СПОСОБЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ ОПУХОЛЕЙ, ВОСПРИИМЧИВЫХ К ЛЕЧЕНИЮ АНТИТЕЛАМИ ПРОТИВ ErbB2 Российский патент 2008 года по МПК C07K14/485 G01N33/53 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способам идентификации опухоли, восприимчивой к лечению антителами против HER2, а также к способам лечения субъектов, имеющих такие опухоли.

Уровень техники

Члены семейства рецепторов тирозинкиназ ErbB являются важными медиаторами роста, дифференцировки и выживания клеток. Указанное семейство рецепторов состоит из четырех отдельных членов, включающих в себя рецепторы эпидермального фактора роста (EGFR или ErbB1), HER2 (ErbB2 или р185^neu), HER3 (ErbB3) и HER4 (ErbB4 или tyro2).

Рецептор EGFR, кодируемый геном erbB1, встречается в злокачественных новообразованиях человека. В частности, повышенная экспрессия EGFR обнаружена в раковых опухолях молочной железы, мочевого пузыря, легкого, головы, шеи и желудка, а также в глиобластомах. Повышенная экспрессия рецепторов EGFR часто взаимосвязана с повышенным продуцированием лиганда EGFR, трансформирующего фактора роста альфа (TGF-α), теми же опухолевыми клетками, в результате чего происходит активация данного рецептора по аутокринному пути стимуляции. Baselga and Mendelsohn Pharmac. Ther., 64:127-154 (1994). Кроме того, в научной литературе описан белок, относящийся к рецептору эпидермального фактора роста (ERRP), где клонированный фрагмент кДНК, содержащий 1583 пар оснований, на 90-95% гомологичен последовательности EGFR мыши и усеченной последовательности EGFR крысы (патент США № 6399743 и публикация патента США № 2003/0096373). Моноклональные антитела против EGFR или его лигандов, TGF-α и EGF, признаны терапевтическими средствами, пригодными для лечения таких злокачественных новообразований. См., например, приведенную выше публикацию Baselga and Mendelsohn; Masui et al., Cancer Research, 44:1002-1007 (1984); и Wu et al., J. Clin. Invest., 95:1897-1905 (1995).

Второй член семейства ErbB, p185neu, первоначально был идентифицирован в качестве продукта трансформирующего гена в нейробластомах крыс, подвергнутых химическому воздействию. Активированная форма протоонкогена neu возникает в результате точковой мутации (замена валина глутаминовой кислотой) в трансмембранной области кодированного белка. Амплификация гомолога рецептора neu (HER2) человека обнаружена в раковых опухолях молочной железы и яичника и может служить основанием для плохого прогноза (Slamon et al., Science, 235:177-182 (1987); Slamon et al., Science, 244:707-712 (1989) и патент США № 4968603). До настоящего времени в научной литературе не сообщалось о точковой мутации, аналогичной вышеуказанной мутации в протоонкогене neu, для опухолей человека. Сверхэкспрессия ErbB2 (часто, но не всегда возникающая вследствие амплификации гена) была обнаружена также в других карциномах, включая карциномы желудка, эндометрия, слюнной железы, легкого, почки, ободочной кишки, щитовидной железы, поджелудочной железы и мочевого пузыря. См. публикации King et al., Science, 229:974 (1985); Yokota et al., Lancet, 1:765-767 (1986); Fukushigi et al., Mol Cell Biol., 6:955-958 (1986); Geurin et al., Oncogene Res., 3:21-31 (1988); Cohen et al., Oncogene, 4:81-88 (1989); Yonemura et al., Cancer Res., 51:1034 (1991); Borst et al., Gynecol. Oncol., 38:364 (1990); Weiner et al., Cancer Res., 50:421-425 (1990); Kern et al., Cancer Res., 50:5184 (1990); Park et al., Cancer Res., 49:6605 (1989); Zhau et al., Mol. Carcinog., 3:354-357 (1990); Aasland et al., Br. J.Cancer, 57:358-363 (1988); Williams et al., Pathiobiology, 59:46-52 (1991) и McCann et al., Cancer, 65:88-92 (1990). ErbB2 может быть сверхэкспрессирован в раковой опухоли предстательной железы (Gu et al., Cancer Lett., 99:185-9 (1996); Ross et al., Hum. Pathol., 28:827-33 (1997); Ross et al., Cancer, 79:2162-70 (1997) и Sadasivan et al., J. Urol., 150:126-31 (1993)). Сверхэкспрессия ErbB2 может вызвать рост опухоли вследствие лиганд-независимой активации ErbB2 или гомодимеров ErbB2.

В научной литературе описаны антитела против p185neu крысы и белковых продуктов ErbB2 человека. Дребин с коллегами создали антитела против генного продукта neu крыс, p185neu. См., например, публикации Drebin et al., Cell, 41:695-706 (1985); Myers et al., Meth. Enzym., 198:277-290 (1991) и WO 94/22478. В публикации Drebin et al., Oncogene, 2:273-277 (1988) указано, что смеси антител, взаимодействующих с двумя разными областями p185neu, оказывают синергическое противоопухолевое действие на neu-трансформированные клетки NIH-3T3, имплантированные "голым" мышам. См. также патент США № 5824311, выданный 20 октября 1998 г.

