СПОСОБ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ И МОНИТОРИНГА ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Российский патент 2005 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины, конкретнее клинической биохимии, а именно к разработке неинвазивных способов ранней диагностики и оценки онкологических заболеваний, а также мониторинга эффективности терапии с помощью измерения концентраций внеклеточных нуклеиновых кислот (РНК, ДНК и ДНК-РНК гибриды), связанных с поверхностью клеток крови.

Диагностика и выявление онкологических заболеваний на ранних стадиях является важной проблемой в медицине. Для диагностики рака используют такие методы, как рентгенологический, эндоскопический, ультразвуковой, морфологический, а также измерение концентрации ДНК в плазме или сыворотке крови онкологических больных. Однако эти методы не позволяют эффективно выявлять онкотрансформацию и не эффективны на ранних стадиях заболевания.

Известен способ ранней диагностики рака при помощи определения концентрации ДНК в сыворотке крови онкологических больных [1], включающий сбор крови самотеком с последующим разделением собранной крови на сыворотку и фракцию клеток крови и определением концентрации ДНК в сыворотке крови при помощи радиоиммунологического метода. Было установлено, что концентрация ДНК в сыворотке крови у здоровых доноров составляет 14±3 нг/мл, у больных с доброкачественными заболеваниями желудка - 118±14 нг/мл, а у онкологических больных - 412±63 нг/мл. Однако корреляции между концентрацией ДНК в сыворотке и размером или локализацией опухоли обнаружено не было.

Недостатками данного способа являются высокая вероятность получения ложноотрицательных результатов, поскольку данный способ не позволяет выявлять все виды онкологических заболеваний, высокая вероятность получения ложноположительных результатов, поскольку увеличение концентрации ДНК в плазме крови наблюдается также при неонкологических заболеваниях (травма [2], аутоиммунные заболевания [3] и т.д.), а также неудобство работы с радиоактивно меченными антителами против ДНК.

Известен способ ранней диагностики рака при помощи определения РНК-протеолипидных комплексов в сыворотке крови онкологических больных [4], включающий сбор крови самотеком с последующим разделением собранной крови на сыворотку и фракцию клеток крови и определением концентрации РНК, спектра липидов и пептидов РНК-протеолипидных комплексов. Сравнительный анализ образцов плазмы крови пациентов с лимфомами (центральной, меридиальной и дистальной) и карциномами (легкого, желудка, кишечника) показал, что спектр липидов и концентрация циркулирующих комплексов зависит от типа опухоли и стадии ее развития.

Недостатками данного способа являются трудоемкость при определении спектра липидов и РНК-протеолипидных комплексов и высокая вероятность получения ложноотрицательных результатов, поскольку данный способ не позволяет выявлять все виды онкологических заболеваний.

Известен способ ранней диагностики меланомы при помощи определения в сыворотке крови пациентов раковой м-РНК, включающий сбор крови самотеком с последующим разделением собранной крови на сывороточную и клеточную фракции и определением РНК в сыворотке крови. Данным способом м-РНК^Tyr обнаруживают лишь в 67% случаев у больных меланомой [5].

Недостатком данного способа являются трудоемкость, высокая вероятность получения ложноотрицательных результатов, низкая чувствительность и специфичность маркера для определенного вида рака.

Ближайшим к заявленному способу прототипом является способ ранней диагностики рака легкого при помощи определения концентрации ДНК в плазме крови онкологических больных [6], включающий сбор крови самотеком с последующим разделением собранной крови на плазму и фракцию клеток крови и определением концентрации ДНК в плазме крови онкологических больных. ДНК из плазмы крови больных раком легкого выделяли при помощи набора для выделения QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Канада), концентрацию выделенной ДНК определяли при помощи DNA DipStick TM Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA). Концентрация ДНК в плазме у здоровых доноров (n=43) составила 18 нг/мл, у пациентов с первичным плоскоклеточным раком легкого I стадии (n=46)- 320-344 нг/мл, у пациентов II и III стадии (n=15 и n=23)- 304 и 290 нг/мл соответственно. Было показано, что при успешном хирургическом вмешательстве уровень раковой ДНК в плазме снижается в несколько раз по сравнению с уровнем до операции (n=35).

