СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КИСЛОМОЛОЧНОГО ПРОДУКТА ТИПА ЙОГУРТА Российский патент 2007 года по МПК A23C9/123 

Изобретение относится к области биотехнологии и молочной промышленности, в частности к способу получения кисломолочного продукта типа йогурта, обладающего профилактическими свойствами.

Дисбактериоз (дисбиоз) - любые количественные или качественные изменения типичной для данного биотипа нормофлоры человека и животных, возникающие в результате воздействия на макро - и микроорганизмы различных факторов экзогенного и эндогенного характера, влекущие за собой выраженные клинические проявления со стороны макроорганизма или являющиеся следствием патологических процессов в организме.

Адекватное сбалансированное питание при нормальном функционировании органов и систем предотвращает развитие дисбиозов. При изменениях микрофлоры необходима коррекция питания с учетом моторики, секреторных изменений желудочно-кишечного тракта, ферментативной активности пищеварительного тракта.

Широкое распространение получили бактерийные препараты на основе живых микроорганизмов, представителей нормальной микрофлоры-пробиотики. В настоящее время появилось новое понятие - биотерапевтические агенты (БТА), представляющие собой препараты микроорганизмов на основе штаммов лактобифидобактерий.

Известен способ приготовления пробиотика на основе живых бифидобактерий и лактобактерий путем одновременного внесения в стерильное молоко закваски бифидобактерий и лактобактерий, перемешивания и культивирования при 37-38°С, причем из лактобактерий используют штамм Lactobacillus acidophilus NK₁, а соотношение бифидобактерий и лактобактерий подбирают из расчета обеспечения в конечном продукте концентрации бифидобактерий не менее 10⁸ КОЕ/мл, а лактобактерий не более 10⁸ КОЕ/мл и рН 4,4-4,8, при этом закваску лактобактерий вносят в количестве 0,05-0,1% от объема молока (Пат. РФ №2060673, кл. А 23 С 9/12).

Известен способ получения кисломолочного продукта типа йогурта, заключающийся в том, что по крайней мере один штамм молочнокислых палочек Lactobacillus deodadorans, Lactobacillus cleorans и смешанная культура Lactobacillus sulfurica FERM P 7386, из молочнокислых стрептококков Streptococcus Faecalis FERM P 2083 или FERM P 7382, способны продуцировать антибиотики при соотношении культур от 150:1 до 0,01:1. Отобранным штаммом засевают йогуртовую среду и выдерживают смесь в течение 48 ч при 37°С, получая в результате йогурт (Патент РФ №1651774, кл. С12N 1/20 от 23.05.91).

Описанный йогурт используется как добавка к корму различных животных и птиц, но не может быть использован для человека. Кроме того, он в какой-то мере обладает функциями антибиотика, т.е. является полной противоположностью пробиотика.

Известен способ получения кисломолочного продукта, предусматривающий внесение в соевое молоко закваски, сквашивание сырья и охлаждение полученного продукта, причем в качестве закваски для первоначального сквашивания используют жидкий концентрат лактобактерий, и/или молочнокислых стрептококков, и/или бифидобактерий, полученный на гидролизатно-соевой среде (пат. РФ №2177691, кл. А23С 9/12).

Однако продукт, полученный по предлагаемому способу, из-за высокого содержания лактобактерий (10¹⁰) может обладать плохими вкусовыми качествами и приводить к угнетению роста бифидобактерий. Кроме того, нет постоянного контроля микробиологической чистоты предлагаемых заквасок, сбраживаемого молока и конечных продуктов, что не исключает контаминации посторонними бактериями.

Известны штаммы бифидобактерий вида B.bifldium №791, №792 для приготовления бактерийных препаратов и продуктов лечебно-диетического питания (пат. РФ №2215028, кл. C12N 1/20).

Известен штамм лактобацилл - Lactobacillus fermentum 2953 (пат. РФ №2062787, кл. C12N 1/38).

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату является способ получения кисломолочного продукта, включающий стерилизацию молока, охлаждение до температуры заквашивания, внесение закваски, содержащей бифидобактерии и лактобактерии, и ферментацию молока (пат. РФ №2060674, кл. А23С 9/12).

Однако известный способ не позволяет использование продукта людьми, плохо переносящими молочные продукты. Также известный способ имеет длительный период сквашивания молока и индивидуальное неконтролируемое брожение в каждом пакете.

Задачей изобретения является получение гипераллергенного продукта с высокой бактерицидной активностью (пробиотической), способного корректировать микрофлору желудочно-кишечного тракта, обладающего повышенными диетическими и профилактическими свойствами, сокращение времени на производственный цикл заквашивания.