В публикации Hudziak et al., Mol. Cell. Biol., 9(3):1165-1172 (1989) описано создание панели антител против ErbB2, которые были исследованы с использованием линии опухолевых клеток молочной железы человека SK-BR-3. Пролиферацию клеток SK-BR-3 под воздействием указанных антител определяли методом окрашивания монослоев кристаллическим фиолетовым через 72 часа. В результате выполнения данного анализа было установлено, что максимальное ингибирование достигалось при использовании антитела, получившего название 4D5, которое подавляло пролиферацию клеток на 56%. Другие антитела в данной панели уменьшали пролиферацию клеток в меньшей степени при выполнении указанного анализа. Далее было обнаружено, что антитело 4D5 повышает чувствительность линий опухолевых клеток молочной железы, сверхэкспрессирующих ErbB2, к цитотоксическому действию TNF-α. См. также патент США № 5677171, выданный 14 октября 1997 г. Антитела против ErbB2, рассмотренные в публикации Hudziak et al., далее описаны в публикациях in Fendly et al., Cancer Research, 50:1550-1558 (1990); Kotts et al., In Vitro, 26(3):59A (1990); Sarup et al., Growth Regulation, 1:72-82 (1991); Shepard et al., J. Clin. Immunol., 11(3):117-127 (1991); Kumar et al., Mol. Cell. Biol., 11(2):979-986 (1991); Lewis et al., Cancer Immunol. Immunother., 37:255-263 (1993); Pietras et al., Oncogene, 9:1829-1838 (1994); Vitetta et al,. Cancer Research, 54:5301-5309 (1994); Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20):14661-14665 (1994); Scott et al., J. Biol. Chem., 266:14300-5 (1991); D'souza et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 91:7202-7206 (1994); Lewis et al., Cancer Research., 56:1457-1465 (1996) и Schaefer et al., Oncogene 15:1385-1394 (1997).

Рекомбинантный гуманизированный вариант антитела 4D5 против ErbB2 (huMAb 4D5-8, rhuMAb HER2 или HERCEPTIN®; патент США № 5821337), является клинически активным у субъектов, имеющих метастатические раковые опухоли молочной железы, сверхэкспрессирующие ErbB2, которые были подвергнуты интенсивной противораковой терапии (Baselga et al., J. Clin. Oncol., 14:737-744 (1996)). Препарат HERCEPTIN® был разрешен к продаже Управлением по контролю за продуктами и лекарствами 25 сентября 1998 г. для лечения субъектов, имеющих метастатические раковые опухоли молочной железы, сверхэкспрессирующие ErbB2. Однако не все опухоли, сверхэкспрессирующие ErbB2, являются восприимчивыми к лечению препаратом HERCEPTIN®. (Brockhoff et al., Cytometry, 44:338-48 (2001)). Кроме того, данные доклинических исследований позволяют предположить, что HERCEPTIN® может быть терапевтически эффективен при лечении немелкоклеточного рака легкого (NSCLC). Белок HER2 сверхэкспрессирован в 20-66% удаленных опухолей NSCLC, при этом во многих исследованиях было установлено, что наличие указанного белка может служить основанием для плохого прогноза у субъекта (Azzoli, C.G. et al., Semin. Oncol., 29(Suppl 4):59-65 (2002)).

Другие антитела против ErbB2, обладающие разными свойствами, описаны в публикациях Tagliabue et al., Int. J. Cancer, 47:933-937 (1991); McKenzie et al., Oncogene, 4:543-548 (1989); Maier et al., Cancer Res., 51:5361-5369 (1991); Bacus et al., Molecular Carcinogenesis, 3:350-362 (1990); Stancovski et al., PNAS (USA), 88:8691-8695 (1991); Bacus et al., Cancer Research, 52:2580-2589 (1992); Xu et al., Int. J. Cancer, 53:401-408 (1993); WO 94/00136; Kasprzyk et al., Cancer Research, 52:2771-2776 (1992); Hancock et al., Cancer Res., 51:4575-4580 (1991); Shawver et al., Cancer Res., 54:1367-1373 (1994); Arteaga et al., Cancer Res., 54:3758-3765 (1994); Harwerth et al., J. Biol. Chem., 267:15160-15167 (1992); патент США № 5783186 и Klapper et al., Oncogene, 14:2099-2109 (1997). Моноклональное антитело 2С4 описано в заявке на патент WO 01/00245, которая включена в данное описание изобретения в качестве ссылки. Установлено, что антитело 2С4 разрушает димеры, образуемые HER2 с другими членами семейства рецепторов ErbB (WO 01/00245).

