (OT-I) с помощью окрашивания CFSE.

[0395] На сутки 0 Т-клетки от самок мышей-доноров OT-I выделяли и метили 2 мкМ CFSE, и 2,5 тыс. клеток вводили ретроорбитально (RO) в 100 мкл PBS мышам дикого типа или мышам с нокаутом MHC-I. Также на сутки 0 400 мкг/мл Ova нагружали или инкубировали с Т-клетками, выделенными от мышей-доноров CD45.1 (4 мыши/группу), и 5 тыс. Т-клеток вводили ретроорбитально. На сутки 3 отбирали селезенки и оценивали уровень пролиферации Ova-специфических Т-клеток с помощью окрашивания CFSE.

[0396] Степень пролиферации Ova-специфических Т-клеток оценивали по включению CFSE метки в Ova-реактивные OT-I CD8+ T-клетки. Для определения механизма презентации антиген-нагруженных TAPC, мышей с дефицитом MHC-I использовали в качестве мышей-реципиентов. Такой прием будет предотвращать презентацию антигенов Ova эндогенными мышиными APC за счет непрямого поглощения антигена погибающими SQZ’d Т-клетками и перекрестной презентации на MHC-I адоптивно перенесенным клеткам OT-I. Было обнаружено, что когда у мышей-реципиентов отсутствует MHC-I, то пролиферация Ova-специфических OT-I клеток все еще имеет место, свидетельствуя о том, что SQZ’d T APCs презентируют антиген непосредственно (фиг. 15). Полученные данные подтверждают прямую презентацию антигена, который был доставлен SQZ-опосредованно внутриклеточно.

Пример 16

[0397] Для оценки возможности SQZ изменять продукцию цитокинов, в Т-клетки доставляли CpG с использованием устройства SQZ и оценивали на способность изменять уровни цитокинов Т-клеток на мышиной модели in vitro. Уровни цитокинов в супернатанте определяли с использованием тест-набора для мультиплексного анализа цитокинов.

[0398] Самок мышей-реципиентов C57BL/6J праймировали Т-клетками от самок мышей-доноров C57BL/6J, выделяли и обрабатывали с использованием SQZ’d 200 мкг/мл CpG, и супернатанты собирали через 24 ч (N = 2). В супернатантах определяли цитокинов с помощью тест-набора для мультиплексного анализа цитокинов Millipore Milliplex и выражали в виде кратного изменения относительно необработанных Т-клеток.

[0399] Отсутствовали достоверные изменения между уровнями цитокинов в супернатанте Т-клеток, нагруженных CpG с использованием SQZ, по сравнению с необработанными контрольными клетками (фиг. 16). Полученные данные показывают, что доставка адъюванта с использованием SQZ достоверно не изменяет уровни цитокинов Т-клеток in vitro.

Пример 17

[0400] Для оценки возможности SQZ изменять продукцию цитокинов, в T-клетки доставляли Ova или Ova + CpG с использованием устройства SQZ и оценивали на способность изменять уровни цитокинов в сыворотке крови на мышиной модели in vivo. Цитокины сыворотки были профилированы с использованием тест-набора для мультиплексного анализа цитокинов.

[0401] Самок мышей-реципиентов C57BL/6J праймировали Т-клетками от самок мышей-доноров C57BL/6J, обрабатывали SQZ с доставкой 400 мкг/мл Ova или Ova + 200 мкг/мл CpG, и кровь отбирали из хвостовой вены через 6 ч и сердечной пункцией через 24 ч после праймирования. В сыворотке определяли уровни цитокинов с помощью тест-набора для мультиплексного анализа цитокинов Millipore Milliplex и выражали в виде кратного изменения по сравнению с необработанными Т-клетками.

[0402] Отсутствовали достоверные изменения между уровнями цитокинов в сыворотке мышей, праймированных Т-клетками, нагруженными Ova или Ova + CpG с использованием SQZ (фиг. 17). Кроме того, не наблюдали достоверных различий на 6 ч и 24 ч после праймирования. Полученные данные показывают, что доставка SQZ антигена +/- адъюванта существенно не изменяет уровни цитокинов в сыворотке in vivo.

Пример 18

[0403] В данном примере частично показано, что антигены, введенные в Т-клетки (Т-APC), быстро процессируются и непосредственно презентируются.

[0404] Для определения кинетики антигенпрезентации Т-клетками в качестве антигенпрезентирующих клеток (Т-APC), антиген доставляли в Т-клетки с помощью устройства SQZ, и присутствие минимального пептида, связанного с MHC-I, определяли во временной динамике с использованием иммуноокрашивания и проточной цитометрии.

[0405] В частности, выделяли мышиные Т-клетки от мышей C56BL/6J и обрабатывали с использованием SQZ без включения полезной нагрузки (SQZ: без антигена) или 200 мкг/мл белка Ova, нагруженного SQZ (SQZ: овальбумин - N = 3 технические повтора). На различные временные точки в интервале от 2 ч до 24 ч обработанные Т-клетки окрашивали антителом (25-D1.16), специфически распознающим минимальный эпитоп Ova (SIINFEKL; SEQ ID NO: 52), с проведением последующей проточной цитометрии. Любой минимальный эпитоп, который был процессирован из белка OVA и презентирован на MHC-I, будет обнаружен с помощью иммуноокрашивания, и степень презентации антигена можно определить проточной цитометрией.

