РЕКОМБИНАНТНАЯ ФАГМИДНАЯ ДНК pHEN-TAB, СОДЕРЖАЩАЯ ГЕН ОДНОЦЕПОЧЕЧНОГО АНТИТЕЛА ЧЕЛОВЕКА, СПОСОБНОГО СВЯЗЫВАТЬ ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛИ АЛЬФА ЧЕЛОВЕКА; РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli-ПРОДУЦЕНТ ОДНОЦЕПОЧЕЧНОГО АНТИТЕЛА ЧЕЛОВЕКА ПРОТИВ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ АЛЬФА ЧЕЛОВЕКА; РЕКОМБИНАНТНОЕ РАСТВОРИМОЕ ОДНОЦЕПОЧЕЧНОЕ АНТИТЕЛО ЧЕЛОВЕКА ПРОТИВ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ АЛЬФА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2007 года по МПК C12N7/01 C12N15/13 C12N1/21 C07K16/24 A61K39/395 C12R1/19 

Изобретение относится к биотехнологии, белковой и генной инженерии, конкретно - к получению растворимых одноцепочечных антител человека против фактора некроза опухоли альфа человека, и представляет собой отобранную из сконструированной in vitro комбинаторной фаговой библиотеки одноцепочечных антител человека рекомбинантную фагмидную ДНК pHEN-ТАВ, содержащую уникальный ген одноцепочечного антитела человека под контролем промотора лактозного оперона, обеспечивающий в клетках Escherichia coli HB2151 синтез одноцепочечного антитела человека, способного связывать фактор некроза опухоли альфа человека; рекомбинантный штамм Escherichia coli - продуцент одноцепочечного антитела человека scTAB, способного связывать фактор некроза опухоли альфа человека; рекомбинантное растворимое одноцепочечное антитело человека scTAB, способное связывать фактор некроза опухоли альфа человека.

Фактор некроза опухоли альфа (ФНО-α) является главным медиатором острого воспалительного ответа на грамотрицательные бактерии и другие инфекционные агенты. Основным источником ФНО-α являются активированные мононуклеарные фагоциты, хотя стимулированные Т-клетки, натуральные киллеры и тучные клетки также могут секретировать этот белок [1]. Главным стимулятором запуска продукции ФНО-α макрофагами является бактериальный липополисахарид (ЛПС) или грамотрицательные бактерии, высвобождающие ЛПС [1]. Интерферон-гамма, продуцируемый Т-клетками и NK-клетками, усиливает продукцию этого цитокина ЛПС-активированными макрофагами [2].

ФНО-α ответственен за многие системные осложнения, возникающие при тяжелых инфекционных процессах, при этом ФНО-α, продуцируемый в большом количестве, может вызывать системные клинические и патологические проявления. Воздействуя на гипоталамус, он индуцирует лихорадку и поэтому называется естественным эндогенным пирогеном. В результате возникающей лихорадки увеличивается синтез простагландинов цитокин-стимулированными клетками гипоталамуса [3]. Кроме того, ФНО-α оказывает воздействие на печень, увеличивая, в частности, синтез гепатоцитами сывороточного амилоидного белка А и фибриногена - сывороточных воспалительных белков. Пролонгированная продукция ФНО-α вызывает и метаболические повреждения, такие как кахексия: он ингибирует синтез липопротеинлипазы - фермента, необходимого для высвобождения жирных кислот из циркулирующих липопротеиновых комплексов. Когда концентрация ФНО-α в сыворотке достигает больших значений, превышая 10^-7 М, это вызывает снижение сосудистого тонуса и сократимости миокарда, что, в конечном счете, приводит к резкому падению кровяного давления и шоку [3]. Кроме того, ФНО-α вносит ощутимый вклад при развитие локальных воспалительных реакций, в частности, при аутоиммунных заболеваниях [4].

Таким образом, повышение концентрации ФНО-α в крови приводит к ряду нежелательных последствий, включая шоковый синдром. Поэтому для коррекции подобных состояний можно применять антагонисты некоторых цитокинов, включая антитела человека против ФНО-α [5, 6]. В последние годы опубликован ряд работ, посвященных созданию искусственных антител, которые можно получать в больших количествах в апробированных экспрессионных системах в отличие от иммуноглобулинов, получаемых при иммунизации животных и человека. Одним из подходов является создание одноцепочечных антител (scFv), состоящих из вариабельных доменов тяжелой (Vh) и легкой (Vl) цепей иммуноглобулина, объединенных гибким пептидным линкером в одну молекулу. Небольшие размеры одноцепочечных антител облегчают их проникновение в ткани и выведение из организма [7, 8]. Одноцепочечные антитела были получены к интерлейкину 6 [9], вирусу осповакцины [10], вирусу Эбола [11]. Литературные данные о получении растворимых одноцепочечных антител человека против ФНО-α отсутствуют.