Исследование гомологии позволило идентифицировать два других члена семейства рецепторов ErbB, в частности ErbB3 (патенты США №№ 5183884 и 5480968, а также публикация Kraus et al., PNAS (USA), 86:9193-9197 (1989)) и ErbB4 (заявка на европейский патент № 599274; публикации Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1746-1750 (1993) и Plowman et al., Nature, 366:473-475 (1993)). Оба указанных рецептора характеризуются повышенной экспрессией по меньшей мере в некоторых линиях раковых клеток молочной железы.

Рецепторы ErbB обычно встречаются в клетках в разных комбинациях, при этом считается, что гетеродимеризация увеличивает спектр реакций клеток на разные лиганды ErbB (Earp et al., Breast Cancer Research and Treatment, 35:115-132 (1995)). Однако до сих пор полностью не понят механизм агрегации указанных рецепторов и его влияние на передачу сигналов (Brennan, P.J. et al., Oncogene, 19:6093-6101 (2000)). Рецептор EGFR связывается шестью разными лигандами, такими как эпидермальный фактор роста (EGF), трансформирующий фактор роста альфа (TGF-α), амфирегулин, гепарин-связывающий эпидермальный фактор роста (HB-EGF), бетацеллулин и эпирегулин (Groenen et al., Growth Factors, 11:235-257 (1994)). Семейство белков герегулина, образующихся в результате поочередного сплайсинга одного гена, представляет собой лиганды для ErbB3 и ErbB4. Семейство герегулинов включает альфа-, бета- и гамма-герегулины (Holmes et al., Science, 256:1205-1210 (1992); патент США № 5641869 и Schaefer et al., Oncogene, 15:1385-1394 (1997)); факторы дифференцировки neu (NDF); глиальные факторы роста (GGF); активность, индуцирующая рецептор ацетилхолина (ARIA); фактор сенсорных и двигательных нейронов (SMDF). См. публикации Groenen et al., Growrh Factors, 11:235-257 (1994); Lemke, G., Molec. & Cell. Neurosci., 7:247-262 (1996) и Lee et al., Pharm. Rev., 47:51-85 (1995). Недавно были идентифицированы три дополнительных лиганда ErbB, а именно нейрегулин-2 (NRG-2), который, как указывают, связывается с ErbB3 или ErbB4 (Chang et al., Nature, 387:509-512 (1997) и Carraway et al., Nature, 387:512-516 (1997)); нейрегулин-3, который связывается с ErbB4 (Zhang et al., PNAS (USA), 94(18):9562-7 (1997)), и нейрегулин-4, который связывается с ErbB4 (Harari et al., Oncogene, 18:2681-89 (1999)). HB-EGF, бетацеллулин и эпирегулин также связываются с ErbB4.

Хотя EGF и TGFα не связываются с ErbB2, EGF стимулирует образование гетеродимера между EGFR и ErbB2, что активирует EGFR и вызывает трансфосфорилирование ErbB2 в гетеродимере. Димеризация и/или трансфосфорилирование, по-видимому, активируют тирозинкиназу ErbB2. См. приведенную выше публикацию Earp et al. Аналогичным образом герегулин не связывается с ErbB2, но при коэкспрессии ErbB3 с ErbB2 образуется активный комплекс передачи сигнала (Nagy et al., Cytometry, 32:120-31 (1998). Антитела против ErbB2 могут разрушать указанный комплекс (Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20):14661-14665 (1994)). ErbB3 не содержит тирозинкиназы, поэтому ему необходимо образовать гетеродимер предпочтительно с ErbB2, чтобы приобрести способность трансдукции сигнала (Graus-Porta et al., EMBO J., 16:1647-55 (1995)). Кроме того, сродство ErbB3 к герегулину (HRG) достигает более высокой степени при коэкспрессии с ErbB2. См. также публикации Levi et al., Journal of Neuroscience, 15:1329-1340 (1995); Morrissey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:1431-1435 (1995) и Lewis et al., Cancer Res., 56:1457-1465 (1996) для ознакомления с белковым комплексом ErbB2-ErbB3. ErbB2 действительно является предпочтительным партнером для образования гетеродимера как с EGFR, так и с ErbB3 (Graus-Porta et al., см. выше). ErbB4, подобно ErbB3, образует активный комплекс передачи сигнала с ErbB2 (Carraway and Cantley, Cell, 78:5-8 (1994)). Лиганд-зависимая гетеродимеризация ErbB2 с EGFR или ErbB3 может стимулировать рост опухолей, экспрессирующих ErbB2.

Экспрессия рецепторов ErbB и герегулина и фосфорилирование HER2 были исследованы в образцах опухоли, полученных у субъектов с первичным раком молочной железы, и карциноме мочевого пузыря (Esteva et al., Pathol. Oncol. Res., 7:171-177 (2001); Chow et al., Clin. Cancer Res., 7:1957-1962 (2001). Корреляция между активной передачей сигнала Her2/neu, клинической патологией и прогнозом у субъекта в отношении рака молочной железы описана в публикациях Thor et al., J. Clin. Oncology, 18:3230-3239 (2000) и DiGiovanna et al., Cancer Res., 62:6667-6673 (2002).

