Штамм гриба RнIZорUS мIсRоSроRUS-продуцент липазы Советский патент 1990 года по МПК C12N9/20 C12N1/14 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению липазы, гидролизующей рыбий жир с образованием полиеновых кислот, способствующих обогащению рыбных продуктов, используемой также для получения жирных кислот и переэтерификаторов на основе растительных масел и животных жиров, потребителями которых являются консервная, молочная и другие подотрасли пищевой промышленности.

Цель изобретения - получение штамма гриба Rhizopus raicrosporus, обладающего высокой способностью к образованию липазы, специфичной к гидролизу рыбьего жира.

Штамм Rhizopus microsporus ,ВКПМ-Р377 (УзЛТ-2) получен адаптацией уже известного штамма Rhizopus microsporus УзЛТ-1 путем отбора колоний на агаризованной среде с кукурузным экстрактом (2%), содержащей в качестве единственного источника углерода рыбий жир. Проводили многократный пересев наиболее активных по липазе вариантов на среде с возрастающим количеством рыбьего жира (от 0,1 до 1,0%).

Морфолого-культуральные признаки штамма. На агаризованных питательных средах - сусло-агаре, среде с кукурузным экстрактом, культура хорошо

сл оо

.

to

растет и образует колонии с пушистым белым воздушным мицелием, который после двух суток покрывается серыми Спорами,

Штамм имеет несептированный мицелий. При поверхностном культивировании споры образуются в шаровидных стилоспорангиях на прямых гтилоспо- рангиеносцах. В глубинной культуре Образуются хламидоспоры.

Культура бесцветная, пигментов не Образует.

Оптимальная температура роста 30- 45°С, при 20 и 55°С рост отсутствует. Хороший рост отмечается в диапазоне рН от 4,0 до 9,0. Оптимальная температура для биосинтеза липазы 39-40 С, рН 4,3-4,5.

Физиолого-биохимические признаки. Штамм слабо коагулирует молоко, хорошо растет на клетчатке и гидролизует крахмал.

В качестве источника углерода культура использует глюкозу, сахарозу, крахмал, галактозу, i-инозит.

Для биосинтеза липазы культурой необходимо наличие в среде индуктора - рыбьего жира, хлопкового, подсолнечного или оливкового масла.

Источниками азотного питания служат азотосодержащие компоненты пептона, дрожжевого автолизата, кукурузного экстракта.

Наилучший рост и биосинтез липазы происходит в среде с кукурузным экстрактом. Значительно слабее штамм растет в присутствии в среде неорганических источников азота в виде/аммо- нийных и нитратных солей.

При культивировании в жидкой питательной среде с кукурузным экстрактом (2%) и рыбьим жиром (1%) при перемешивании и аэрации образуются активная эндо- и экзолипазы. I

Культивирование штамма Rhizopus microsporus (УзЛТ-2) BKJ1MF-377 на питательной среде, содержащей в качестве источника азота кукурузный экстракт, а в качестве источника углерода --рыбий жир при следующем соотно- щении компонентов, %:

Кукурузный экстракт 2-3 Рыбий жир1,0-1,1

Водопроводная вода Остальное обеспечивает увеличение липазной активности и продуктивности культуры.

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

Ниже приводятся данные по зависимости роста и липазной активности культуры от компонентов среды.

Таким образом, оптимальной средой, как видно из табл. 1 и 2 является среда следующего состава, %:

Кукурузный экстракт 2

Рыбий жир 1

Вода водопроводная Остальное

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1 (контрольный). Штамм Rhizopus microsporus УзЛТ-2 культивируют в оптимальной среде, состоящей из кукурузного экстракта 2%, хлопкового масла 1,0%, водопроводной воды, рН 4,. Температура культивирования 39-40°С. Липаэная активность культуры на указанной среде 209-10 Е/л культуральной среды, а абсолютно сухой вес (а.с.в.) биомассы в 1 л питательной среды 9,4 г.-Удельная активность внеклеточных липаз составляет 0,522.104 Е/мг белка.

Пример 2. Колбы объемом 250 мл, содержащие 100 мл питательной среды следующего состава, %: кукурузный экстракт 2, рыбий жир 1, водопроводная вода остальное, рН до стерилизации 4,3-4,5, стерилизуют при 1,0 атм в течение 20 мин, охлаждают до 35 С и засевают 2% посевным материалом.

