СПОСОБ РЕГЕНЕРАЦИИ МИКРОПОБЕГОВ HYSSOPUS OFFICINALIS L. В УСЛОВИЯХ IN VITRO Российский патент 2014 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к биотехнологии получения посадочного материала и может быть использовано для быстрого размножения, селекции и генетических манипуляций иссопа (Hyssopus officinalis L.) в условиях in vitro.

Известен способ получения микропобегов H.officinalis в культуре in vitro с использованием вегетативных почек Lt C.L. Multiplication in vitro de I'Husope (Hyssopus officinalis L.) // Revue Suisse de Vitic. Arboric. Hortic. - 1987.-V.19, №6. - P. 363-367. Вегетативные почки иссопа, отобранные от материнских растений, после стерилизации гипохлоритом кальция помещают на питательную среду, которая содержит макро- и микроэлементы на основе Мурасиге и Скуга (1962) - МС, дополнена 3% сахарозой, 0,7 % агаром (Difco Bacto-Agar, Germany), 1,0 мг/л тиамином, 0,5 мг/л пиридоксином, 0,5 мг/л никотиновой кислотой, и используют 100 мг/л раствора: 4,44 мкМ 6-бензиламинопурина (БАП), 1 мкМ 3-индолилмасляной кислоты (ИМК) и 0,57 мкМ гибереловой кислоты (ГК). Среднее количество микропобегов на эксплант достигает 6±1,5 (при концентрации БАП - 4,44 мкМ и ИМК - 0,49 мкМ).

Недостатком способа является низкий коэффициент размножения микропобегов, использование морфогенетических потенций только одного экспланта (вегетативная почка).

Известен способ регенерации микропобегов из листовых эксплантов Actinidia deliciosa в культуре in vitro, который использовали как прототип (Заявка № 2002120668 от 27.12.2002 г.). Метод включает в себя отбор листовых эксплантов от растений, полученных в культуре in vitro, и культивирование высечек листа на питательной среде, которая содержит половинную концентрацию макро- и микросолей, витамины МС, дополненной фитогормонами - БАП и индолилуксусной кислотой (ИУК). Через 4 недели культивирования на листовых эксплантах формируются адвентивные почки и микропобеги. Культивирование происходит при температуре 25°С, 16-часовом фотопериоде и интенсивном освещении 2-3 клк.

При использовании данного способа, с целью получения микропобегов из листовой ткани иссопа, культивируя их на питательной среде с БАП и ИУК, не удавалось добиться массового образования адвентивных почек из листовых эксплантов.

В основу изобретения поставлена задача: усовершенствовать способ регенерации растений из листовой ткани в условиях in vitro за счет подбора условий культивирования листовых дисков H.officinalis с целью максимального выхода генетически однородного растительного материала.

Поставленная задача решается тем, что в способе прямой регенерации микропобегов H.officinalis, которая состоит из отделения листовых эксплантов от растений, полученных в культуре in vitro, и культивирования эксплантов на питательной среде, которая содержит половинную концентрацию макро- и микросолей, витамины на основе МС и фитогормоны, в соответствии с изобретением на питательную среду в качестве фитогормона вводят вещество цитокининового типа действия, листовые экспланты иссопа отделяют от микропобегов после 4-5 пассажа в культуре in vitro и их культивирование проводят при низкой интенсивности освещения.

Существенные признаки заявленного способа имеют причинно-следственную связь с достигнутым результатом. В случае использования высечек листа с микропобегами иссопа, после первых трех субкультивирований на листовых эксплантах формировался каллус или единичные адвентивные почки, которые в дальнейшем не образовывали микропобеги. В случае использования высечек листа с микропобегами иссопа после 4-5 пассажей в культуре in vitro интенсивность образования адвентивных почек и регенерация микропобегов достигали 90%. В случае использования высечек листа с микропобегами иссопа после 6-8 пассажей наблюдали массовую регенерацию микропобегов, однако основная их часть была витрифицирована (обезвожена) и не способна для дальнейшего размножения.

Частота побегообразования увеличивалась при снижении интенсивности освещения до 1-1,5 клк и достигала 90%. Повышение интенсивности освещения до 2-3 клк (стандартные параметры для большинства растительных объектов) снижало частоту регенерации микропобегов до 50-60%.

