ШТАММ БАКТЕРИЙ SERRATIA SPECIES - ПРОДУЦЕНТ ЛИПАЗЫ Российский патент 2007 года по МПК C12N9/20 C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и касается штамма бактерий - продуцента фермента липазы. Липазы катализируют гидролиз триацилглицеридов с образованием жирных кислот и глицерина. Они находят применение в пищевой промышленности, бытовой химии, косметике. Поиск новых бактериальных штаммов - продуцентов липазы является актуальной задачей.

Основными продуцентами липаз являются штаммы грибов Rhizopus [1, 2], Fusarium [3], некоторые дрожжи (Jarrowia) [4]. Известен, например, штамм грибов Fusarium oxysporum - продуцент липазы [3]. Данный штамм выращивают при температуре 30°С в течение 150-200 часов на питательной среде, содержащей, г/л:

MgSO₄·7H₂O0,5КН₂PO₄1,0NaNO₃3,0Пептон30,0Дрожжевой экстракт1,0Оливковое масло10,0

Через 150 часов культивирования достигается максимальное накопление в культуральной жидкости специфической липазной активности - 150 ед акт./мг биомассы (по сухому весу). Недостатком известного штамма является длительность культивирования (6-7 суток), сложность питательной среды и трудоемкость процедуры получения культуральной жидкости (освобождение от грибного мицелия).

Использование бактерий-продуцентов липаз обладает по сравнению с грибами преимуществом, заключающимся в ускорении процесса культивирования. Это может сделать более выгодным технологический процесс получения липазы. Известен, например, штамм Serratia marcescens 345 [5], который выращивают при температуре 30°С на питательной среде (рН 7,0), содержащей, г/л:

Отвар соевой муки 50,0Мочевина 0,1MgSO₄·7H₂O 0,1КН₂PO₄ 0,2

Через 24 часа в культуральной жидкости накапливается максимальное количество липазы со специфической активностью 95 ед акт./мг биомассы (по сухому весу). Недостатком данного штамма является низкая специфическая активность продуцируемого фермента.

Наиболее близким к заявляемому штамму - прототипом является штамм Serratia marcescens В-10 L-1 [6], который выращивают при температуре 28-30°С на питательной среде (рН 7,0), содержащей, г/л:

MgSO₄·7H₂O 0,25КН₂PO₄ 3,0Na₂HPO₄·2H₂O 7,0NH₄Cl 1,0CaCl₂·2H₂O 0,02NaCl 0,5Отвар соевой муки 50,0

Максимальное накопление липазы характеризуется величиной, составляющей 800 ед акт./мг биомассы (по сухому весу).

Недостатком данного штамма является сравнительно низкая специфическая активность продуцируемого фермента.

Технической задачей изобретения является получение нового бактериального штамма, обеспечивающего высокую специфическую активность липазы.

Поставленная задача достигается предлагаемым штаммом Serratia species ИБ 3-1, выделенным из образца сточных вод, отобранного в аэротенке биологических очистных сооружений пермского мясокомбината. Штамм поддерживается в коллекции микроорганизмов Института биологии Уфимского научного центра РАН. Штамм Serratia species ИБ 3-1 характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Клетки палочковидные, прямые, короткие, размером 0,5-0,8×0,8-2,0 мкм, подвижные, одиночные, парные или в цепочках, спор не образуют. Грамотрицательные.

Морфологию колонии определяли после 4-5 суток роста при 28°С. На мясопептонном агаре (МПА) - круглые с фестончатыми краями, гладкие, выпуклые, непрозрачные, блестящие, мягкой консистенции колонии, пигмент на МПА морковно-красный, на овсяном агаре темно-вишневый, не диффундирующий в среду, диаметр колонии 4-5 мм.