[0406] Относительные популяции клеток, презентирующих различные уровни SIINFEKL (SEQ ID NO: 52) на MHC-I, представлены гистограммами (темно-серый цвет представляет SQZ: без антигена; светло-серый представляет SQZ: овальбумин), наложенными на 0, 2, 4 и 24 ч (фиг. 18А). Сдвиг вправо на гистограмме, представляющий SQZ:овальбумин, указывает на популяции с повышенным окрашиванием SIINFEKL (SEQ ID NO: 52) и, таким образом, на увеличение популяции клеток, презентирующих процессированный антиген на MHC-I; по сравнению с SQZ: контроль без антигена. Отмеченный сдвиг в нагруженных антигеном Т-АРС был очевиден через 2 ч, с небольшим снижением презентации антигена, которое наблюдали только через 24 ч. Относительный уровень презентации SIINFEKL (SEQ ID NO: 52) на MHC-I в расчете на клетку во временной динамике измеряли по средней интенсивности флуоресценции (MFI) клеток (фиг. 18B). Популяции SQZ:овальбумин показали заметную презентацию SIINFEKL (SEQ ID NO: 52) через 2 ч, с максимальной презентацией, наблюдаемой через 4 ч, с последующим небольшим снижением во времени, наблюдаемым между 4 ч и 24 ч. В течение измеренного периода времени не наблюдали различий в презентации антигена в контроле SQZ:без антигена. В совокупности полученные данные подтверждают, что SQZ-опосредованная нагрузка антигена в Т-клетки приводила к быстрой презентации антигена (2-4 ч).

Пример 19

[0407] В данном примере частично показано, что Т-клетки, которые были нагружены антигеном, ассоциированным с заболеванием (Т-АРС), с использованием устройства SQZ, эффективно индуцируют антигенспецифические Т-клеточные ответы in vitro.

[0408] Для определения способности человеческих Т-клеток, которые были нагружены антигеном, ассоциированным с заболеванием (Т-АРС), с использованием устройства SQZ, индуцировать антигенспецифический Т-клеточный ответ, Т-клетки нагружали с использованием устройства SQZ, CMV-ассоциированным антигеном, совместно культивировали с антигенспецифическими Т-клетками-респондерами, и измеряли уровни секреции воспалительных цитокинов с помощью ELISA.

[0409] В частности, человеческие Т-клетки выделяли от HLA-A2+ доноров и CMV pp65 SLP (50 мкМ) инкубировали с Т-клетками (Endo) или доставляли в Т-клетки с помощью SQZ (SQZ). Затем контрольные Endo Т-клетки или SQZ Т-клетки (60 тыс. клеток/лунку) инкубировали с Т-клетками-респондерами на pp65 (30 тыс. клеток/лунку) в соотношении 2:1 и совместно культивировали в присутствии IL-2 (100 Е/мл) и CpG 2006 (1 мкМ) в течение 24 ч. Затем собирали супернатанты и анализировали с помощью ELISA для определения уровней секреции IFN-γ, что указывает на степень антигенспецифической иммунной стимуляции in vitro.

[0410] По сравнению с Т-клетками, которые инкубировали с pp65 SLP (Endo), наблюдали значительное и статистически значимое увеличение стимуляции pp65-специфических респондеров Т-клетками, нагруженными с использованием SQZ, по данным определения IFN-γ ELISA. (P <0,005). Полученные данные показывают, что с помощью SQZ-нагрузки антигенов, ассоциированных с заболеванием, человеческие Т-клетки можно модифицировать таким образом, чтобы они стали эффективными APC в индукции антигенспецифических Т-клеточных ответов, ассоциированных с заболеванием, in vitro.

Пример 20

[0411] Для оценки значения адъюванта в возможности вакцины, нагруженной с использованием SQZ, индуцировать антигенспецифические лимфоциты, инфильтрирующие опухоль (TIL), клетки нагружали модельным антигеном, подвергали созреванию с адъювантом и вводили мышам, несущим опухоли. Относительный процент антигенспецифических Т-клеток, рекрутированных в опухоли, измеряли с использованием проточной цитометрии.

[0412] Самкам мышей C57BL/6J прививали в заднюю область правого бока опухолевые клетки TC1 (50 тыс. клеток/мышь) на сутки 0. На сутки 15 (прайм) мышиные Т-клетки получали из селезенки самок мышей-доноров C57BL/6J и нагружали предварительно приготовленным комплексом 5 мкМ E7 SLP (GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR; SEQ ID NO: 25) + 5 мкМ сывороточного альбумина мыши (MSA) с использованием SQZ (40 фунтов/кв. дюйм, сужение 3,5 мкм, комнатная температура) и инкубировали в течение 1 ч при 37°C. Самкам мышей-реципиентов C57BL/6J (10 мышей/группу) вводили ретроорбитально на сутки 15 либо 100 мкл носителя (PBS - без обработки), либо Т-клетки, нагруженные E7 (1M клеток/мышь) +/- CpG 1826 (25 мкг/мышь). На сутки 25 опухоли собирали и измеряли количество E7-специфических TIL с использованием проточной цитометрии.