Недостатками данного способа являются высокая вероятность получения ложноотрицательных результатов, поскольку данный способ не позволяет выявлять все виды онкологий, высокая вероятность получения ложноположительных результатов, поскольку увеличение концентрации ДНК в плазме крови наблюдается также при неонкологических заболеваниях (травма [2], аутоиммунные заболевания [3], воспалительные процессы в легких).

Технической задачей изобретения является разработка более достоверного скринингового способа ранней диагностики и мониторинга онкологических заболеваний.

Поставленная задача достигается предлагаемым способом, который заключается в разделении крови на плазму и клеточную фракцию, элюции внеклеточных нуклеиновых кислот (ВНК), связанных с клеточной поверхностью форменных элементов крови с их последующим выделением и определением концентрации ВНК.

Способ заключается в следующем:

1) Сбор крови самотеком при помощи иглы для переливания крови в антисвертывающий раствор, содержащий PBS (10 мМ фосфатный буфер, рН 7,5, 0,15 М NaCl), 10 мМ ЭДТА;

2) Разделение собранной крови на плазму и фракцию клеток крови при помощи центрифугирования в течение 20 мин при 400 g;

3) Элюция ВНК, связанных с поверхностью клеток форменных элементов крови, 10 объемами PBS, содержащим 5 мМ ЭДТА в течение 5 мин при медленном перемешивании при 4°С с последующим осаждением клеток центрифугированием и отделением супернатанта;

4) Элюция ВНК, связанных с поверхностью клеток форменных элементов крови, равным объемом 0,25% раствора трипсина в течение 3 мин при медленном перемешивании, с последующим добавлением ингибиторов фермента, осаждением клеток центрифугированием и отделением супернатанта;

5) выделение ВНК из полученных супернатантов;

6) измерение концентрации ВНК, связанных с поверхностью клеток крови.

Для выделения ВНК могут быть использованы любые пригодные методы выделения НК, а именно:

1) методы, основывающиеся на фенол-хлороформной экстракции [7];

2) гуанидин-фенольный метод [8];

3) седиментационные методы, основанные на центрифугировании образца через градиент плотности раствора хлорида цезия или иного вещества [9];

4) метод выделения НК при помощи мелкодисперсного стекла в присутствии хаотропных солей [10, 11]

Для измерения концентрации ВНК, связанных с поверхностью клеток форменных элементов крови, могут быть использованы любые пригодные методы измерения НК, например:

1) количественный ОТ-ПЦР и ПЦР [5, 12];

2) метод измерения концентрации НК при помощи флуоресцентных красителей (Hoechst 32258, SYBR Green II, DAPI и т.д.) [13, 14];

3) иммунологические методы измерение концентрации НК [1].

Определяющими отличительными признаками предлагаемого способа по сравнению с прототипом являются:

1) Использование в качестве диагностического критерия значения концентрации ВНК, связанных с поверхностью клеток форменных элементов крови, что позволяет повысить достоверность ранней диагностики онкологических заболеваний и осуществить мониторинг противораковой терапии.

2) Проведение последовательной двухстадийной элюции ВНК, неспецифически связанных с поверхностью клеток крови (нековалентными взаимодействиями), так и находящихся в комплексах с белками клеточной поверхности, что позволяет количественно выделять ВНК, связанные с поверхностью форменных элементов крови.

Использование изобретения позволяет выявлять возникновение онкологических заболеваний на ранних стадиях без использования инвазивных методов диагностики, дифференцировать доброкачественные и злокачественные новообразования и осуществлять мониторинг эффективности антираковой терапии.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения способа.