Технической задачей изобретения является получение растворимого одноцепочечного антитела человека против ФНО-α человека.

Поставленная задача решается путем отбора из сконструированной комбинаторной библиотеки одноцепочечных антител человека рекомбинантной фагмидной ДНК pHEN-TAB, содержащей уникальный ген одноцепочечного антитела человека, специфически направленного против ФНО-α человека; получением путем трансформации отобранной фагмидной ДНК pHEN-TAB штамма бактерий Escherichia coli - продуцента растворимого рекомбинантного одноцепочечного антитела человека scTAB против ФНО-α человека.

Комбинаторная библиотека одноцепочечных антител человека, сконструированная нами ранее [12], представляет собой популяцию фагмидных ДНК на основе фагмиды pHEN2, каждая из которых содержит под контролем промотора лактозного оперона ДНК-последовательность, кодирующую уникальное одноцепочечное антитело человека в составе химерного белка с оболочечным белком pIII бактериофага М13. При трансформации клеток Е.coli этой популяцией фагмидных ДНК образуется репертуар бактериофагов, каждый из которых экспонирует на своей поверхности уникальное мини-антитело в составе оболочечного фагового белка р3. Физическая сцепленность антитела и кодирующего его генетического материала дает возможность быстрого анализа антигенспецифических молекул, позволяя отбирать антитела, специфичные к целевому антигену.

На первом этапе сконструированной нами комбинаторной фагмидной библиотекой одноцепочечных антител человека трансформируют клетки супрессорного штамма Escherichia coli TG1 с использованием электропоратора BIORAD Gene Pulser™. Трансформированные клетки высевают на агаризованную среду 2×YT, содержащую 100 мкг/мл ампициллина и 1.5% глюкозы и растят при 30°С в течение ночи. Выросшие клетки собирают и хранят в среде 2×YT, содержащей 30% глицерин, при -70°С.

Для получения антител против ФНО-α человека проводят аффинное обогащение библиотеки специфическими клонами с последующим отбором индивидуальных клонов, способных продуцировать бактериофаги, экспонирующие на своей поверхности одноцепочечные антитела человека против ФНО-α человека. В качестве антигена используют рекомбинантный ФНО-α человека [13].

Для этого аликвоту трансформированных клеток размораживают, растят до среднелогарифмической фазы и инфицируют фагом-помощником М13К07, при этом получают популяцию нитчатых бактериофагов, каждый из которых экспонирует на своей поверхности уникальное одноцепочечное антитело человека в виде химерного белка с оболочечным белком pIII фага М13К07.

Аффинное обогащение библиотеки проводят в ходе трех последовательных раундов. Для проведения раунда обогащения в лунках полистиролового планшета сорбируют ФНО-α человека в концентрации 2 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере, рН 7.2 (ФСБР). По окончании сорбции места неспецифического связывания насыщают раствором 0,2% Твин-20-ФСБР, после чего в каждую лунку добавляют аликвоту (10¹² БОЕ) библиотеки в виде коллекции нитчатых бактериофагов. Несвязавшиеся фаговые частицы удаляют при промывке, а фаги, несущие на своей поверхности одноцепочечные антитела, способные связываться с ФНО-α человека, элюируют раствором ФНО-α человека в концентрации 2 мкг/мл в ФСБР. Полученным элюатом инфицируют культуру клеток Е. coli TG1 в стадии экспоненциального роста для амплификации элюированных фаговых антител.

Второй и третий раунды аффинного обогащения проводят аналогично. При этом используют ФНО-α человека в концентрации 2 и 1,5 мкг/мл соответственно. Степень обогащения библиотеки антителами, специфически связывающимися с ФНО-α человека, проверяют с использованием непрямого твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА) по способности популяций фаговых антител, полученных в результате каждого раунда аффинного обогащения, связывать ФНО-α человека (фиг.1). При этом фаговые антитела выделяют, как описано в Примере 1. В качестве отрицательного контроля используют связывание популяций фаговых антител с сухим обезжиренным молоком.