В качестве вещества цитокининового типа действия, которое индуцирует образование и развитие меристем, а также регенерацию микропобегов в питательной среде, использовали тидиазурон (TDZ) - C₉H₈N₄OS.

Предложенный способ выполняется таким образом: приготавливают питательную среду согласно существующей методике. Состав питательных сред представлен в таблице 1.

Состав питательной среды для размножения растений иссопа

Таблица 1

Компоненты Питательные среды для разных этапов размножения   1 2 3   Культура вегетативных почек Культура листовых дисков Укоренение in vitro   Макроэлементы, мг/л: NH₄NO₃ 825,0 825,0 412,5 KNO₃ 950,0 950,0 475,0 СаС1₂·2Н₂О 220,0 220,0 110,0 MgSO₄ ^.7H₂O 185,0 185,0 92,5 КН₂РО₄ 85,0 85,0 42,5 Na₂EDTA 37,3 37,3 37,3 FeSO₄·7H₂O 27,8 27,8 27,8   Микроэлементы, мг/л: Н₃ВО₃ 6,2 6,2 3,1 MgSO₄·4H₂O 22,3 22,3 11,15 ZnSO₄·7H₂O 8,6 8,6 4,3 KJ 0,83 0,83 0,415 Na₂M₀O₄·2H₂O 0,25 0,25 0,125 CuSO₄·6H₂O 0,025 0,025 0,0125   Органические вещества: Глицин, мг/л 2,0 2,0 2,0 Мезоинозит, мг/л 50,0 50,0 25,0 Никотиновая кислота, мг/л 0,5 0,5 0,5 Пиридоксин - НСl,
мг/л 0,5 0,5 0,5 Тиамин - НСl, мг/л 0,1 0,1 0,1 Зеатин, мкМ 2,28 - - Тидиазурон, мкМ - 4,0-7,0 - Кинетин, мкМ 4,6 - - ИМК, мкМ 0,49 - 8,0-11,0 Сахароза, мг/л 30000,0 30000,0 15000,0 Агар, мг/л 6000,0 6000,0 6000,0 рН 5,6 5,6 5,6

Сегмент микропобега иссопа с латеральной почкой помещают на питательную среду для культивирования вегетативных почек. Интенсивность освещения составляет 2,5-3 клк, температура 25±1°С, фотопериод 16 часов. Через пять суток наблюдают образование микропобегов. Нормально сформированные микропобеги без морфологических изменений через 2 недели культивирования удлиняются до 3-4 см. Их микрочеренкуют на сегменты с латеральной почкой и снова помещают на исходную среду №1 (табл.1). Микрочеренкование производят через 2-3 недели культивирования. Вначале коэффициент размножения не превышает 1:2, но после 4-5 пассажа достигает 1:4. У листьев микропобегов после 4-5 субкультивирования вырезают диски, которые помещают на питательную среду №2 (табл.1), которая содержит половинную концентрацию макроэлементов, полный набор микроэлементов и витаминов по МС, дополненную цитокинином - тидиазуроном в концентрации 4,0-7,0 мкМ (табл.2). Из данных таблицы видно, что максимальное количество адвентивных почек и микропобегов образуется на листовых эксплантатах после 8 недель при оптимальной концентратции тидиазурона. Через 8 недель культивирования листовых эксплантов происходит активное формирование адвентивных почек (16-20 шт./эксплант), при концентрации тидиазурона 9,0 мкМ листовые экспланты формируют каллус.

Влияние количества пассажей микропобегов на регенеративную способность листовых дисков подтверждается данными таблицы 3. Из данных таблицы видно, что листовые экспланты, взятые с микропобегов иссопа после 3-х субкультивирований в условиях in vitro, образуют каллус; адвентивные почки и микропобеги отсутствуют. Максимальное количество адвентивных почек и побегов образуется на эксплантах, отобранных с листовых микропобегов иссопа, после 4-5 субкультивирований в условиях in vitro. После 6-8 пассажей на листовых эксплантах образуется масса обезвоженных и в дальнейшем нежизнеспособных микропобегов иссопа.