Поставленная задача решается способом получения кисломолочного продукта типа йогурта, включающего пастеризацию исходного сырья, охлаждение его до температуры заквашивания 37-38°С, сквашивание (ферментацию) соевого молока 6-8 часов бактериями вида Bifidobacterium, причем в качестве Bifidobacterium используют штамм Bifidobacterium bifidum №791 совместно с бактериями вида Lactobacillus fermentum 2953 при соотношении Lactobacillus fermentum:Bifidobacterium bifidum 1:2,0-2,5 и их раздельном внесении, т.е. сначала вносят Bifidobacterium bifidum №791, а через 1-2 часа вносят Lactobacillus fermentum №2953. Соевое молоко используют с массовой долей сухих веществ 10-12, белка 1,5-3,0, кислотностью 76-82°Т с содержанием живых микроорганизмов в конечном продукте Bifidobacterium bifidum №791 10⁷-10⁸ КОЕ /мл, a Lactobacillus fermentum №2953 - 10⁶-10⁷ КОЕ/мл.

Отличие предложенного способа от известного состоит в том, что в качестве исходного сырья используют соевое молоко с массовой долей сухих веществ 10-12, белка 1,5-3,0, кислотностью 76-82°Т, сквашивание (ферментацию) соевого молока осуществляют 6-8 часов раздельно штаммом Bifidobacterium bifidum №791 и лактобациллами Lactobacillus fermentum №2953, причем сначала вносят Bifidobacterium bifidum №791,а через 1-2 часа и лактобациллы Lactobacillus fermentium №2953, при соотношении L.f.:B.b. - 1:2,0-2,5. Содержание живых клеток микроорганизмов в конечном продукте составляет 10⁶-10⁷ Bifidobacterium bifidum №791 в количестве 10⁷-10⁸ КОЕ/мл и лактобациллы Lactobacillus fermentum №2953 в количестве 10⁶-10⁷. Только благодаря такому сочетанию удается получить гипераллергенный продукт с высокой бактерицидной активностью.

Была исследована антагонистическая активность в отношении к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам образцов соевого йогурта, содержащего лактобактерии и бифидобактерии. Для последующих исследований выбраны бифидобактерии - B.bifidum из препарата "Биовестин" и лактобациллы из кумыса башкирского и шубата казахского - Lactobacillus №2953.

Образцы функционального диетического питания - живых йогуртов готовили на свежеприготовленном соевом молоке, предоставленном фирмой «Фармбиоал». Исследования проводились в соответствии с требованиями СанПин 2.3.2.1078-01 с использованием методик, приведенных в ГОСТ: 10444.11-89, 30518-97, 10444.2-94, 10444.8-8830510-97, 10444.12-88, причем контролю на микробиологическую чистоту подвергаются все стадии производства такого йогурта: свежеприготовленное соевое молоко, раздельно приготовленные закваски на его основе, первичный сквашенный полупродукт и конечный продукт-йогурт с внесенными вкусовыми натуральными фруктовыми добавками.

Использование соевого молока для приготовления йогуртов обусловлено тем, что соевые продукты питания содержат полноценные белки, практически не уступающие по питательности и пищевой ценности белкам животного происхождения, комплекс биологически активных компонентов (клетчатка, кальций, цинк, магний и др.) и ряд витаминов (В, Д, Е) при отсутствии холестерина и молочного сахара (лактозы), являющегося мощным аллергеном. Все соевые продукты идеально сбалансированы по калорийности и содержанию основных питательных веществ и прекрасно усваиваются человеческим организмом.

Для выделения чистых культур лактобацилл было взято 5 образцов кисломолочного напитка «Кумыс». Чистую культуру Laktobacillus №2953 получали последовательным пересевом из плотной питательной среды MRS в жидкую питательную среду MRS, а затем снова на плотную питательную среду MRS.

Выбор штамма лактобактерий для дальнейшего культивирования и исследования был проведен на основе данных об антагонистической активности. Ингибирующую активность определяли методом перпендикулярных штрихов на плотной питательной среде в чашках Петри по отношению к следующим тест-культурам условно-патогенных и патогенных микроорганизмов: Candida albicans, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, B.subtilus, Pseudomonas aeruginosae, Shigella zonnei, Salmonella flexneri, Klebsiella pneumoniae.

Суточные культуры лактобактерий, а также бифидобактерий или образцы йогурта наносили прямой полосой с помощью петли (2 мм) на поверхность плотной питательной среды MRS агар в центре чашки Петри. Инкубирование посевов осуществляли в течение 3 суток при 37°С. Затем к выросшей культуре подсевали тест-культуры петлей 1 мм перпендикулярно зоне роста анализируемой культуры, не касаясь ее.