Далее, из популяции фаговых антител, обогащенной антителами против ФНО-α человека, с помощью ТИФА проводят отбор моноклональных фаговых антител, специфически связывающих ФНО-α человека. Для этого ФНО-α человека сорбируют в лунки 96-луночных иммунологических планшетов («Медполимер», Россия) в концентрации 0.5 мкг/мл. Места неспецифического связывания блокируют раствором 3%-го бычьего сывороточного альбумина (БСА, «Sigma», США) в ФСБР. Затем в лунки вносят выделенные, как описано в Примере 1, фаговые антитела, разведенные в ФСБР с 0,1% Твин, и инкубируют 1 час при 37°С. После промывки в лунки вносят анти-М13К07 мышиную сыворотку в разведении 1:2000, а затем антивидовой конъюгат щелочной фосфатазы («Sigma», США) в разведении 1:4000. В качестве хромогена используют пара-нитрофенилфосфат. Контролем неспецифического связывания служит связывание вируса с фагом-помощником М13К07, не несущим фрагментов антител на своей поверхности. В качестве отрицательного контроля используют связывание фаговых антител с БСА. Клоны, продемонстрировавшие сигнал, значение которого в 3 и более раз превышает контроль неспецифического связывания и отрицательный контроль, отбирают как положительные.

Далее проводят определение нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих одноцепочечные антитела против ФНО-α человека. Для амплификации Vh и Vl фрагментов в качестве матрицы используют фагмидные ДНК, выделенные методом щелочного лизиса [14], и олигонуклеотидные праймеры:

LMB - 5'-CAGGAAACAGTCATGAC и

pHEN-SEQ - 5'-CTATGGGGCCCCATTCA.

Амплификацию осуществляют методом ПНР с использованием Taq и Vent ДНК-полимераз при температуре отжига праймеров LMB и pHEN-SEQ 55°С.

Определение нуклеотидных последовательностей очищенных Vh и Vl фрагментов проводят в обоих направлениях с использованием автоматического секвенатора CEQ™ 2000XL DNA Analysis System ("Beckman") и наборов "F"CEQ DTCS Kit. Нуклеотдные и выведенные аминокислотные последовательности анализируют с использованием баз данных IgBLAST и V-base (фиг.2).

На основе результатов определения нуклеотидных последовательностей встроенных Vh- и Vl- фрагментов и рестрикционного анализа фагмиды строят схему фагмиды, содержащей ген, кодирующий уникальное одноцепочечное антитело против ФНО-α человека (фиг.3).

Рекомбинантная фагмидная ДНК pHEN-TAB, содержащая ген одноцепочечного антитела человека, способного связывать ФНО-α человека, характеризуется следующими признаками:

- имеет молекулярную массу 3,46 МДа и размер 5237 п.о.;

- содержит полученный генно-инженерными методами искусственный ген одноцепочечного антитела человека, обеспечивающий под контролем промотора лактозного оперона в клетках Е.coli синтез одноцепочечного антитела человека, способного связывать ФНО-α человека;

состоит из следующих элементов:

- Sfil / NotI - векторного фрагмента фагмиды pHEN2 (MRC, Великобритания) размером 4495 п.о., содержащего сайт инициации репликации плазмиды pUC18, сайт инициации репликации нитчатого бактериофага М13, последовательности, кодирующие гистидиновый гексомер и эпитоп C-myc, ori фага М 13, промотор Lac-оперона Е.coli, ori Е. coli, ген β-лактамазы (bla), супрессируемый стоп-кодон TAG, фрагмент гена белка pIII фага М13;

- SfiI/NotI - фрагмента размером 742 п.о., включающего искусственный ген одноцепочечного антитела человека, способного связывать ФНО-α человека, в котором вариабельный домен тяжелой цепи соединен с вариабельным доменом легкой цепи иммуноглобулина человека с помощью ДНК последовательности, кодирующей гибкий пептидный линкер Ser(Gly₄Ser)₂AlaArgGlySerGly₄Ser, и имеющего нуклеотидную последовательность, представленную на фиг.2;

содержит:

- промотор Lac- оперона Е. coli;

- генетический маркер: ген β-лактамазы (bla), определяющий устойчивость трансформированных фагмидой pHEN-TAB клеток E.coli к ампициллину;

- уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции, имеющие следующие координаты: HindIII - 235, SfiI - 328, NotI - 1070, EcoRI - 2361.

Следующий этап работы - получение рекомбинантного бактериального штамма-продуцента одноцепочечных антител против ФНО-α человека в растворимой форме, т.е. в виде свободных антител, не связанных с бактериофагом. Для получения таких антител используют несупрессорный штамм Escherichia coli HB2151 (К12, ara, D(lac-pro)), thi/ F' proA+B+, laclq, lacZDM15), правильно транслирующий стоп-кодон TAG, находящийся в структуре антитела перед белком р3 бактериофага. Следует отметить, что на С-конце одноцепочечного антитела находится гистидиновый гексамер, а также С-myc эпитоп для детекции продукции этого антитела.

Компетентные клетки Escherichia coli HB2151 трансформируют ДНК фагмиды ДНК pHEN-TAB, выделенной из отобранного клона методом щелочного лизиса [14]. Полученный таким образом рекомбинантный штамм E.coli HB2151/pHEN-TAB характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Клетки мелкие утолщенной палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.