Пример 1:

Была исследована концентрация ВНК, связанных с поверхностью клеток крови у здоровых доноров (n=9), у пациентов с доброкачественными новообразованиями (n=4) и у пациентов с раком молочной железы (n=12) на различных стадиях заболевания. У всех пациенток была взята кровь во время первичного установления диагноза. Кровь была собрана самотеком при помощи иглы для переливания крови в антисвертывающий раствор, содержащий PBS, 10 мМ ЭДТА. Собранную кровь разделили на плазму и фракцию клеток крови при помощи центрифугирования в течение 20 мин при 400 g. BHK, неспецифически связанные с поверхностью клеток крови, элюировали 10 объемами PBS, содержащего 5 мМ ЭДТА, в течение 5 мин при медленном перемешивании при 4°С, затем клетки осаждали центрифугированием 5 мин при 400 g и отбирали супернатант. Далее BHK, находящихся в комплексах с белками клеточной поверхности, элюировали обработкой клеток равным объемом 0,25% раствора трипсина в течение 3 мин при медленном перемешивании, трипсин инактивировали добавлением ингибитора фермента из соевых бобов. Клетки осаждали центрифугированием 5 мин при 400 g и отбирали супернатант. Из полученных супернатантов выделяли BHK при помощи сорбции нуклеиновых кислот на мелкодисперсном стекле [10]. Концентрация выделенных BHK, связанных с поверхностью эритроцитов и лейкоцитов, была определена при помощи флуоресцентных красителей Hoechst и SYBR Green II [13, 14]. Полученные данные по значениям концентраций BHK, связанных с поверхностью клеток крови здоровых доноров (таб.№1) и онкологических больных (таб.№2), представлены в таблицах.

Из таблицы 1 видно, что у здоровых доноров основная масса BHK крови связана с клеточной поверхностью: процентное содержание BHK, связанных с поверхностью клеток крови, составляет от 98 до 100%, в то время как процентное содержание BHK в плазме крови здоровых доноров составляет 0-2%, а из таблицы 2 видно, что BHK, связанные с поверхностью клеток крови, у пациенток с раком молочной железы не обнаружены, что подтверждает высокую достоверность предлагаемого способа диагностики в отличие от прототипа.

Данный пример иллюстрирует возможность использования разработанного способа для ранней диагностики онкологических заболеваний у пациентов, являющихся группой риска, а также возможность дифференцировки доброкачественных и злокачественных новообразований с помощью измерения концентраций ВНК, связанных с поверхностью форменных элементов крови.

Пример 2:

Была исследована концентрация ВНК, связанных с поверхностью клеток крови у здоровых доноров (n=9), а также у пациентов, имеющих хронические неспецифические заболевания легких (являются группой риска) (n=6), и у больных раком легкого на различных стадиях заболевания (n=9). У всех пациентов была взята кровь во время первичного установления диагноза. Кровь была собрана самотеком при помощи иглы для переливания крови в антисвертывающий раствор, содержащий PBS, 10 мМ ЭДТА. Кровь была разделена на плазму и клеточную фракцию, а ВНК, неспецифически связанные с поверхностью клеток крови, были сэлюированы аналогично примеру 1. Из полученных элюатов были выделены ВНК, как описано в [8, 11]. Концентрация выделенных ВНК, связанных с поверхностью форменных элементов крови, была определена при помощи количественного ПЦР и ОТ-ПЦР [5, 12]. Полученные данные по концентрации ВНК, связанных с поверхностью клеток крови у пациентов, имеющих хронические неспецифические заболевания легких, и у онкологических больных, представлены в таблице №3.

Данный пример иллюстрирует возможность использования разработанного способа для ранней диагностики онкологических заболеваний у пациентов, являющихся группой риска, а также возможность дифференцировки неонкологических и онкологических заболеваний с помощью измерения концентраций ВНК, связанных с поверхностью форменных элементов крови.