После суточной инкубации чашек при 37°С определяли зоны угнетения роста тест-культур. Для контроля роста тест-культур использовали их аналогичный, параллельный посев в чашках Петри с той же плотной средой, но без полосы испытуемых лактобактерий, бифидобактерий или йогурта. Антагонистическую активность штаммов лактобактерий, бифидобактерий определяли методом отсроченного антагонизма по отношению к C.albicans, Е.coli, S.aureus, В.subtilus.

Первичный скрининг выделенных штаммов лактобактерий, который проводили методом перпендикулярных штрихов на плотной питательной среде показал, что они отличаются по ингибирующей способности. Зоны отсутствия роста тест-культур определяли у различных штаммов: для Е.coli от 5 до 48 мм, для S.aureus от 0 до 32 мм, В.subtilus от 8 до 37 мм, для С.albicans от 0 до 31 мм, для P.aerugiosae от 0 до 28 мм, для Shigella zonnei от 10 до 52 мм, для Salmonella flexneri от 0 до 42 мм, K.pneumoniae от 10 до 57 мм.

Лактобациллы (10⁶ бактерий) эффективно снижали число колоний золотистого стафилококка и гемолитической кишечной палочки с 10⁸ до единичных колоний или до 0, а концентрацию B.subtilus с 10⁸ до 10².

Количество лактобацилл за десять дней хранения снижается с 10⁷ до 10⁶ КОЕ/мл.

Штамм бифидобактерий B.bifidum по результатам совместного культивирования снижал концентрацию C.albicans, S.aureus, B.subtilus с 10⁶ до 10², a E.coli до единичных колоний.

За десять дней хранения количество бифидобактерий B.bifidum снижается с 10⁸ до 10⁷ КОЕ/мл.

Пример №1

В бактериологические пробирки вносят по 1 мл исследуемого микроорганизма. Готовят суспензию, состоящую из 10 мкл чистой культуры (Lactobacillus fermentum) и 10 мл стерильной воды, очищенной на мембранных фильтрах «Mellipore», добавляют 90 мл питательной среды MRS при температуре 39°С. Наносят 15 мл приготовленной суспензии на поверхность чашки Петри с питательной средой. Проводят инкубацию в термостате при 37°С 48 часов.

После инкубирования мерными (0,01 мкл) одноразовыми петлями проводят высевы на соответствующие питательные среды и среду MRS для количественного учета микроорганизмов.

Проводят измерение зон антагонистической активности по отношению к условно-патогенным микроорганизмам in vitro. Радиусы зон задержки роста микроорганизмов - индикаторов: С.albicans, E.coli, S.aureus, B.subtilus при действии L.fermentum составили 13,4±1,7; 25,8±2,6; 18,5±1,6; 11,2±0,9.

Пример №2

Приготовление йогурта.

Выделяют чистые культуры Lactobacillus fermentum и B.bifidum. Проводят пастеризацию соевого молока при 100°С, затем охлаждают его до температуры заквашивания 37-38°С. Готовят закваски раздельно для В.bifidum №791 (10⁸-10⁹ KOE/мл) и Laktobacillus fermentum 2953 (10⁸-10⁹ КОЕ/мл). Засевают соевое молоко (продукт фирмы «Фармбиол» с массовой долей сухих веществ 10,5%, массовой долей белка 1,5% и кислотностью 80°Т) закваской Bifidobacterium bifidum №791 в количестве 10⁷-10⁹ КОЕ/мл, а через час вносят Lactobacillus fermentum 2953 в количестве 10⁶-10⁷ КОЕ /мл. Соотношение лактобактерий к бифидобактериям равно 1:2,5. Проводят инкубацию при 37°С в течение 6 часов. Вводят наполнитель (джем). Полученный продукт фасуют, а затем охлаждают до 12°С. В 1 мл такого йогурта содержится бифидобактерий 10⁸ КОЕ/мл, лактобацилл 10⁷ КОЕ/мл. Изучено воздействие соевого йогурта на условно-патогенные и патогенные микроорганизмы.

Пример №3

Выделяют чистые культуры Lactobacillus fermentum 2953 и B.bifidum №791.

Проводят пастеризацию соевого молока при 100°С, затем охлаждают его до температуры заквашивания 37°С. Готовят закваски раздельно для В.bifidum и для L.fermentum и засевают соевое молоко с массовой долей сухих веществ 11%, белка 2,0%, кислотностью 76°Т закваской Bifidobacterium bifidum №791 в количестве 10⁹ КОЕ /мл, а через 1,5 часа вносят Lactobacillus fermentum 2953 в количестве 10⁸ КОЕ/мл. Соотношение лактобактерий к бифидобактериям равно 1:2. Далее все операции проводят как в примере 2. Получают кисломолочный продукт типа йогурта с содержанием бифидобактерий 10⁸ КОЕ/мл и лактобацилл 10⁷ КОЕ/мл.