Культуральные признаки. Клетки хорошо растут не простых питательных средах. При росте на агаре "Difco" - колонии круглые, гладкие, прижатые, мутные, блестящие, серые, край ровный. При росте на жидких средах (на минимальной среде или бульоне Луриа) образуют интенсивную ровную муть. Клетки растут при температуре 37°С при оптимуме рН от 6.8 до 7.0.

Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к ампициллину (100 мкг/мл), обусловленную наличием плазмиды.

Рекомбинантный штамм E.coli HB2151/pHEN-TAB обеспечивает индуцируемый изопропилтиогалактозидом (ИПТГ) синтез одноцепочечных антител человека scTAB, способных связываться с ФНО-α человека, с уровнем продукции около 1% суммарного клеточного белка.

Полученный штамм депонирован в НИИ коллекции культур микроорганизмов ФГУП ГНЦ ВБ «Вектор» под номером В-1077.

Для получения одноцепочечного антитела культуру полученного штамма нарабатывают до оптической плотности 0,6-0,8, после чего клетки индуцируют ИПТГ и растят на качалке при температуре 30°С примерно 4-5 часов. Выделение растворимых антител из периплазмы проводят, используя набор для очистки антител «Ni-NTA Oiagen», согласно инструкции, прилагаемой к набору. Степень очистки определяют сканированием геля на денситометре "Chromoscan 200" (Great Britain). Концентрацию белка в пробе определяют на спектрофотометре SmartSpec™ 3000 (BIO-RAD, США), используя метод Лоури [15].

Исследование специфичности отобранного антитела scTAB проводят методом Вестерн-блот анализа (см. пример 5). Аффинность полученного антитела в реакции связывания с ФНО-α человека исследуют методом ТИФА при последовательном разведении антитела (см. пример 6).

Сущность изобретения заключается в следующем:

- из сконструированной комбинаторной фаговой библиотеки одноцепочечных антител человека отобрана фагмидная ДНК pHEN-TAB, содержащая уникальный ген одноцепочечного антитела человека против ФНО-α человека;

- путем трансформации клеток Escherichia coli HB2151 фагмидной ДНК pHEN-TAB получен рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli HB2151/ pHEN-TAB - продуцент одноцепочечного антитела человека scTAB против ФНО-α человека;

- из клеток Escherichia coli HB2151/ pHEN-TAB выделено растворимое рекомбинантное одноцепочечное антитело человека scTAB против ФНО-α человека.

Изобретение иллюстрируется следующими фигурами:

Фиг.1. Связывание популяций фаговых антител после раундов селекции с ФНО-α человека (темные колонки) и с обезжиренным молоком (светлые колонки).

Фиг.2. Нуклеотидная и соответствующая ей аминокислотная последовательность одноцепочечного антитела человека scTAB.

Фиг.3. Схема фагмиды pHEN-TAB, содержащей ген одноцепочечного антитела scTAB. Указаны сайты для эндонуклеаз рестрикции HindIII, Sfil, ApaLI, NotI и EcoRI; промотор лактозного оперона Р lac Z; место посадки рибосом RBS; гены вариабельных доменов тяжелых (Vh) и легких (VI) цепей иммуноглобулинов, супрессируем стоп кодон amber TAG; фрагмент гена белка pIII; ori репликации ColE1; ori фага М13; ген ампициллиновой устойчивости Ар^r.

Фиг.4. Электрофореграмма фракций, полученных при хроматографии на Ni-NTA носителе лизатов E.coli, содержащих sc-TAB. А - окраска Кумасси R-250, Б - иммуноблоттинг с МКА. М - стандарты молекулярных масс, 1 -периплазматическая фракция клеток Е. coli HB2151-pHEN-TAB до нанесения на колонку, 2 - несвязавшаяся периплазматическая фракция клеток Е. coli HB2151-pHEN-TAB после нанесения на колонку, 3 - фракция промывки, 4 - элюат.

Фиг.5. Вестерн-блот анализ ФНО-α человека с помощью очищенного одноцепочечного антитела человека scTAB (1), МКА мыши против С-myc эпитопа (2), конъюгата антивидовых антител (anti-mouse) со щелочной фосфатазой (3). Приведены - стандарты молекулярных масс.