Таблица 2

Влияние концентрации тидиазурона на частоту регенерации микропобегов иссопа из листовых эксплантов условиях in vitro

Концентрация тидиазурона, мкМ Количество листовых эксплантов с микропобегами, % (*) Форма 80882 Форма 38285 4 недели 8 недель 4 недели 8 недель 0,5 1,2±0,1 8,0±1,4 1,5±0,1 9,0±1,2 1,0 1,5±0,1 8,0±1,4 2,0±0,2 10,0±3,5 3,0 10,0±2,0 20,0±2,5 20,0±3,0 40,0±7,9 6,0 25,0±3,0 55,0±3,0 45,0±5,0 90,0±4,0 9,0 5,0±0,5 9,0±1,6 10,0±2,0 20,0±2,5

(*)форма 80882 - иссоп с синим окрашиванием венчика цветка; форма 38285 - иссоп с розовым окрашиванием венчика цветка.

Таблица 3

Влияние количества субкультивирований микропобегов на регенерационную

способность листовых эксплантов иссопа в условиях in vitro

№ пассажа Регенерационная способность листовых дисков Морфогенетические процессы Коэффициент размножения 1-3 Образование каллуса 0 4-5 Адвентивное побегообразование 1:16-1:20 6-8 Образование обезвоженных микропобегов 1:10

Снижение интенсивности освещения до 1-1,5 клк стимулирует образование микропобегов иссопа в условиях in vitro. Это подтверждается данными таблицы 4.

Таблица 4

Влияние интенсивности освещения на частоту регенерации микропобегов иссопа у листовых эксплантов в условиях in vitro

Интенсивность освещения, клк Количество листовых эксплантатов с микропатогенами, % (*) Форма 80882 Форма 38285 0 0,0 0,0 1 80,0±5,0 35,0±11,0 1,5 90,0±4,0 50,0±4,3 2 75,0±5,0 40,0±7,9 2,5 55,0±3,0 27,0±3,0 3 35,0±5,0 16,0±6,1

(*)форма 80882 - иссоп с синим окрашиванием венчика цветка; форма 38285 - иссоп с розовым окрашиванием венчика цветка.

Из данных таблицы видно, что при отсутствии освещения не происходит образование адвентивных почек и побегов. Оптимальный уровень интенсивности освещения для инициации побегообразования и пролиферации микропобегов иссопа составил 1,5 клк. Частота регенерации и количество микропобегов на листовой диск значительно уменьшились при интенсивности освещения 2 клк, а при интенсивности освещения 3 клк только низкий процент листовых дисков был способен к регенерации и чаще всего экспланты погибали.

Следует отметить, что адаксиальное размещение листовых дисков иссопа на питательной среде повышает частоту регенерации микропобегов иссопа до 90%. В течение года из листовых дисков от одного растения иссопа можно получить около 10000 микропобегов, которые отделяют и в дальнейшем укореняют.

Укоренение микропобегов проводят на питательной среде №3 (табл.1), которая содержит 8,0-11,0 мкМ ИМК. Культуральные сосуды выставляют на стеллажи. Интенсивность освещения составляет около 2 клк, температура 21±1°С, фотопериод 14 часов. Через 2-2,5 недели наблюдается образование максимального количества корешков длиной 5-6 см. Число укорененных побегов иссопа в условиях in vitro составляет 63-72 % (в зависимости от формы иссопа). Полученные растения готовы к высадке в субстрат и адаптации in vivo.

Способ регенерации адвентивных микропобегов Hyssopus officinalis L. в условиях in vitro включает отделение листьевых дисков от микропобегов после 4-5 пассажа, полученных в культуре in vitro, дальнейшее культивирование их на модифицированной питательной среде Мурасиге и Скуга с половинной концентрацией макроэлементов и дополненной веществом цитокининового типа действия, а именно тидиазуроном, при этом культивирование проводят при пониженной интенсивности освещения. 4 табл.

Способ регенерации адвентивных микропобегов Hyssopus officinalis L. в условиях in vitro включает в себя отделение листовых дисков от растения, полученных в культуре in vitro, культивирование их на модифицированной среде Мурасиге и Скуга, дополненной фитогормонами, который отличается тем, что листовые диски отделяют после 4-5 пассажей микропобегов в культуре in vitro, далее культивируют их на модифицированной среде МС с половинной концентрацией микроэлементов и дополнительными веществами цитокининового типа действия, а именно тидиазуроном в концентрации 4,0-7,0 мкМ, причем культивирование проводят при низкой интенсивности освещения, которая составляет 1,0-1,5 клк.