[0413] Одни только SQZ-нагруженные T APC приводили к незначительному (приблизительно 15%), и статистически недостоверному увеличению числа E7-специфичных TIL, но при совместной инъекции с CpG наблюдали более высокое и достоверное увеличение количества TIL (55 %, ** P <0,01 по сравнению с одним T APC; *** P <0,0005 по сравнению с необработанным контролем). Полученные данные показывают, что совместное введение CpG вместе с T APC, нагруженными E7, приводило к существенно большему рекрутменту TIL по сравнению с одними T APC.

Пример 21

[0414] Для оценки продолжительности действия адъювантной вакцины T APC + в профилактическом опыте, данные, полученные на мышах, которым вводили T APC, сравнивали с необработанными мышами в отношении роста опухолей на опухолевой модели TC1, экспрессирующей ВПЧ E7, как в отношении начального ответа, так и после повторной прививки опухолевых клеток через 60 суток с графиком зависимости площади опухолей во временной динамике.

[0415] На сутки -14 отбирали спленоциты у самок мышей-доноров C57BL/6J и Т-клетки выделяли иммуномагнитным разделением. Затем мышиные Т-клетки нагружали предварительно приготовленным комплексом 20 мкМ E7 SLP (GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR; SEQ ID NO: 25) + 20 мкМ сывороточного альбумина мыши (MSA) с использованием SQZ (45 фунт/кв. дюйм; сужение 3,5 мкм) и инкубировали в течение 1 ч при 37°C. Самкам мышей-реципиентов C57BL/6J (10 мышей/группу, за исключением группы I без обработки, которая составляла 20 мышей/группу) вводили ретроорбитально 100 мкл либо носителя (PBS - без обработки), либо Т-клеток, нагруженных E7 (1 тыс. клеток/мышь) + CpG 1826 (25 мкг/мышь) [прайм]. На сутки -7 у самок мышей-доноров C57BL/6J отбирали селезенки, выделяли Т-клетки и подвергали обработке SQZ’d и вводили мышам-реципиентам аналогично тому, как на сутки -14 [буст]. На сутки 0 самкам мышей C57BL/6J прививали в заднюю область правого бока (за исключением 10 необработанных мышей из группы 2, которым не прививали опухолевые клетки до суток 64, опухолевые клетки TC1 (50 тыс. клеток/мышь). Рост опухолей TC-1 измеряли, начиная с 1 недели после прививки опухолей, два раза в неделю и сравнивали с ростом опухолей у необработанных мышей в течение 120 суток.

[0416] Рост опухолей, измеренный по формуле ((длина × ширина²)/2), сравнивали между мышами из необработанной группы и из группы, обработанной T APC, с прививкой опухолевых клеток на сутки 0, и хотя все мыши достигали гуманной конечной точки в группе без обработки, к суткам 47 наблюдали достоверную задержку роста опухолей в группе T APC у всех, кроме 2 мышей с T APC, с остальными 8 мышами, которые оставались без опухолей до повторной прививки опухолей. Интересно отметить, что когда необработанным мышам, которым имплантировали опухоли на сутки 64, и по сравнению с мышами, получавшими Т АРС, у которых опухоли были повторно имплантированы в противоположный бок, все еще наблюдали задержку роста опухолей, при этом у трех мышей рост измеримых опухолей отсутствовал даже после повторной прививки опухолевых клеток. На основе полученных данных можно предположить, что обработка Т-АРС, нагруженных Е7 + адъювантом может не только приводить к антигенспецифическому подавлению роста опухолей, но также к профилактике роста опухолей, которая может продолжаться более 100 суток, несмотря на повторную прививку опухолей.

Пример 22

[0417] Для оценки влияния различной концентрации T APC, а также схем прайм-буст в условиях оценки терапевтической активности вакцины, мышей, получавших T APC (в нескольких концентрациях и схемах прайм-буст), сравнивали с необработанными мышами в отношении роста на модели ВПЧ-ассоциированной опухоли TC1, экспрессирующей E7, с графиком зависимости площади опухолей во временной динамике.