Фиг.6. Определение константы аффинности одноцепочечного антитела scTAB с использованием непрямого иммуноферментного анализа. Приведен график титрования полученного антитела scTAB. На твердую фазу сорбирован ФНО-α человека 0,5 мкг/мл. Одноцепочечное антитело scTAB нанесено в последовательных разведениях с шагом 1: 2, исходная концентрация 2.25 мкг/мл, и проявлено с помощью МКА мыши против С-myc эпитопа (ICN, США) в разведении 1:4000 с последующим добавлением антивидового конъюгата щелочной фосфатазы антивидовым конъюгатом (anti-mouse) щелочной фосфатазы в разведении 1:4000.

Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют примеры его конкретного выполнения.

Пример 1. Получение популяции нитчатых бактериофагов, каждый из которых экспонирует на своей поверхности уникальное одноцепочечное антитело человека в виде химерного белка с оболочечным белком р3 фага М13К07.

Аликвотой комбинаторной фагмидной библиотеки одноцепочечных антител человека [13] трансформируют клетки супрессорного штамма Escherichia coli TG1 с использованием электропоратора BIORAD Gene Pulser™. Трансформированные клетки высевают на агаризованную среду 2xYT, содержащую 100 мкг/мл ампициллина и 1.5% глюкозы и растят при 30°С в течение ночи. Выросшие клетки собирают и хранят в среде 2×YT, содержащей 30% глицерин, при -70°С.

50 мкл (около 10¹⁰ клеток) инокулируют в 100 мл среды 2×YT, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 1% глюкозу, и растят при постоянном перемешивании при 37°С до OD₆₀₀=0.5. После этого полученную культуру инфицируют фагом-помощником М13К07 (Pharmacia Biotech, Швеция), добавляя его в соотношении 1:20 (количество бактериальных клеток: количество фаговых частиц), и инкубируют 30 мин при 37°С. Затем 20 мл культуры осаждают центрифугированием в течение 10 мин при 3300 g. Осадок ресуспендируют в 10 мл 2×YT, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 25 мкг/мл канамицина, и переносят суспензию в 200 мл 2×YT, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 25 мкг/мл канамицина. Культуру инкубируют ночь при постоянном перемешивании при 30°С. На следующий день клетки Е. coli осаждают центрифугированием 10800 g, 10 мин в центрифуге "Beckman J2-21", к супернатанту добавляют 1/5 объема раствора PEG/NaCl (20% ПЭГ6000 и 2,5 М NaCl), хорошо перемешивают и в течение 1 ч инкубируют на льду. После этого суспензию центрифугируют при 10800 g 30 мин. Полученный осадок растворяют в 40 мл фосфатно-солевого буфера рН 7,2 (PBS) и добавляют 8 мл раствора PEG/NaCl, инкубируют во льду не менее 20 мин и проводят осаждение бактериофагов в центрифуге "Beckman J2-21" при 3300 g 30 минут. Супернатант вместе с остатками PEG/NaCl тщательно удаляют, а осадок ресуспендируют в 2 мл стерильного PBS. Для удаления остатков бактериальных клеток фаговую суспензию центрифугируют при 3300 g 10 мин. Выход фаговых частиц составляет приблизительно 10¹²-10¹³ бляшкообразующих единиц (БОЕ).

Пример 2. Аффинное обогащение полученной библиотеки фаговыми антителами, специфичными к ФНО-α человека.

Аффинное обогащение библиотеки проводят в ходе трех последовательных раундов. Для проведения первого раунда обогащения в лунках 96-луночного планшета («Медполимер», Россия) сорбируют ФНО-α человека в концентрации 2 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере, рН 7.2 (ФСБР) и инкубируют в течение ночи при комнатной температуре. На следующий день после удаления антигена лунки трижды промывают ФСБР и места неспецифического связывания насыщают раствором 0,2% Твин-20-ФСБР в течение 2 ч при 37°С. После этого лунки трижды промывают ФСБР и в каждую лунку добавляют аликвоту (10¹² БОЕ) библиотеки в виде коллекции нитчатых бактериофагов в 100 мкл раствора ФСБР. Планшеты инкубируют 1,5 часа при постоянном перемешивании при 37°С, после чего лунки планшета промывают 20 раз раствором ФСБР с 0,1% Твин-20, а затем 20 раз ФСБР.

Элюцию связавшихся бактериофагов проводят с помощью антигена. Для этого в лунки добавляют раствор ФНО-α человека в концентрации 2 мкг/мл в ФСБР. Для получения фагового репертуара культуру клеток Е. coli TG1 в стадии экспоненциального роста (по 10 мл для каждого элюата) инфицируют полученными фаговыми элюатами (по 400 мкл), инкубируют 30 мин при 37°С, затем центрифугируют 10 мин при 3000 g. Осадки ресуспендируют в 1 мл 2×YT и высевают на чашки с агаризованной средой 2×YT, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 1% глюкозу. Чашки инкубируют ночь при 30°С. Выросшие клетки собирают и хранят в среде 2×YT, содержащей 30% глицерин, при -70°С. Амплификацию отобранных после первого раунда бактериофагов проводят, как описано в Примере 1.