Обнаружено, что К.pneumoniae после инкубации в присутствии йогурта гарантированно отсутствует вне зависимости от ее исходной концентрации 10⁶, 10⁴ или 10² КОЕ/мл. После инкубации с йогуртом S.zonnei с КОЕ/мл 10⁶ или 10⁴ остаются единичные колонии, с КОЕ /мл 10² она не обнаруживается. КОЕ/мл P.aeruginosae, S.flexneri и S.aureus снижается на 3 порядка с 10⁶ и 10⁴ до 10² и 10, вплоть до их полного отсутствия с 10².

По результатам культивирования условно-патогенных микроорганизмов после воздействия на них соевого йогурта можно сделать вывод, что бифидобактерии и лактобактерии сохранили свою высокую антагонистическую активность.

Образец соевого йогурта, приготовленный по вышеописанному способу, применили в отделении токсикологической реанимации ЦОО НИИ СП им. Н.Ф.Склифосовского у тяжелых больных с отравлениями психофармакологическими препаратами. Состояние 24 больных на время приема препарата расценивалось следующим образом: 15 больных при поступлении находились в состоянии комы с нарушением дыхания по смешанному типу. К этим больным применяли активные методы детоксикации - кишечный лаваж, гемосорбцию. Они находились на искусственной вентиляции легких от 4 до 12 суток. После проведения активных методов детоксикации у всех больных были отмечены явления пневмонии. В сочетании с медикоментозной терапией, как и в контрольном опыте, они получали йогурт. У получавших йогурт больных быстрее отмечалось восстановление кишечной флоры и нормализация стула, а выход из пневмонии ускорялся на 3-6 дней. Девять больных в сомагенной стадии отравления, которым из методов детоксикации проводили только кишечный лаваж, также принимали йогурт. У 4 из них отмечались явления пневмонии, которые исчезли через 5 дней, а у 5 больных развитие пневмонии не отмечалось.

Таким образом, применение кисломолочного продукта в виде соевого йогурта способствует более быстрому восстановлению кишечной флоры и ускорению естественных процессов детоксикации, не вызывая при этом аллергии.

Изобретение относится к области биотехнологии и молочной промышленности, в частности к способу получения кисломолочного продукта типа йогурта. Способ включает пастеризацию исходного сырья, охлаждение до температуры заквашивания, внесение заквасок бифидобактерий и лактобацилл, сквашивание молока, охлаждение и разлив. В качестве исходного сырья используют соевое молоко с массовой долей сухих веществ 10-12,5, белка 1,5-3,0 мас.%, кислотностью 76-82°Т. Закваски бифидобактерий и лактобацилл вносят раздельно, сначала закваску, содержащую Bifidobacterium bifidum №791, а через 1-2 часа Lactobacillus fermentum 2953 при соотношении Lactobacillus fermentum к Bifidobacterium bifidum 1:2,0-2,5. Сквашивание молока проводят 6-8 часов, причем содержание живых микроорганизмов в конечном продукте Bifidobacterium bifidum №791 10⁷-10⁸ КОЕ/мл, a Lactobacillus fermentum 2953 10⁶-10⁷ КОЕ/мл. Изобретение позволяет получить гипераллергенный продукт с высокой бактерицидной активностью, способный контролировать микрофлору желудочно-кишечного тракта, обладающий повышенными диетическими и профилактическими свойствами.

Способ получения кисломолочного продукта типа йогурта, включающий пастеризацию исходного сырья, охлаждение до температуры заквашивания, внесение заквасок бифидобактерий и лактобацилл, сквашивание молока, охлаждение и разлив, отличающийся тем, что в качестве исходного сырья используют соевое молоко с массовой долей сухих веществ 10-12,5, белка 1,5-3,0 мас.%, кислотностью 76-82°Т, закваски бифидобактерий и лактобацилл вносят раздельно, сначала закваску, содержащую Bifidobacterium bifidum № 791, а через 1-2 ч Lactobacillus fermentum 2953 при соотношении Lactobacillus fermentum к Bifidobacterium bifidum 1:2,0-2,5, сквашивание молока проводят 6-8 ч, причем содержание живых микроорганизмов в конечном продукте Bifidobacterium bifidum № 791 10⁷-10⁸ КОЕ/мл, a Lactobacillus fermentum 2953 10⁶-10⁷ КОЕ/мл.