Сущность изобретения

Одним объектом настоящего изобретения является способ идентификации опухоли, восприимчивой к лечению антителами против HER2. Антитело против HER2 предпочтительно блокирует активацию лигандом гетеродимера ErbB, содержащего HER2. В одном варианте осуществления изобретения указанное антитело является моноклональным антителом 2С4, более предпочтительно rhuMAb 2C4.

Полученный образец опухоли исследуют на наличие белкового комплекса HER2/HER3, и/или HER2/HER1, и/или HER2/HER4. Опухоль, в которой обнаружен указанный комплекс, считается восприимчивой к лечению антителом против HER2.

В одном варианте осуществления изобретения комплекс обнаруживают методом иммунопреципитации любых белковых комплексов, содержащих HER2, при помощи антитела против HER2. Затем образовавшие иммунопреципитат комплексы вводят в соприкосновение с антителом, выбранным из группы, состоящей из антител против HER3, антител против НER1 и антител против HER4, и определяют любое связывание. Комплекс HER2/HER3, и/или HER2/HER1, и/или HER2/HER4 считается обнаруженным, если установлено, что антитела против HER3, и/или HER1, и/или HER4 связываются с образовавшими иммунопреципитат комплексами.

В другом варианте осуществления изобретения наличие белкового комплекса HER2/HER3, и/или HER2/HER1, и/или HER2/HER4 определяют, осуществляя контактирование образца опухоли с антителом против HER2, содержащим первый флуорофор. Образец опухоли затем вводят в соприкосновение с антителом, выбранным из группы, состоящей из антител против HER3, и/или HER1, и/или HER4, причем указанное антитело содержит второй флуорофор. Затем измеряют перенос резонансной энергии флуоресценции, чтобы определить пространственную близость первого и второго флуорофоров. Белковый комплекс HER2/HER3, и/или HER2/HER1, и/или HER2/HER4 обнаруживают в том случае, если первый и второй флуорофоры находятся в непосредственной близости друг от друга.

В другом варианте осуществления изобретения наличие комплекса HER2/HER3, и/или HER2/HER1, и/или HER2/HER4 определяют путем осуществления контактирования образца опухоли с первым связывающим соединением. Первое связывающее соединение содержит часть, связывающуюся с первой мишенью, которая специфически связывается с HER2. Часть, связывающаяся с первой мишенью, предпочтительно является антителом против HER2 или фрагментом указанного антитела. Первое связывающее соединение далее содержит детектируемую часть, которая связана с первым связывающим доменом при помощи расщепляемого линкера.

Образец опухоли вводят в соприкосновение со вторым связывающим соединением. Второе связывающее соединение предпочтительно содержит часть, связывающуюся со второй мишенью, которая специфически связывается с HER3, или HER1, или HER4 и предпочтительно не связывается с HER2. В другом варианте осуществления изобретения второе связывающее соединение связывается с HER3 или HER1 и не связывается с HER2 или HER4. В другом варианте осуществления изобретения часть, связывающаяся со второй мишенью, является антителом против HER3, или HER1 или HER4 или фрагментом указанного антитела. В результате активации второе связывающее соединение способно расщеплять расщепляемый линкер в первом связывающем соединении, в результате чего образуется свободная детектируемая часть, если первое связывающее соединение и второе связывающее соединение находятся в непосредственной близости друг от друга. Наличие белкового комплекса HER2/HER3, или HER2/HER1, или HER2/HER4 определяют по присутствию свободной детектируемой части. В одном варианте осуществления изобретения наличие свободной детектируемой части определяют методом капиллярного электрофореза.

В другом варианте осуществления изобретения первое связывающее соединение содержит домен, связывающийся с первой мишенью, который специфически связывается с HER1, или HER3, или HER4, и второе связывающее соединение содержит домен, связывающийся со второй мишенью, который специфически связывается с HER2.

В другом варианте осуществления изобретения наличие белкового комплекса HER2/HER3, и/или HER2/HER1, и/или HER2/HER4 и активацию HER2 определяют путем измерения фосфорилирования рецептора ErbB, например, методом иммунопреципитации белка HER2 с последующим выполнением иммунологического анализа фосфотирозина методом вестерн-блоттинга.

Образец опухоли, предназначенный для анализа на наличие белковых комплексов HER2/HER3, и/или HER2/HER1, и/или HER2/HER4, предпочтительно получают у субъекта, имеющего данную опухоль. Такой образец можно получить, например, при помощи биопсии. В другом варианте осуществления изобретения образец получают путем выделения циркулирующих опухолевых клеток субъекта. В другом варианте осуществления изобретения указанный образец получают во время хирургического удаления опухоли у субъекта.