Второй и третий раунды аффинного обогащения проводят аналогично. При этом используют ФНО-α человека в концентрации 2 и 1,5 мкг/мл соответственно.

Степень обогащения библиотеки антителами, специфическими к ФНО-α человека, проверяют с использованием непрямого твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА) по способности популяций фаговых антител, полученных в результате каждого раунда аффинного обогащения, связывать ФНО-α человека. Для этого ФНО-α сорбируют на 96-луночные иммунологические планшеты («Медполимер», Россия) в концентрации 0,5 мкг/мл. Места неспецифического связывания блокируют раствором 5%-го обезжиренного молока в фосфатном буфере, рН 7.2. Затем в лунки вносят фаговые антитела, выделенные, как описано в Примере 1, разведенные ФСБР, содержащим 0,1% Твин, и инкубируют 1 час при 37°С. После промывки в лунки вносят анти-М13 мышиную сыворотку в разведении 1:2000, а затем антивидовой конъюгат щелочной фосфатазы («Sigma», США) в разведении 1:4000. В качестве хромогена используют пара-нитрофенилфосфат. В качестве отрицательного контроля используют связывание фаговых антител с обезжиренным молоком. Результаты приведены на фиг.1.

Пример 3. Отбор клонов, способных продуцировать антитела, связывающие ФНО-α человека.

Для получения моноклональных фаговых антител отдельные колонии E.coli TG1 из обогащенной против ФНО-α человека библиотеки пересевают с агаризованной среды в жидкую среду 2×YT, содержащую 100 мкг/мл ампициллина и 1% глюкозы, и растят до плотности, равной 0,5 при OD₆₀₀. Затем клетки инфицируют фагом-помощником М13К07, осаждают центрифугированием 3300 g, 10 мин и ресуспендируют клеточный осадок в среде, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 50 мкг/мл канамицина. Клетки культивируют при 30°С при перемешивании в течение ночи и затем осаждают центрифугированием 10800 g, 10 мин.

Супернатант, содержащий фаговые антитела, исследуют на способность связываться с ФНО-α человека методом ТИФА. ФНО-α человека сорбируют на 96-луночные иммунологические планшеты («Медполимер», Россия) в концентрации 0,5 мкг/мл. Места неспецифического связывания блокируют раствором 3%-го бычьего сывороточного альбумина (БСА, «Sigma», США) в ФСБР. Затем в лунки вносят выделенные, как описано в Примере 1, фаговые антитела, разведенные в ФСБР с 0,1% Твин, и инкубируют 1 час при 37°С. После промывки в лунки вносят анти-М13К07 мышиную сыворотку в разведении 1:2000, а затем антивидовой конъюгат щелочной фосфатазы («Sigma», США) в разведении 1:4000. В качестве хромогена используют пара-нитрофенилфосфат. Контролем неспецифического связывания служит связывание вируса с фагом-помощником М13К07, не несущим фрагментов антител на своей поверхности. В качестве отрицательного контроля используют связывание фаговых антител с БСА. Клоны, продемонстрировавшие сигнал, значение которого в 3 и более раз превышает контроль неспецифического связывания и отрицательный контроль, отбирают как положительные.

В дальнейшем из супернатантов положительных клонов выделяют фаговые антитела с помощью преципитации раствором PEG/NaCl и последующего центрифугирования, как описано в Примере 1.

Пример 4. Получение одноцепочечного антитела scTAB против ФНО-α человека в растворимой форме. Для получения одноцепочечного антитела в растворимой форме, т.е. в виде молекул одноцепочечных антител, не связанных с бактериофагом, используют несупрессорный штамм E.coli HB2151, правильно транслирующий охра-стоп-кодон TAG, находящийся в структуре антитела перед белком р3 бактериофага. Следует отметить, что на С-конце одноцепочечного антитела находится гистидиновый гексамер и С-myc эпитоп для детекции продукции этого антитела.

Культуру клеток HB2151 трансформируют фагмидной ДНК, выделенной из отобранного клона методом щелочного лизиса [14]. Для получения одноцепочечного антитела одну колонию трансформантов пересевают в 5 мл среды 2×YT, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 0,1% глюкозы, и подращивают на качалке приблизительно 2 ч. После этого суспензию переносят в колбу, содержащую 50-100 мл среды 2×YT, 100 мкг/мл ампициллина и 0,1% глюкозы, и культивируют при непрерывном перемешивании до оптической плотности 0,6-0,8. Затем клетки индуцируют 100 мМ IPTG до конечной концентрации 1 мМ и растят на качалке при температуре 30°С примерно 4-5 часов.