Колбы с засеянной средой помещают на-круговую качалку (210-230 об/мин) и продуцент культивируют при 39-40°С в течение 24 ч.

Липазная активность культуры в этих условиях 250-10 Е/л культуральной среды, а.с.в. биомассы достигает 15 г/л. Удельная активность внеклеточных липаз составляет 0,595104 Е/мг белка.

ПримерЗ. В 30-литровый ферментер заливают 15 л питательной среды, состав которой указан в примере ,2, стерилизуют в тех же условиях, охлаждают до 40°С, засевают 2% посевного материала и выдерживают при аэрации 1,0-1,2 л/л среды в 1 мин в течение 18 ч. Лииазная активность культуры равна 250 -10 Е/мг белка.

Сравнительная характеристика липа- , зы исходного и адаптированного к рыбьему жиру штаммов Rhizopus raicros- porus представлена в табл„3. --

Как видно из предлагаемых примеров и табл.3, при культивировании штамма

515817426

Rhiaopus microsporus УзЛТ-2 на пита- дуктов, обогащенных полиеновыми кис- тельной среде с рыбьим жиром увеличи- лотами, содержание эйкозопентаеновой

кислоты достигает 20%, а диеновых

вается прирост биомассы более чем в 2. раза и липазная активность на рыбьем жире в 3 раза.

Испытание липазы из Rhizopus mic- irosporus УзЛТ-2 для гидролиза рыбьих жиров показало возможность применения

кислот до 21,5%. Формула изобретения Штамм гриба Rhizopus microsporus

этого фермента при получении рыбопро- 10 ВКПМ F-377 - продуцент липазы.

Таблица1 ПоказателиКонцентрация, %

0,1 J 0,5 1,0 | 1,1 J 1,3

Биомасса,

г а.с.в./л среды 8 10 15 13 10

Липазная актив-,

ность, мл 0,1 н..

КОН/100 мл культурально й жидкости 200 450 670 630 570

Таблица2

ПоказателиКонцентрация, %

0,5 Ј 1,0 | 2,0 j 3,0

Биомасса,

г а.с.в./л среды 5 7 15 15 14 Липазная актив- ность, мл 0,1 н. КОН/100 мл культу- 1альной жидкости 150 340 670 620 535

ТаблицаЗ Сре-ПоказателиЦ1тамм

|Исходный)Предлагаемый

1Биомасса а.с.в./л на среде с хлопковым

маслом10,5 9,4

2Биомасса а.с.в,/л на

среде с рыбьим жиром 6,8 15,0

3Продуктивность, ед/л

w

на среде

1 3.1. с хлопковым

маслом1 7 10t

3.2. с рыбьим жиром . 5, 2,5-Ю6 ч

4Липазная активность, %, на среде

4.1.с оливковым маслом 100 65

4.2.с рыбьим жиром 46 147

кислот до 21,5%. Формула изобретения Штамм гриба Rhizopus microsporus

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению фермента липазы гидролизующего жиры. Цель изобретения - получение штамма гриба RHIZOPUS MICROSPORUS, обладающего высокой способностью к образованию липазы, специфичной к гидролизу рыбьего жира. Штамм RHIZOPUS MICROSPORUS ВКПМ F-377 (УзЛТ-2) получен адаптацией уже известного штамма RHIZOPUS MICROSPORUS УзЛТ-1 к гидролизу рыбьего жира. При культивировании в питательной среде, содержащей, (%): кукурузный экстракт 2, рыбий жир 1, водопроводная вода, PH 4,3-4,5, в аэробных условиях при 39-40°С в течение 18-24 ч культура образует высокоактивную липазу к гидролизу рыбьего жира с активностью 250 .10 4 е/л. а.с.в. биомассы достигает 15 г/л

удельная активность 0,595 .10 4 е/мг белка. Из культуральной жидкости липазу выделяют путем осаждения ацетоном, этанолом, изопропанолом 1:4. Препарат липазы, полученный из культуры, можно использовать для гидролиза рыбьих жиров при получении рыбопродуктов, обогащенных полиеновыми кислотами. Содержание эйкозопентановой кислоты достигает 20%, а диеновых кислот до 21,5%.