[0418] На сутки 0 самкам мышам C57BL/6J в заднюю область правого бока прививали опухолевые клетки TC1 (50 тыс. клеток/мышь). На сутки 10 (прайм) мышиные Т-клетки получали из селезенки самок мышей-доноров C57BL/6J иммуномагнитным разделением и нагружали 20 мкМ SLP E7 (GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR; SEQ ID NO: 25) + 20 мкМ сывороточного альбумина мыши (MSA) через SQZ (45 фунт/кв. дюйм; сужение 3,5 мкм) и инкубировали в течение 1 ч при 37°C. Затем самкам мышей-реципиентов C57BL/6J (10 мышей/группу) вводили ретроорбитально 100 мкл либо носителя (PBS), либо Т-АРС (0,25 или 1 тыс. клеток/мышь) + CpG 1826 (25 мкг/мышь). На сутки 17 мыши из группы со схемой прайм/буст получали вторую инъекцию Т-АРС аналогично тому, как на сутки 10. Рост опухолей TC-1 измеряли два раза в неделю, начиная с 1 недели после прививки опухолей, и сравнивали с ростом опухолей у необработанных мышей до 66 суток.

[0419] Результаты оценки роста опухолей, измеренного по формуле ((длина × ширина²)/2), свидетельствовали о том, что в группе с низкой дозой Т АРС (0,25 М клеток/мышь) + CpG (только прайм) имела место только небольшая задержка скорости роста опухолей по сравнению с необработанными мышами. Включение буст-обработки на сутки 17 с низкой дозой T APC + CpG (0,25 М прайм/буст) приводило к усилению ингибирования роста опухолей по сравнению с той же концентрацией только с прайм-оброботкой и гораздо более сильным ингибированием по сравнению с необработанными мышами. Повышение дозы антиген-нагруженных Т-АРС до 1 тыс. клеток/мышь (только прайм) приводило к незначительному ингибированию роста опухолей по сравнению с более низкой дозой Т-АРС + CpG (только прайм). Интересно отметить, что использование высоких доз T APC + CpG (только прайм) приводило к лучшей защите от роста опухоли, где регрессирование опухолей имело место между 20-40 сутками и наиболее высокому уровню ингибирования роста во всех опытных группах. В совокупности полученные данные подчеркивают, что повышенная доза клеток, включение адъюванта или схемы дозирования «прайм + буст» могут повысить эффективность вакцины Т APC.

Список последовательностей

SEQ ID NO Последовательность Описание 1 TIHDIILECV HPV16-E6(29-38), человеческий эпитоп 2 EVYDFAFRDL HPV16-E6(48-57), мышиный эпитоп 3 YMLDLQPETT HPV16-E7(11-20), человеческий эпитоп 4 RAHYNIVTF HPV16-E7(49-57), мышиный эпитоп 5 LPQLSTELQT HPV16-E6(19-28) N-концевой полипептид, человеческий 6 QLCTELQT HPV16-E6(21-28) N- N-концевой полипептид, человеческий 7 KQQLLRR HPV16-E6(41-47) N- N-концевой полипептид, нативный мышиный 8 VYSKQQLLRR HPV16-E6(38-47) N- N-концевой полипептид, классический мышиный 9 MHGDTPTLHE HPV16-E7(1-10) N-концевой полипептид, человеческий 10 GQAEPD HPV16-E7(43-48) N-концевой полипептид, мышиный 11 YSKQQLLRREVYDFAF HPV16-E6(39-54) С-концевой полипептид, человеческий 12 YCKQQLL HPV16-E6(39-45) С-концевой полипептид, человеческий 13 CIVYRDGN HPV16-E6(58-65) С-концевой полипептид, нативный мышиный 14 SIVYRDGNPYAVSDK HPV16-E6(58-72) С-концевой полипептид, классический мышиный 15 DLYCYEQLNDSSEEE HPV16-E7(21-35) С-концевой полипептид, человеческий 16 CCKCDSTLRLCVQSTHVDIR HPV16-E7(58-77) С-концевой полипептид, нативный мышиный 17 SSKSDSTLRLSVQSTHVDIR HPV16-E7(58-77) С-концевой полипептид, классический мышиный 18 LPQLSTELQTTIHDIILECVYSKQQLLRREVYDFAF HPV16-E6(19-54) SLP, человеческий 19 QLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLL HPV16-E6(21-45) SLP, человеческий 20 KQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGN HPV16-E6(41-65) SLP, нативный мышиный 21 VYSKQQLLRREVYDFAFRDLSIVYRDGNPYAVSDK HPV16-E6(38-72) SLP, классический мышиный 22 MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEE HPV16-E7(1-35) SLP, человеческий 23 QLCTELQTYMLDLQPETTYCKQQLL HPV16-E7.6 SLP, человеческий 24 GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR HPV16-E7(43-77) SLP, нативный мышиный 25 GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR HPV16-E7(43-77) SLP, классический мышиный 26 ggGGTCAACGTTGAgggggg
Основания, указанные заглавными буквами, представляют фосфодиэфир, и основания, указанные строчными буквами - фосфоротиоат ODN 1585 (класс A, мышиный-специфический) 27 ggGGGACGA:TCGTCgggggg
Основания, указанные заглавными буквами, представляют фосфодиэфир, и основания, указанные строчными буквами - фосфоротиоат ODN 2216 (класс A, человеческий-селективный) 28 gggGACGAC:GTCGTGgggggg
Основания, указанные заглавными буквами, представляют фосфодиэфир, и основания, указанные строчными буквами - фосфоротиоат ODN 2336 (класс A, человеческий предпочтительный) 29 Tccatgacgttcctgatgct
Основания, указанные заглавными буквами, представляют фосфодиэфир, и основания, указанные строчными буквами - фосфоротиоат ODN 1668 (класс B, мышиный специфический) 30 Tccatgacgttcctgacgtt
Основания представляют фосфоротиоат ODN 1826 (класс B, мышиный специфический) 31 Tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt
Основания представляют фосфоротиоат ODN 2006 (класс B, человеческий селективный) 32 tcg tcg ttg tcg ttt tgt cgt t
Основания представляют фосфоротиоат ODN 2007 (класс B, бычий/свиной) 33 tcg acg ttc gtc gtt cgt cgt tc
Основания представляют фосфоротиоат ODN BW006 (класс B, человеческий & мышиный) 34 tcg cga cgt tcg ccc gac gtt cgg ta
Основания представляют фосфоротиоат ODN D-SL01 (класс B, поливидовой) 35 tcgtcgttttcggcgc:gcgccg
Основания представляют фосфоротиоат ODN 2395 (класс C, человеческий/мышиный) 36 tcgtcgtcgttc:gaacgacgttgat
Основания представляют фосфоротиоат ODN M362 (класс C, человеческий/мышиный) 37 tcg cga acg ttc gcc gcg ttc gaa cgc gg
Основания представляют фосфоротиоат ODN D-SL03 (класс C, поливидовой) 38 MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEE E7 39 LYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVT E7 40 GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR E7 41 TLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP E7 42 MHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHD E6 43 LPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVY E6 44 KQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGN E6 45 RDLCIVYRDGNPYAVCDKCLKFYSKI E6 46 DKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTL E6 47 HYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIR E6 48 YGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLCPEEK E6 49 RCINCQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWT E6 50 DKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQL E6