В другом варианте осуществления изобретения образец опухоли получают у млекопитающего, не являющегося субъектом, у которого первоначально возникла данная опухоль. Такой образец предпочтительно получают у мыши или другого грызуна. Указанная опухоль более предпочтительно является ксенотрансплантированной опухолью. Ксенотрансплантированную опухоль предпочтительно продуцируют путем трансплантации фрагмента опухоли человека мыши или другому грызуну.

В другом варианте осуществления изобретения опухоль является опухолью легкого, более предпочтительно опухолью немелкоклеточного рака легкого. В другом варианте осуществления изобретения опухоль является опухолью молочной железы.

Другим объектом данного изобретения является способ идентификации опухолевых клеток, восприимчивых к воздействию антитела, ингибирующего связывание HER2 с другим членом семейства рецепторов ErbB, который включает в себя стадии (а) получения биологического образца, содержащего HER2-положительные опухолевые клетки, и (b) обнаружение фосфорилирования рецептора ErbB в данном биологическом образце, которое свидетельствует о том, что указанные опухолевые клетки чувствительны к воздействию данного антитела. В одном варианте осуществления изобретения обнаруживают фосфорилирование рецептора ErbB2 (HER2).

Как указывалось выше, другим членом, связанным с HER2, является HER3, HER1 и/или HER4, в частности HER2 и/или HER1. Данный способ может дополнительно включать в себя стадию определения наличия белкового комплекса HER2/HER3, и/или HER2/HER1, и/или HER2/HER4 вышеописанными методами.

Другим объектом данного изобретения является способ прогнозирования реакции субъекта, у которого обнаружена HER2-положительная опухоль, на лечение антителом, ингибирующим связывание HER2 с другим членом семейства рецепторов ErbB, путем обнаружения образования белковых комплексов HER2/HER3, и/или HER2/HER1, и/или HER2/HER4 и/или фосфорилирования рецептора ErbB в биологическом образце, содержащем HER2-положительные опухолевые клетки, который был получен у данного субъекта. Наличие таких белковых комплексов и/или фосфорилирования свидетельствует о том, что данный субъект, по-видимому, восприимчив к лечению указанным антителом. В одном варианте осуществления изобретения обнаружение фосфорилирования рецептора ErbB (HER2) указывает на вероятную восприимчивость субъекта к лечению антителом.

Другой вариант осуществления изобретения относится к способу идентификации субъекта, восприимчивого к лечению антителом против HER2, путем обнаружения фосфорилирования рецептора ErbB в циркулирующих опухолевых клетках субъекта. Наличие такого фосфорилирования показывает, что данный субъект, по-видимому, восприимчив к лечению антителом против HER2. В одном варианте осуществления изобретения обнаруживают фосфорилирование ErbB2 (HER2). В другом варианте осуществления изобретения нуждающийся [в лечении] субъект является человеком. В другом варианте осуществления изобретения данный способ включает в себя лечение субъекта антителом против HER2, предпочтительно антителом rhuMAb 2C4.

Другим объектом данного изобретения является изделие, включающее в себя емкость, содержащую антитело, связывающееся с HER2, и инструкции по введению указанного антитела субъекту, имеющему опухоль. Данная опухоль предпочтительно содержит гетеродимеры HER2/HER3, и/или HER2/HER1, и/или HER2/HER4.

В одном варианте осуществления изобретения в указанной емкости находится антитело, блокирующее активацию лигандом гетеродимера ErbB, содержащего HER2. В другом варианте осуществления изобретения в указанной емкости находится моноклональное антитело 2С4, более предпочтительно антитело rhuMAb 2C4.

Другим объектом данного изобретения является способ лечения субъекта, который включает в себя введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела, связывающегося с HER2. Указанный субъект предпочтительно имеет опухоль, содержащую гетеродимеры HER2/HER3, и/или HER2/HER1, и/или HER2/HER4.

В одном варианте осуществления изобретения данное антитело блокирует активацию лигандом гетеродимера ErbB, содержащего HER2. В другом варианте осуществления изобретения данное антитело является моноклональным антителом 2С4, более предпочтительно антителом rhuMAb 2C4.

Другим объектом данного изобретения является способ лечения субъекта, который включает в себя введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела, связывающегося с HER2. Указанный субъект предпочтительно имеет опухоль, которая, как известно, содержит фосфорилированный рецептор ErbB.

В одном варианте осуществления изобретения фосфорилированным рецептором ErbB является HER2. В другом варианте осуществления изобретения указанное антитело блокирует активацию лигандом гетеродимера ErbB, содержащего HER2. В еще одном варианте осуществления изобретения данное антитело является моноклональным антителом 2С3, более предпочтительно антителом rhuMAb 2C4.