Пример 3:

Больной В., 1955 г.р., поступившей в онкологический диспансер с подозрением на рак молочной железы, была проведена диагностика заявляемым способом. ВНК, связанных с поверхностью клеток крови, не обнаружено. Диагноз был подтвержден. Больной была проведена операция с последующей лучевой терапией. Через 8 месяцев провели мониторинг эффективности лечения путем вторичной диагностики онкологического заболевания. Концентрация ВНК, связанных с поверхностью клеток крови у больной В, составила 982 нг/мл. В результате мониторинга установлено отсутствие онкологического заболевания.

Пример 4:

У больной Ш., 1947 г.р., поступившей в онкологический диспансер с диагнозом рак молочной железы, кровь была взята до проведения антираковой терапии. Было обнаружено отсутствие ВНК, связанных с поверхностью клеток крови, т.е. заявленным способом диагноз был подтвержден. После секторальной резекции выполнена пастэктомия с последующей лучевой терапией, по обычной методике и 6 курсов адъювантной полихимиотерапии. Через 8 месяцев больной Ш. был проведен мониторинг эффективности лечения онкологического заболевания заявляемым способом. Было обнаружено отсутствие ВНК, связанных с поверхностью клеток крови, т.е. заявленным способом была установлена недостаточность антираковой терапии, однако больная Ш. не получила дополнительного лечения. Через 5 месяцев молниеносно развился раковый лимфангоит, поражение печени с выраженными симптомами интоксикации и дыхательной недостаточности 3 степени. При вторичном поступлении в онкологический диспансер у больной снова проанализировали кровь заявляемым способом. Было обнаружено отсутствие ВНК, связанных с поверхностью клеток крови, т.е. заявленным способом диагноз был подтвержден. В результате мониторинга установлена неэффективность хирургического, лучевого и химиотерапевтического лечения и прогрессирование онкологического заболевания.

Использование предлагаемого способа позволит по сравнению с прототипом:

- повысить достоверность диагностики за счет использования более специфичного диагностического показателя;

- исключить вероятность получения ложноположительных или ложноотрицательных результатов анализа;

- расширить область применения способа за счет возможности ранней диагностики всех видов онкологических заболеваний.

Таблица №2.№ пациентадиагнозстадияВНК в плазме, нг/мл кровиВНК, связанные с поверхностью клеток крови, нг/мл крови    PBS, содержащий 5 mM ЭДТАтрипсиновая обработка   ДНКРНКДНКРНКДНКРНК1РакT₁N₀M₀306000002молочнойT₁N₀M₀219000003железыT₁N₀M₀105000004 T₁N₀M₀300000о5 T₂N₀M₀4200о0о6 T₂N₁M₀1000о0о7 T₂N₁M₀22800о0о8 T₂N_xM₀108500о0о9 T₄⁵N₁M₀45200о0о10 T₄⁵N₁M₀89000о0о11 T₄⁵N₁M₀4600о0о12 T₄⁵N₁M₀3400ооо13фиброаденома500о10203614 380оо152815цистэпителиома990301239561416 1210285398660

Таблица №3.№ пациентадиагнозстадияВНКв плазме, нг/мл кровиВНК, связанные с поверхностью клеток крови, нг/мл крови    PBS, содержащий 5 mM ЭДТАтрипсиновая обработка   ДНКРНКДНКРНКДНКРНК1ракT₂N₀M₀61129400002легкогоT₂N₀M₀4142000003 T₂N₀M₀3534400004 T₂N₀M₀4836400005 T₂N₀M₀9938800006 T₃N₀M₀17314000007 T₃N₀M₀129330600008 T₃N₀M₀7241000009 T₃N₀M₀821608000010хронические0164245318412030111неспецифические611682215418735819912заболевания01708146282325713легких164011003511525214 01911288318791515 6018580566399303

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Shapiro В., Chakrabarty M., Cohn E., Leon S. Determination of circulating DNA levels in patients with benign or malignant gastrointestinal disease // Cancer, 1983, V.51, P.2116-2120.