--->

Список последовательностей

<110> SQZ Biotechnologies Company

<120> ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ ДОСТАВКА БИОМОЛЕКУЛ ДЛЯ МОДУЛЯЦИИ ИММУННОГО ОТВЕТА

<130> 75032-20015.40

<160> 52

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Неизвестно

<220>

<223> Вирус папилломы человека

<400> 1

Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val

1 5 10

<210> 2

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Неизвестно

<220>

<223> Вирус папилломы человека

<400> 2

Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu

1 5 10

<210> 3

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Неизвестно

<220>

<223> Вирус папилломы человека

<400> 3

Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr

1 5 10

<210> 4

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Неизвестно

<220>

<223> Вирус папилломы человека

<400> 4

Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe

1 5

<210> 5

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 5

Leu Pro Gln Leu Ser Thr Glu Leu Gln Thr

1 5 10

<210> 6

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Неизвестно

<220>

<223> Вирус папилломы человека

<400> 6

Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr

1 5

<210> 7

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Неизвестно

<220>

<223> Вирус папилломы человека

<400> 7

Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg

1 5

<210> 8

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 8

Val Tyr Ser Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg

1 5 10

<210> 9

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Неизвестно

<220>

<223> Вирус папилломы человека

<400> 9

Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu

1 5 10

<210> 10

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Неизвестно

<220>

<223> Вирус папилломы человека

<400> 10

Gly Gln Ala Glu Pro Asp

1 5

<210> 11

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 11

Tyr Ser Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe

1 5 10 15

<210> 12

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Неизвестно

<220>

<223> Вирус папилломы человека

<400> 12

Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu

1 5

<210> 13

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Неизвестно

<220>

<223> Вирус папилломы человека

<400> 13

Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn

1 5

<210> 14

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 14

Ser Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Ser Asp Lys

1 5 10 15

<210> 15

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Неизвестно

<220>

<223> Вирус папилломы человека

<400> 15

Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu

1 5 10 15

<210> 16

<211> 20

<212> БЕЛОК

<213> Неизвестно

<220>

<223> Вирус папилломы человека

<400> 16

Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His

1 5 10 15

Val Asp Ile Arg

20

<210> 17

<211> 20

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 17

Ser Ser Lys Ser Asp Ser Thr Leu Arg Leu Ser Val Gln Ser Thr His

1 5 10 15

Val Asp Ile Arg

20

<210> 18

<211> 36

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 18

Leu Pro Gln Leu Ser Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile

1 5 10 15

Leu Glu Cys Val Tyr Ser Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr

20 25 30

Asp Phe Ala Phe

35

<210> 19

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 19

Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu

1 5 10 15

Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu

20 25

<210> 20

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 20

Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp

1 5 10 15

Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn

20 25

<210> 21

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 21

Val Tyr Ser Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala

1 5 10 15

Phe Arg Asp Leu Ser Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val

20 25 30

Ser Asp Lys

35

<210> 22

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 22

Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln

1 5 10 15

Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser

20 25 30

Glu Glu Glu

35

<210> 23

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 23

Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu

1 5 10 15

Thr Thr Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu

20 25

<210> 24

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 24

Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys

1 5 10 15

Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val

20 25 30

Asp Ile Arg

35

<210> 25

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 25

Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Ser

1 5 10 15

Ser Lys Ser Asp Ser Thr Leu Arg Leu Ser Val Gln Ser Thr His Val

20 25 30

Asp Ile Arg

35

<210> 26

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 26

ggggtcaacg ttgagggggg 20

<210> 27

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 27

gggggacgat cgtcgggggg 20

<210> 28

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 28

ggggacgacg tcgtgggggg g 21

<210> 29

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 29

tccatgacgt tcctgatgct 20

<210> 30

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 30

tccatgacgt tcctgacgtt 20

<210> 31

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 31

tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24

<210> 32

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 32

tcgtcgttgt cgttttgtcg tt 22

<210> 33

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 33

tcgacgttcg tcgttcgtcg ttc 23

<210> 34

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 34