Краткое описание чертежей

На фиг.1А и 1В показаны сравнительные анализы первичной структуры аминокислотных последовательностей вариабельной области легкой цепи (VL) (фиг.1А) и вариабельной области тяжелой цепи (VH) (фиг.1В) моноклонального антитела 2С4 мыши (соответственно SEQ ID NO:1 и 2); VL- и VH-области варианта 574 гуманизированного антитела 2С4 (соответственно SEQ ID NO:3 и 4) и консенсусные остовы VL- и VH-областей человека (hum κ1, подгруппа I легкой цепи каппа; humIII, подгруппа III тяжелой цепи) (соответственно SEQ ID NO:5 и 6). Звездочками отмечены различия между вариантом 574 гуманизированного антитела 2С4 и моноклональным антителом 2С4 мыши или между вариантом 574 гуманизированного антитела 2С4 и остовом антитела человека. В скобках указаны гипервариабельные участки (CDR).

На фиг.2А и 2В показано действие моноклонального антитела 2С4, антитела препарата HERCEPTIN® или антитела против EGFR на герегулин-зависимое (HRG) связывание ErbB2 с ErbB3 в клетках MCF7, экспрессирующих ErbB2 на низком/нормальном уровне (фиг.2А), и в клетках SK-BR-3, экспрессирующих ErbB2 на высоком уровне (фиг.2В); см. приведенный ниже пример 2.

На фиг.3 показан иммуноблот, свидетельствующий о наличии гетеродимеров HER1/HER2 и HER2/HER3 в белковых экстрактах, полученных из ксенотрансплантированных эксплантатов немелкоклеточного рака легкого.

На фиг.4 показан иммуноблот, свидетельствующий о наличии фосфорилирования HER2 в белковых экстрактах, полученных из ксенотрансплантированных эксплантатов немелкоклеточного рака легкого (NSCLC).

Подробное описание предпочтительного варианта осуществления изобретения

Настоящее изобретение частично основано на результатах экспериментальных исследований, которые показывают, что восприимчивость к антителу против HЕR2 rhuMAb 2C4 соотносится с наличием гетеродимеров HER2/HER3, и/или HER2/HER1, и/или HER2/HER4 и/или фосфорилированием рецептора ErbB в опухолевых клетках. Таким образом, опухоль можно идентифицировать по восприимчивости к воздействию антитела против HER2, в частности антитела против HER2, обладающего одной или несколькими биологическими активностями антитела 2С4 против HER2, при наличии гетеродимеров HER2/HER3, и/или HER2/HER1, и/или HER2/HER4 и/или фосфорилирования рецептора ErbB. Гетеродимеры HER2/HER3, и/или HER2/HER1, и/или HER2/HER4 и/или фосфорилирование рецептора ErbB можно обнаружить любым методом, известным в данной области. После обнаружения специфических опухолей и типов опухолей, которые восприимчивы к лечению антителами против HER2, можно выявить субъектов, которые, по-видимому, могут получить пользу от такого лечения. Кроме того, можно выявить субъектов, которым, вероятно, не поможет лечение моноклональным антителом 2С4.

Определение терминов

Термин "рецептор ErbB" означает рецептор, представляющий собой белок тирозинкиназы, который относится к семейству рецепторов ErbB и включает в себя рецепторы EGFR (ErbB1), ERRP, ErbB2, ErbB3 и ErbB4 и другие члены указанного семейства, которые будут идентифицированы в будущем. Рецептор ErbB обычно имеет внеклеточную область, которая может связываться с лигандом ErbB; липофильную трансмембранную область; консервативную внутриклеточную область тирозинкиназы и карбоксиконцевую сигнальную область, содержащую несколько остатков тирозина, которые могут быть фосфорилированы. Рецептор ErbB может представлять собой рецептор ErbB, имеющий "нативную последовательность" или "вариант аминокислотной последовательности". Рецептор ErbB предпочтительно является рецептором ErbB человека с нативной последовательностью. Соответственно, "член семейства рецепторов ErbB" представляет собой EGFR (ErbB1), ErbB2, ErbB3 и ErbB4 или любой другой рецептор ErbB, который известен в настоящее время или будет идентифицирован в будущем. Предпочтительным членом указанного семейства рецепторов является EGFR (ErbB1), ErbB2, ErbB3 или ErbB4.

Термины "ErbB1", "рецептор эпидермального фактора роста", "EGFR" и "HER1" являются взаимозаменяемыми в данном описании изобретения и означают рецептор EGFR, описанный, например, в публикации Carpenter et al., Ann. Rev. Biochem., 56:881-914 (1987), и его естественные мутантные формы (например, делеционный мутант EGFR, описанный в публикации Humphrey et al., PNAS (USA), 87:4207-4211 (1990)). Термин еrbB1 означает ген, кодирующий белковый продукт EGFR. Антитела против НER1 описаны, например, в публикации Murthy et al., Arch. Biochem. Biophys., 252: 549-560 (1987) и в заявке WO 95/25167.

Термины "ERRP", "белок, родственный рецептору EGF", "EGFR-родственный белок" и "белок, родственный рецептору эпидермального фактора роста" являются взаимозаменяемыми в данном описании изобретения и означают белок ERRP, описанный, например, в патенте США № 6399743 и публикации патента США № 2003/0096373.