Выделение растворимых антител из периплазмы проводят, используя набор для очистки антител «Ni-NTA Oiagen», согласно инструкции, прилагаемой к набору. Фракции, полученные при хроматографической очистке, анализируют электрофоретически и методом Вестерн-блот анализа с использованием анти C-myc MKA мыши (фиг.4). Степень очистки определяют сканированием геля на денситометре "Chromoscan 200" (Great Britain); для антитела scTAB она составляет приблизительно 50%. Концентрацию белка в пробе определяют на спектрофотометре SmartSpec™ 3000 (BIO-RAD, США), используя метод Лоури [15]. Для элюата, содержащего антитело scTAB, концентрация белка составляет 0,09 мг/мл, следовательно концентрация антитела scTAB составляет 0,045 мг/мл.

Пример 5. Проверка специфичности одноцепочечного антитела человека scTAB. Специфичность полученного антитела scTAB подтверждают методом Вестерн-блот анализа. ФНО-α человека разделяют электрофоретически в 12% полиакриламидном геле с SDS, переносят на нитроцеллюлозный фильтр 0,45 мкм ("Millipore", США), который после блокирования сайтов неспецифического связывания раствором 3% БСА ("Sigma", США) инкубируют с исследуемым антителом. Связавшиеся антитела выявляют с помощью МКА мыши против С-myc эпитопа (ICN, США) в разведении 1:4000 с последующим добавлением антивидового конъюгата щелочной фосфатазы ("Sigma", США) в разведении 1:4000. Визуализацию иммунного комплекса проводят, добавляя 5-бромо-3-индоло фосфат ("Carl Roth GmbH", Германия) и нитро-тетразолевый синий ("Sigma", США). Результаты подтверждают связывание антитела scTAB с белком с молекулярным весом около 17 кДа, что соответствует молекулярному весу рекомбинантного ФНО-α человека [13]. В качестве отрицательного контроля используют выявление ФНО-а человека с помощью МКА мыши против С-myc эпитопа и антивидовым конъюгатом щелочной фосфатазы, взятых в тех же разведениях (фиг.5).

Пример 6. Определение константы аффинности полученного одноцепочечного антитела scTAB в реакции связывания с рекомбинантным ФНО-α человека. Константу аффинности определяют методом ИФА. На твердую фазу сорбируют рекомбинантный ФНО-α человека в концентрации 0.5 мкг/мл и после блокировки мест неспецифического связывания раствором 2% бычьего сывороточного альбумина (БСА, "Sigma", США), инкубируют с полученным рекомбинантным антителом, добавленным в последовательных разведениях, начиная с концентрации 2.25 мкг/мл с шагом разведения 1:2. Иммунный комплекс выявляют с помощью МКА мыши против С-myc эпитопа (ICN, США) в разведении 1:4000 с последующим добавлением антивидового конъюгата щелочной фосфатазы ("Sigma", США) в разведении 1:4000. В качестве хромогена используют пара-нитрофенилфосфат ("ICN", США). В качестве отрицательного контроля в параллельных экспериментах тестируют связывание полученного рекомбинантного антитела с БСА. Результаты экспериментов показывают способность полученного рекомбинантного антитела связывать ФНО-α человека (фиг.6). Величину константы аффинности рассчитывают методом наименьших квадратов по формуле

где х - концентрация антител в растворе, R - концентрация сорбированного антигена, k - константа аффинности, А - нормировочный множитель. Величина константы аффинности для рекомбинантного антитела человека 1F4 составляет 3,96±0,52×10⁸ М^-1 (фиг.6).

Таким образом, впервые сконструирована рекомбинантная фагмида pHEN-TAB, содержащая под контролем промотора лактозного оперона ген одноцепочечного антитела человека, способного связывать фактор некроза опухоли альфа человека; трансфекция клеток Escherichia coli HB2151 обусловливает получение штамма Escherichia coli HB2151/ pHEN-TAB -продуцента рекомбинантного одноцепочечного антитела человека scTAB против фактора некроза опухоли альфа человека; получено растворимое рекомбинантное одноцепочечное антитело человека scTAB против фактора некроза опухоли альфа человека с К_аф=3,96±0,52×10⁸ М^-1.