2. Rainer Т., Lo D., Chan L., Lam N., Lit L., Cocks R. Derivation of a prediction rule for posttraumatic organ failure using plasma DNA and other variables. Annals of the New York Academy of Sciences, 2001, V.945, P.211-220.

3. Raptis L., Menard H. Quantitation and characterization of plasma DNA in normals and patients with systemic lupus erythematosus // J.Clin. Invest., 1980, V.66, №12, Р.1391-1399.

4. Wieczorek A., Sitaramam V., Machleidt W., Rhyner K., Perruchoud A., Block L. Diagnostic and prognostic value of RNA-proteolipid in sera of patients with malignant disorders following therapy: first clinical evaluation of a novel tumor marker // Cancer Res., 1987, V.47, P.6407-6412.

5. Kopreski M., Benko F., Kwak L., Gocke C. Detection of tumor messenger RNA in the serum of patients with malignant melanoma // Clin.Cancer Res., 1999, V.5, P.1961-1965.

6. Sozzi G, Conte D., Mariani L., Vullo S., Roz L., Lombargo C., Pierotti M., Tavecchio L. Analysis of circulating tumor DNA in plasma at diagnosis and during follow-up of lung cancer patients // Cancer Res., 2001, V.61, P.4675-4678.

7. Short protocols in molecular biology. Third edition. Wiley, 1995, P.4-7.

8. Chomezynski P., Mackey K. Single-step method of total RNA isolation by acid Guanidine-Phenol extraction // Organelles and cellular structures., 1996, V.10, P.221-224.

9. Short protocols in molecular biology. Third edition. Wiley, 1995, P.4-4 - 4-5.

10. Beld M., Sol C., Goudsmit Fractionation ofnucleic acids into single-stranded and double-stranded forms // Nucl. Acids Res. 1996, V.24, P.2618-2619.

11. Boom R., Sol C.J.A.Rapid and simple method for purification nucleic acids // J.Clin. MicrobioL, 1990, V.28, P.495-503.

12. Diviacco S., Norio P., Zentilin L., Menzo S., Clementi M., Biamonti G., Riva S., Falaschi A., Giacca M. A novel procedure for quantitative polymerase chain reaction by coamplification of competitive templates // Gene, 1992, V.122, P.313-320.

13. Schmidt D., Ernst J. A fluorometric assay for the quantification of RNA in solution with nanogram sensitivity // Analitical Biochemistry, 1995, V.232, P.144-146.

14. Labarca С., Paigen К. A simple, rapid, and sensitive DNA assay procedure // Anal. Biochem., 1980, V.102, P.344-352.

Изобретение относится к области клинической биохимии и может быть использовано для ранней диагностики рака. Сущность изобретения состоит в том, что определяют концентрацию внеклеточных нуклеиновых кислот, связанных с клеточной поверхностью форменных элементов крови в суммарной фракции, полученной путем двухстадийной элюции фракции клеток крови, и при нулевом значении этого показателя диагностируют рак. Техническим результатом является повышение достоверности диагностики на ранних сроках развития заболевания. 2 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Способ ранней диагностики рака путем определения концентрации нуклеиновой кислоты в крови больных, отличающийся тем, что определяют концентрацию внеклеточных нуклеиновых кислот, связанных с клеточной поверхностью форменных элементов крови, и при нулевом значении этого показателя диагностируют рак.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрацию внеклеточных нуклеиновых кислот определяют в суммарной фракции, полученной путем двухстадийной элюции фракции клеток крови.3. Способ по п.2, отличающийся тем, что первую элюцию внеклеточных нуклеиновых кислот, связанных с клеточной поверхностью форменных элементов крови, осуществляют 10 объемами PBS, содержащим 5 мМ ЭДТА при 4°С, с последующим осаждением клеток центрифугированием и сбором супернатанта, а вторую элюцию проводят равным объемом 0,25% раствора трипсина с последующим добавлением ингибиторов фермента, осаждением клеток центрифугированием и сбором супернатанта.