Термины "ErbB2" и "HER2" являются взаимозаменяемыми в данном описании изобретения и означают белок НER2 человека, описанный, например, в публикациях Semba et al., PNAS (USA), 82:6497-6501 (1985) и Yamamoto et al., Nature, 319:230-234 (1986) (номер доступа в банке генов Х03363). Термин "еrbB2" означает ген, кодирующий рецептор ErbB2 человека, и "neu" означает ген, кодирующий рецептор p185neu крысы. Предпочтительный рецептор ErbB2 является рецептором ErbB2 человека с нативной последовательностью.

Термин "ErbB3" и "HER3" означают полипептид рецептора, описанный, например, в патентах США №№ 5183884 и 5480968, а также в публикации Kraus et al., PNAS (USA), 86:9193-9197 (1989). Антитела против ErbB3 известны в данной области и описаны, например, в патентах США №№ 5183884, 5480968 и в заявке WO 97/35885.

Термин "ErbB4" и "HER4" означают полипептид рецептора, описанный, например, в заявке на европейский патент № 599274; публикациях Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1746-1750 (1993) и Plowman et al., Nature, 366:473-475 (1993), и его изоформы, описанные, например, в заявке WO 99/19488, опубликованной 22 апреля 1999 г. Антитела против HER4 описаны, например, в заявке WO 02/18444.

Антитела к рецепторам ErbB можно приобрести коммерческим путем в ряде компаний, в том числе, например, в компании Santa Cruz Biotechnology, Inc., California, USA.

Термин "лиганд ErbB" означает полипептид, который связывается с рецептором ErbB и/или активирует указанный рецептор. Лиганд ErbB может быть лигандом ErbB человека с нативной последовательностью, таким как эпидермальный фактор роста (EGF) (Savage et al., J. Biol. Chem., 247:7612-7621 (1972); трансформирующий фактор роста альфа (TGF-α) (Marquardt et al., Science, 223:1079-1082 (1984)); амфирегулин, известный также как аутокринный фактор роста шванома или кератиноцита (Shoyab et al., Science, 243:1074-1076 (1989); Kimura et al., Nature, 348:257-260 (1990) и Cook et al., Mol. Cell. Biol., 11:2547-2557 (1991)); бетацеллюлин (Shing et al., Science, 259:1604-1607 (1993) и Sasada et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 190:1173 (1993)); гепарин-связывающий эпидермальный фактор роста (HB-EGF) (Higashiyama et al., Science, 251:936-939 (1991)); эпирегулин (Toyoda et al., J. Biol. Chem., 270:7495-7500 (1995) и Komurasaki et al., Oncogene, 15:2841-2848 (1997)); герегулин (см. ниже); нейрегулин-2 (NRG-2) (Carraway et al., Nature, 387:512-516 (1997)); нейрегулин-3 (NRG-3) (Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94:9562-9567 (1997)); нейрегулин-4 (NRG-4) (Harari et al., Oncogene, 18:2681-89 (1999)) или крипто (CR-1) (Kannan et al., J. Biol. Chem., 272(6):3330-3335 (1997)). Лиганды ErbB, связывающиеся с EGFR, включают в себя EGF, TGF-α, амфирегулин, бетацеллюлин, HB-EGF и эпирегулин. Лиганды ErbB, связывающиеся с ErbB3, включают в себя герегулины. Лиганды ErbB, способные связываться с ErbB4, включают в себя бетацеллюлин, эпирегулин, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 и герегулины. Лиганд ErbB может быть также синтетическим лигандом ErbB. Синтетический лиганд может быть специфичным к определенному рецептору ErbB или может узнавать конкретные комплексы рецептора ErbB. Примером синтетического лиганда является синтетический герегулин/бирегулин химеры egf (см., например, публикацию Jones et al., FEBS Letters, 447:227-231 (1999), которая включена в данное описание изобретения в качестве ссылки).

Термин "герегулин" (HRG) в используемом здесь значении означает полипептид, кодируемый генным продуктом герегулина, который описан в патенте США № 5641869 или публикации Marchionni et al., Nature, 362:312-318 (1993). Примеры герегулинов включают в себя герегулин-α, герегулин-β1, герегулин-β2 и герегулин-β3 (Holmes et al., Science, 256:1205-1210 (1992) и патент США № 5641869); фактор дифференцировки neu (NDF) (Peles et al., Cell, 69:205-216 (1992)); активность, индуцирующую рецептор ацетилхолина (ARIA) (Falls et al., Cell, 72:801-815 (1993)); глиальные факторы роста (GGF) (Marchionni et al., Nature, 362:312-318 (1993)); фактор сенсорных и двигательных нейронов (SMDF) (Ho et al., J. Biol. Chem., 270:14523-14532 (1995)); γ-герегулин (Schaefer et al., Oncogene, 15:1385-1394 (1997)). Указанный термин означает биологически активные фрагменты и/или варианты аминокислотных последовательностей полипептида HRG с нативной последовательностью, такие как фрагмент EGF-подобной области (например, HRGβ1177-244).