Физиологические и биохимические признаки. Штамм является факультативным анаэробом, обладает и дыхательным, и бродильным типами метаболизма, не требователен к факторам роста. Оптимальная температура роста 28-30°С, растут при 5°С. Разжижает желатин, пептонизирует и свертывает молоко, гидролизует лецитин. Способен расти на среде Симмонса с цитратом, реакция Фогеса-Проскауэра положительная. Проба с метиловым красным положительная. Дает отрицательный оксидазный, положительный каталазный тесты. Ферментирует с образованием кислоты глюкозу, арабинозу, маннозу, фруктозу, мальтозу, крахмал, сорбитол, ацетат, а галактозу, сахарозу и ксилозу ферментирует с образованием кислоты и газа. Растет на МПА с 8% NaCl.

Штамм хранится на косяках МПА в холодильнике с пересевом на свежие косяки через 2-4 месяца, а также в лиофильно-высушенном состоянии.

Штамм идентифицирован по определителю Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. Анализ штамма путем секвенирования двух фрагментов гена 16S РНК и последующее сравнение этих фрагментов со всеми известными последовательностями, депонированными во Всемирной базе генов (GenBank), подтвердили достоверность идентификации.

Для культивирования штамма Serratia species ИБ 3-1 с целью получения липазы применяют питательную среду следующего состава, г/л: соевая мука - 25; дрожжевой экстракт - 40; К₂HPO₄ - 5,0; (NH₄)₂SO₄ - 1,0. Процесс культивирования проводят при температуре 28°С на качалке при числе оборотов 160 об/мин.

Количество накапливаемой биомассы штамма ИБ 3-1 определяют путем подсчета числа жизнеспособных клеток в культуральной жидкости. Для этого определяют титр бактерий в 1 мл культуральной жидкости и пересчитывают его в мг биомассы (по сухому весу), исходя из того, что 10⁹ клеток бактерий весит 0,28 мг [6].

Активность липазы определяют следующим образом. К реакционной смеси, содержащей 4,5 мл 0,05 М фосфатного буфера (рН 8,0) и 5 мл 40%-ной эмульсии оливкового масла в 2%-ном поливиниловом спирте приливают 0,5 мл супернатанта культуральной жидкости. Тест-пробу инкубируют в течение 30 мин при температуре 37°С, после чего добавляют 10 мл смеси этанол:ацетон (1:1). Степень расщепления оливкового масла определяют, оттитровывая продукты гидролиза раствором гидроокиси натрия (0,05 М NaOH), в присутствии 1%-ного тимолфталеина до возникновения голубой окраски. Контрольную пробу обрабатывают аналогично тест-пробе, но липазу вносят непосредственно перед титрованием. Специфическую активность липазы выражают в микромолях олеиновой кислоты, освобождающейся за 1 час при гидролизе субстрата 1 мл культуральной жидкости, в пересчете на количество биомассы, содержащейся в 1 мл культуральной жидкости. Расчет специфической липазной активности (ЛА), в ед акт./мг биомассы (по сухому весу), производят по формуле

ЛА=(V-V_k)·K/t·V_E·C,

где V - количество 0,05 М NaOH, израсходованного на титрование тест-пробы, мл;

V_k - количество 0,05 М NaOH, израсходованного на титрование контрольной пробы, мл;

К - количество олеиновой кислоты, оттитровываемое 1 мл 0,05 М NaOH (К=50), мкмоль;

t - время реакции, час;

V_E - объем культуральной жидкости, добавляемой к реакционной смеси, мл;

С - концентрация биомассы (по сухому весу), мг/мл.

Результаты определения липолитической активности культуральной жидкости, полученной при культивировании штамма Serratia species ИБ 3-1, приведены в таблице. Эти данные свидетельствуют о высокой активности липазы, продуцируемой предлагаемым штаммом микроорганизмов. Так, максимальная специфическая активность фермента штамма Serratia species ИБ 3-1 составляет 1750 мкМ олеиновой кислоты/мг биомассы, что в 2,2 раза превышает величину максимальной специфической активности (800 ед акт./мг биомассы) штамма по прототипу.

Дополнительным преимуществом предлагаемого штамма является то, что помимо высокой специфической активности липазы ферменты, секретируемые штаммом Serratia species ИБ 3-1, способны эффективно утилизировать жиры.

Способность липолитических ферментов, продуцируемых штаммом Serratia species ИБ 3-1, к деструкции твердых жиров животного происхождения определяли следующим образом.