tcgcgacgtt cgcccgacgt tcggta 26

<210> 35

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 35

tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg 22

<210> 36

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 36

tcgtcgtcgt tcgaacgacg ttgat 25

<210> 37

<211> 29

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 37

tcgcgaacgt tcgccgcgtt cgaacgcgg 29

<210> 38

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 38

Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln

1 5 10 15

Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser

20 25 30

Glu Glu Glu

35

<210> 39

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 39

Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu

1 5 10 15

Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn

20 25 30

Ile Val Thr

35

<210> 40

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 40

Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys

1 5 10 15

Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val

20 25 30

Asp Ile Arg

35

<210> 41

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 41

Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu

1 5 10 15

Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser

20 25 30

Gln Lys Pro

35

<210> 42

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 42

Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro

1 5 10 15

Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp

20 25 30

<210> 43

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 43

Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile

1 5 10 15

Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr

20 25 30

<210> 44

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 44

Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp

1 5 10 15

Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn

20 25

<210> 45

<211> 26

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 45

Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys

1 5 10 15

Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile

20 25

<210> 46

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 46

Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr

1 5 10 15

Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu

20 25

<210> 47

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 47

His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn

1 5 10 15

Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg

20 25

<210> 48

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 48

Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu

1 5 10 15

Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys

20 25 30

<210> 49

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 49

Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg

1 5 10 15

His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr

20 25 30

<210> 50

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 50

Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg

1 5 10 15

Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu

20 25 30

<210> 51

<211> 24

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<220>

<221> Вариант

<222> 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17

<223> Xaa = любая аминокислота

<400> 51

Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10 15

Xaa Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu

20

<210> 52

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 52

Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu

1 5

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к модифицированным Т-клеткам, и может быть использовано в медицине для стимуляции иммунного ответа на антиген ВПЧ и лечения ВПЧ-ассоциированного рака. Предложена модифицированная Т-клетка, содержащая антиген вируса папилломы человека (ВПЧ), происходящий из ВПЧ-16 или ВПЧ-18, и адъювант, который выбран из CpG-олигодезоксинуклеотида (ODN), IFN-α, агонистов STING, агонистов RIG-I, имихимода (R837), резикимода (R848) или липополисахарида (LPS). Изобретение обеспечивает получение модифицированной Т-клетки, способной индуцировать эндогенный специфический иммунный ответ против ВПЧ-антигена при введении нуждающемуся в этом субъекту. 5 н. и 65 з.п. ф-лы, 22 ил., 1 табл., 22 пр.

1. Модифицированная Т-клетка, содержащая антиген вируса папилломы человека (ВПЧ) и адъювант, причем антиген ВПЧ происходит из ВПЧ-16 или ВПЧ-18, причем адъювант выбран из CpG-олигодезоксинуклеотида (ODN), IFN-α, агонистов STING, агонистов RIG-I, имихимода, резикимода или липополисахарида (LPS), где нуклеиновая кислота, кодирующая антиген ВПЧ, адъювант или оба, была внутриклеточно доставлена в модифицированную Т-клетку путем пропускания клеточной суспензии, содержащей входную Т-клетку, через деформирующее клетку сужение, что вызывает пертурбации входной Т-клетки, так что нуклеиновая кислота, кодирующая антиген ВПЧ, адъювант или оба, проникала во входную Т-клетку через пертурбации, причем после проникновения во входную T-клетку антиген ВПЧ, адъювант или оба, кодируемые нуклеиновой кислотой, экспрессировались во входной T-клетке с получением модифицированной T-клетки, и причем модифицированная Т-клетка способна индуцировать эндогенный специфический иммунный ответ против ВПЧ-антигена при введении нуждающемуся в этом субъекту.

2. Модифицированная Т-клетка по п.1, где пертурбированная входная Т-клетка была инкубирована с нуклеиновой кислотой, кодирующей антиген ВПЧ, адъювант или оба, так что пертурбированная входная Т-клетка контактировала с нуклеиновой кислотой, кодирующей антиген ВПЧ, адъювант или оба.

3. Модифицированная Т-клетка по п.1, где к входной Т-клетке была приложена деформирующая сила, когда она проходила через деформирующее клетку сужение, что вызвало тем самым пертурбации входной Т-клетки.