Источники информации

1. Abbas, A.K., Lightman, A.H., Pober, J.S. Cellular and Molecular Immunology. Fourth Edition, 553. - 2000. P.240-246.

2. Konur A, Schulz U, Eissner G, Andreesen R, Holler E. // Br. J. Dermatol. - 2005. Vol. 152 (6). - P.915-919.

3. Carlson DL., Willis MS., White DJ., et al. // Crit Care Med. - 2005. Vol. 33 (5). - P.1021-1028.

4. Kawaguchi M., Mitsuhashi Y., Kondo S. // Br J Dermatol. - 2005. Vol. 152 (5). - P.915-919.

5. Dinarello C.A. / /Eur. Cytokine Netw. - 1994. - Vol. 5 (6). - P.517-531.

6. Fisher C.J. Jr., Dhainaut J.-F., Opal S.M., et al. // J. A. M. A. - 1994. Vol.271 (23). P.1836-1843.

7. Barbas С., Bjorling E., Chiodi F. et al. // Proc. natl. Acad. Sci. USA. - 1992. - Vol. 89. - P.9339-9343.

8. Yokota Т., Milenic D.E., Whitlow M., Schlom J. // Cancer Res. - 1991. - Vol. 51. - P. 6363-6365.

9. Krebs, В., Griffin, H., Winter, G., Rose-John, S. // J. Biol. Chem. - 1998. - Vol. 273 (5). - P.2858-2865.

10. Tikunova N.V., Morozova V.V., Batanova T.A., Belanov E.F., Bormotov N.I., Ilyichev A.A. // Hum. Antibodies. - 2001. - Vol.10 (3-4), - P.95-99.

11. Тикунова Н., Колокольцов A.A., Чепурнов А.А. // ДАН. - 2001. - T.378. C.551-554.

12. Батанова T.A., Улитин А. Б., Жираковская E.В., Ламан А.Г., Бровко Ф.А., Воронина В.В., Тикунова Н.В. // Мол. генет., вирус., микробиол. - 2005.

13. Berkova N, Lemay A, Korobko V, Shingarova L, Sagaidak L, Goupil S. // Cancer Detect Prev. - 1999. - Vol. 23 (1). - P.1-7.

14. Birnboim H.C. and Doly J.A rapid aikalin extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. // Nucl. Acids Res. - 1979. - Vol.7. - P.1513-1523.

15. Lawri E. et al // J. Biol. Chem. - 1951. - Vol. 193. - P.256.

16. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика: Практический курс. M.: ФАИР-ПРЕСС, 1999.

Изобретение относится к генной инженерии и может быть использовано для получения растворимых одноцепочечных антител человека против фактора некроза опухоли альфа человека. Из сконструированной in vitro комбинаторной фаговой библиотеки одноцепочечных антител человека отбирают рекомбинантную фагмидную ДНК pHEN-TAB, содержащую уникальный ген одноцепочечного антитела человека под контролем промотора лактозного оперона. Полученной фагмидной ДНК трансформируют клетки Escherichia coli HB2151 и получают рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli HB2151/pHEN-TAB, депонированный в НИИ ККМ ФГУП ГНЦ ВБ "Вектор" под номером В-1077-продуцент одноцепочечного антитела человека, способного связывать фактор некроза опухоли альфа человека. Изобретение позволяет получить растворимое одноцепочечное высокоаффинное антитело человека scTAB против фактора некроза опухоли альфа человека, с константой аффинности К_аф=3,96±0,52×10⁸М^-1. 3 н.п. ф-лы, 6 ил.

1. Рекомбинантная фагмидная ДНК pHEN-TAB, содержащая ген одноцепочечного антитела человека, способного связывать фактор некроза опухоли альфа человека, размером 5237 п.о, и молекулярной массой 3,46 МДа, включающая

Sfil - NotI - векторный фрагмент фагмиды pHEN2 (MRC, Великобритания) размером 4495 п.о, содержащий сайт инициации репликации плазмиды pUC18, сайт инициации репликации нитчатого бактериофага М13, последовательности, кодирующие гистидиновый гексомер и эпитоп С-myc, промотор Lac-оперона E.coli, ген β-лактамазы (bla), супрессируемый стоп-кодон TAG, фрагмент гена белка pIII фага М 13;

SfiI - NotI - фрагмент размером 742 п.о., представляющий собой искусственный ген одноцепочечного антитела человека, способного связывать ФНО-α человека, в котором вариабельный домен тяжелой цепи соединен с вариабельным доменом легкой цепи иммуноглобулина человека с помощью ДНК последовательности, кодирующей гибкий пептидный линкер Ser(Gly₄Ser)₂AlaArgGlySerGly₄Ser, имеющий нуклеотидную последовательность, приведенную на фиг.2;

содержит

промотор Lac- оперона Е. coli;

генетический маркер: ген β-лактамазы (bla), определяющий устойчивость трансформированных фагмидой pHEN-TAB клеток E.coli к ампициллину;

уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции, имеющие следующие координаты: HindIII - 235, SfiI - 328, NotI - 1070, EcoRI - 2361.