Пример 1. Утилизацию кулинарного жира проводят путем периодического выращивания штамма Serratia species ИБ 3-1 в колбах на качалке (160 об/мин), объем среды 100 мл. Состав минеральной среды, г/л: соевая мука - 25; дрожжевой экстракт - 40; К₂HPO₄ - 5,0; (NH₄)₂SO₄ - 1,0; рН среды 7,0; температура выращивания 28°С. Время выращивания 49 часов. Исходное содержание кулинарного жира составляет 1 мас.%. Оценку роста бактерий проводили микроскопированием на твердой (агаризованной) питательной среде. Степень деструкции твердых жиров определяли весовым методом с использованием процесса экстракции. По окончании процесса ферментации штамма Serratia species ИБ 3-1 титр бактерий в культуральной жидкости составил 3,0·10⁹ КОЕ/мл, а деструкция кулинарного жира - 100%.

Пример 2. Аналогично примеру 1 утилизацию свиного жира проводят путем периодического выращивания штамма Serratia species ИБ 3-1 в колбах на качалке при параметрах процесса и составе питательной среды, приведенным в примере 1. Время выращивания 46 часов. Исходное содержание свиного жира составляет 1 мас.%. По окончании процесса ферментации штамма Serratia species ИБ 3-1 титр бактерий в культуральной жидкости составил 4,0·10⁹ КОЕ/мл, а деструкция свиного жира - 100%.

Пример 3. Аналогично примеру 1 утилизацию говяжьего жира проводят путем периодического выращивания штамма Serratia species ИБ 3-1 в колбах на качалке при параметрах процесса и составе питательной среды, приведенным в примере 1. Время выращивания 92 часа. Исходное содержание говяжьего жира составляет 1 мас.%. По окончании процесса ферментации штамма Serratia species ИБ 3-1 титр бактерий в культуральной жидкости составил 3,0·10⁹ КОЕ/мл, а деструкция говяжьего жира - 90%.

Результаты экспериментов, приведенные в примерах 1-3, свидетельствуют о высокой эффективности процесса биодеструкции твердых жиров животного и растительного происхождения под действием липолитических ферментов, продуцируемых штаммом Serratia species ИБ 3-1.

Таким образом, получен штамм Serratia species ИБ 3-1, обладающий высокой липолитической активностью, который может быть использован в качестве основы биопрепарата для биологической очистки сточных вод или канализационных систем от жиров.

Липолитическая активность штамма Serratia species ИБ 3-1Время культивирования, чЛиполитическая активность, мкМ олеиновой кислоты/мг биомассы (по сухому весу)Штамм Serratia species ИБ 3-1Штамм Serratia marcescens В-10 L-1 (по прототипу)50911078001553530020982160251250423017503135111430409030503030

Список литературы

1. А.С. СССР 1581742 А1, опубл. 30.07.90.

2. А.С. СССР 1726513 А1, опубл. 15.04.92.

3. Р.Rapp. Production, regulation and some properties of lipase activity from Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum // Enzyme and Microbial Technology. - 1995. - V.17. - P.832-838.

4. A.C. СССР 1454852 А1, опубл. 30.01.89.

5. Башкатова Н.А., Северина Л.О. Влияние условий культивирования на биосинтез липазы у Serratia marcescens // Микробиология. - 1979. - Т.68, вып.5. - С.826.

6. Патент RU 2148645 С1, опубл. 10.05.2000.

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и может быть использовано в пищевой промышленности, бытовой химии, косметике. Штамм выделен из образца сточных вод из аэротенка биологических очистных сооружений и поддерживается в коллекции микроорганизмов Института биологии Уфимского научного центра РАН под номером ИБ 3-1. Штамм образует при росте на питательной среде, содержащей соевую муку, дрожжевой экстракт и минеральные компоненты, липазу в количестве 1750 мкМ олеиновой кислоты/мг биомассы, что превосходит по уровню секретирования липазы известные штаммы. 1 табл.

Штамм бактерий Serratia species KM ИБ УНЦ РАН ИБ 3-1 - продуцент липазы.