4. Модифицированная Т-клетка по п.1, которая была дополнительно модифицирована таким образом, чтобы демонстрировать повышенную жизнеспособность и/или функцию по сравнению с соответствующей модифицированной Т-клеткой, которая не была дополнительно модифицирована.

5. Модифицированная Т-клетка по п.4, где дополнительная модификация включает инкубацию входной Т-клетки и/или модифицированной Т-клетки с агентом, причем агент включает (i) соединение, которое способно усиливать эндоцитоз, (ii) стабилизирующий агент, (iii) кофактор или комбинацию (i)-(iii).

6. Модифицированная Т-клетка по п.1, где диаметр сужения меньше диаметра входной Т-клетки.

7. Модифицированная Т-клетка по п.6, где диаметр сужения составляет от приблизительно 20% до приблизительно 99% от диаметра входной Т-клетки.

8. Модифицированная Т-клетка по п.7, где диаметр сужения составляет от приблизительно 20% до приблизительно 60% от диаметра входной Т-клетки.

9. Модифицированная Т-клетка по п.1, где антиген ВПЧ и/или адъювант находятся в цитозоле и/или везикуле модифицированной Т-клетки.

10. Модифицированная Т-клетка по п.9, где везикула представляет собой эндосому.

11. Модифицированная Т-клетка по п.1, где антиген ВПЧ и/или адъювант находятся во многих компартментах модифицированной Т-клетки.

12. Модифицированная Т-клетка по п.1, где антиген ВПЧ связан с поверхностью модифицированной Т-клетки.

13. Модифицированная Т-клетка п.1, где адъювант представляет собой CpG ODN.

14. Модифицированная Т-клетка по п.13, где CpG ODN находится в концентрации приблизительно 50 мкг/мл, приблизительно 100 мкг/мл или приблизительно 200 мкг/мл.

15. Модифицированная Т-клетка по п.13, где CpG ODN представляет собой CpG ODN класса A, CpG ODN класса B или CpG ODN класса C.

16. Модифицированная Т-клетка по п.1, где антиген ВПЧ включает HLA-A2-рестриктированный пептид, полученный из белка E6 и/или белка E7 ВПЧ.

17. Модифицированная Т-клетка по п.16, где HLA-A2-рестриктированный пептид содержит аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 1-4.

18. Модифицированная Т-клетка по п.17, где антиген ВПЧ содержит аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 18-25.

19. Модифицированная Т-клетка по п.1, которая содержит один или более дополнительных антигенов.

20. Модифицированная Т-клетка по п.1, где антиген ВПЧ содержит одну или более гетерологичных пептидных последовательностей.

21. Модифицированная Т-клетка по п.20, где одна или более гетерологичных пептидных последовательностей конъюгированы с N-концом и/или C-концом антигена ВПЧ.

22. Модифицированная Т-клетка по п.21, где одна или более гетерологичных пептидных последовательностей конъюгированы с N-концом антигена ВПЧ и содержат аминокислотную последовательность, указанную в любой из SEQ ID NO: 5-10.

23. Модифицированная Т-клетка по п.21, где одна или более гетерологичных пептидных последовательностей конъюгированы с C-концом антигена ВПЧ и содержат аминокислотную последовательность, указанную в любой из SEQ ID NO: 11-17.

24. Модифицированная Т-клетка по п.1, где антиген ВПЧ способен процессироваться в пептид, рестриктированный классом I MHC, и/или пептид, рестриктированный классом II MHC.

25. Модифицированная Т-клетка по п.1, которая содержит адъювант в концентрации от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 1 мМ.

26. Модифицированная Т-клетка по п.1, которая содержит антиген ВПЧ в концентрации от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 1 мМ.

27. Модифицированная Т-клетка по п.1, где соотношение антигена ВПЧ и адъюванта, присутствующих в модифицированной Т-клетке, составляет от приблизительно 10000:1 до приблизительно 1:10000.

28. Модифицированная Т-клетка по п.5, где агент включает альбумин.

29. Модифицированная Т-клетка по п.28, где альбумин представляет собой мышиный альбумин, бычий альбумин или человеческий альбумин.

30. Модифицированная Т-клетка по п.5, где агент включает катион двухвалентного металла, глюкозу, АТФ, калий, глицерин, трегалозу, D-сахарозу, PEG1500, L-аргинин, L-глутамин, ЭДТА или их комбинации.

31. Модифицированная Т-клетка по п.29, где мышиный альбумин содержит сывороточный альбумин мыши (MSA).

32. Модифицированная Т-клетка по п.1, которая была дополнительно модифицирована таким образом, чтобы демонстрировать увеличенную экспрессию одной или более костимулирующих молекул.

33. Модифицированная Т-клетка по п.32, где костимулирующая молекула включает B7-H2(ICOSL), B7-1(CD80), B7-2 (CD86), CD70, LIGHT, HVEM, CD40, 4-1BBL, OX40L, TL1A, GITRL, CD30L, TIM4, SLAM, CD48, CD58, CD155, CD112 или их комбинации.

34. Модифицированная Т-клетка по п.32, которая содержит нуклеиновую кислоту, которая приводит к повышенной экспрессии одной или более костимулирующих молекул.

35. Модифицированная Т-клетка по п.1, где модифицированная Т-клетка содержит дополнительную модификацию для модуляции экспрессии молекул MHC класса I.

36. Модифицированная Т-клетка по п.1, где модифицированная Т-клетка содержит дополнительную модификацию для модуляции экспрессии молекул MHC класса II.

37. Модифицированная Т-клетка по п.1, которая была дополнительно модифицирована таким образом, чтобы демонстрировать увеличенный период полужизни в кровотоке при введении субъекту.

38. Модифицированная Т-клетка по п.1, где модифицированная Т-клетка включает Т-хелперы, цитотоксические Т-клетки, Т-клетки памяти, естественные Т-клетки-киллеры или их комбинации.

39. Модифицированная Т-клетка по п.1, где модифицированная Т-клетка включает CD3+ Т-клетки, CD4+ Т-клетки, CD8+ Т-клетки, CD45RA+ Т-клетки, CD45RO+ Т-клетки, γδ-Т-клетки или их комбинации.

40. Композиция для стимуляции иммунного ответа на антиген ВПЧ у нуждающегося в этом субъекта, содержащая эффективное количество модифицированной Т-клетки по любому из пп. 1-39 и один или более эксципиентов.

41. Фармацевтическая композиция для стимуляции иммунного ответа на антиген ВПЧ у нуждающегося в этом субъекта, содержащая эффективное количество модифицированной Т-клетки по любому из пп. 1-39 и фармацевтически приемлемый носитель.

42. Способ стимуляции иммунного ответа на антиген ВПЧ у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту модифицированной Т-клетки по любому из пп. 1-39, композиции по п.40 или фармацевтической композиции по п.41.

43. Способ лечения ВПЧ-ассоциированного рака у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту модифицированной Т-клетки по любому из пп. 1-39, композиции по п.40 или фармацевтической композиции по п.41.

44. Способ по п.43, где рак включает рак, ассоциированный с ВПЧ.

45. Способ по п.42, где модифицированная Т-клетка является аллогенной для субъекта.

46. Способ по п.43, где модифицированная Т-клетка является аллогенной для субъекта.

47. Способ по п.42, где модифицированная Т-клетка является аутологичной для субъекта.

48. Способ по п.43, где модифицированная Т-клетка является аутологичной для субъекта.

49. Способ по п.42, дополнительно включающий введение субъекту второго адъюванта.

50. Способ по п.43, дополнительно включающий введение субъекту второго адъюванта.

51. Способ по п.49, где второй адъювант включает IFN-α, LPS, CpG ODN или их комбинацию.

52. Способ по п.50, где второй адъювант включает IFN-α, LPS, CpG ODN или их комбинацию.

53. Способ по п.49, где модифицированную Т-клетку и второй адъювант вводят вместе или одновременно.

54. Способ по п.50, где модифицированную Т-клетку и второй адъювант вводят вместе или одновременно.

55. Способ по п.49, где модифицированную Т-клетку и второй адъювант вводят последовательно.

56. Способ по п.50, где модифицированную Т-клетку и второй адъювант вводят последовательно.

57. Способ по п.55, где модифицированную Т-клетку вводят до введения второго адъюванта.

58. Способ по п.56, где модифицированную Т-клетку вводят до введения второго адъюванта.

59. Способ по п.55, где модифицированную Т-клетку вводят после введения второго адъюванта.

60. Способ по п.56, где модифицированную Т-клетку вводят после введения второго адъюванта.

61. Способ по п.42, где введение модифицированной Т-клетки субъекту приводит к активации и/или экспансии цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL), специфических для антигена.

62. Способ по п.43, где введение модифицированной Т-клетки субъекту приводит к активации и/или экспансии цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL), специфических для антигена.

63. Способ по п.42, где введение модифицированной Т-клетки субъекту приводит к активации и/или экспансии Т(Th)-хелперов.

64. Способ по п.43, где введение модифицированной Т-клетки субъекту приводит к активации и/или экспансии Т(Th)-хелперов.

65. Способ по п.42, где количество модифицированных Т-клеток, введенных субъекту, составляет от приблизительно 1×10⁶ до приблизительно 1×10¹² клеток.

66. Способ по п.43, где количество модифицированных Т-клеток, введенных субъекту, составляет от приблизительно 1×10⁶ до приблизительно 1×10¹² клеток.

67. Способ по п.42, где способ включает многократные введения модифицированной Т-клетки.

68. Способ по п.43, где способ включает многократные введения модифицированной Т-клетки.

69. Способ по п.67, где интервал времени между двумя последовательными введениями модифицированной Т-клетки составляет от приблизительно 1 суток до приблизительно 30 суток.

70. Способ по п.68, где интервал времени между двумя последовательными введениями модифицированной Т-клетки составляет от приблизительно 1 суток до приблизительно 30 суток.