Термин "гетероолигомер ErbB" означает нековалентно связанный олигомер, содержащий по меньшей мере два разных рецептора ErbB. Термин "димер ErbB" означает нековалентно связанный олигомер, содержащий два разных рецептора ErbB. Такие комплексы могут образовываться в том случае, когда клетка, экспрессирующая два или больше рецепторов ErbB, подвергается воздействию лиганда ErbB. Олигомеры ErbB, в частности димеры ErbB, можно выделить путем иммунопреципитации и подвергнуть анализу методом SDS-PAGE, описанным в публикации Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20): 14661-14665 (1994). Примеры таких гетероолигомеров ErbB включают комплексы EGFR-ErbB2 (определяемый также как HER1/HER2), ErbB2-ErbB3 (HER2/HER3) и ErbB3-ErbB4 (HER3/HER4). Кроме того, гетероолигомер ErbB может содержать два или больше рецепторов ErbB2, объединенных с другим рецептором ErbB, таким как ErbB3, ErbB4 или EGFR (ErbB1). В состав гетероолигомера могут входить другие белки, такие как субъединица рецептора цитокина (например, gp130).

Термин "активация лигандом рецептора ErbB" означает трансдукцию сигнала (например, вызываемое внутриклеточной областью киназы фосфорилирование остатков тирозина рецептора ErbB или полипептидного субстрата), опосредуемую связыванием лиганда ErbB с гетероолигомером ErbB, содержащим представляющий интерес рецептор ErbB. Указанный процесс обычно включает связывание лиганда ErbB с гетероолигомером ErbB, активирующим область киназы одного или нескольких рецепторов ErbB в гетероолигомере, в результате чего происходит фосфорилирование остатков тирозина в одном или нескольких рецепторах ErbB и/или фосфорилирование остатков тирозина в дополнительных полипептидах субстрата. Активацию рецептора ErbB можно количественно определить при помощи разных анализов фосфорилирования тирозина.

Термин полипептид с "нативной последовательностью" означает полипептид, имеющий такую же аминокислотную последовательность, что и естественный полипептид (например, рецептор ErbB или лиганд ErbB). Такие полипептиды с нативной последовательностью можно получить из природного источника или создать рекомбинантными или синтетическими методами. Таким образом, полипептид с нативной последовательностью может иметь аминокислотную последовательность естественного полипептида человека, полипептида мыши или полипептида млекопитающего любого другого вида.

Термин "вариант аминокислотной последовательности" означает полипептиды, имеющие аминокислотные последовательности, отличающиеся в некоторой степени от полипептида с нативной последовательностью. Варианты аминокислотной последовательности обычно по меньшей мере примерно на 70% гомологичны по меньшей мере одному домену связывания рецептора нативного лиганда ErbB или по меньшей мере одному домену связывания лиганда нативного рецептора ErbB, причем указанные домены предпочтительно по меньшей мере примерно на 80%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 90% гомологичны доменам связывания такого рецептора или лиганда. Варианты аминокислотной последовательности включают замены, делеции и/или инсерции в определенных положениях нативной аминокислотной последовательности.

Термин "гомология" означает выраженное в процентах число остатков варианта аминокислотной последовательности, которые являются идентичными после выполнения сравнительного анализа первичной структуры и при необходимости заполнения разрывов для достижения максимальной процентной гомологии. Методы и компьютерные программы, предназначенные для выполнения сравнительного анализа первичной структуры, хорошо известны в данной области. Одной такой компьютерной программой является "Align 2", созданная в компании Genentech, Inc., которая была зарегистрирована с документацией пользователя в Ведомстве по охране авторского права США, Вашингтон, округ Колумбия 20559, 10 декабря 1991 г.

Термин "антитело" использован в данном описании изобретения в самом широком значении, в определение которого, в частности, входят интактные моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), образованные по меньшей мере из двух интактных антител, и фрагменты антител, если они обладают требуемой биологической активностью.

Термин "моноклональное антитело" в используемом здесь значении означает антитело, полученное из популяции по существу гомогенных антител, то есть из популяции отдельных антител, которые идентичны друг другу, за исключением возможных естественных мутаций, присутствующих в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифическими, направленно воздействуя на один антигенный сайт. Кроме того, в отличие от препаратов поликлональных антител, которые содержат разные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты на антигене. Помимо специфичности преимуществом моноклональных антител является то, что они могут быть синтезированы, не будучи загрязненными другими антителами. Термин "моноклональный" определяет характер антитела, полученного из по существу гомогенной популяции антител, поэтому для его получения не нужно использовать какой-либо конкретный метод. Например, моноклональные антитела, пригодные для использования в соответствии с настоящим изобретением, можно получить методом создания гибридом, который впервые был описан в публикации Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), или методами рекомбинантных ДНК (см., например, патент США № 4816567). "Моноклональные антитела" можно также выделить из библиотек фаговых антител при помощи методов, описанных в публикациях Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991).

Моноклональные антитела в используемом здесь значении включают, в частности, "химерные" антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных из определенного вида или относящихся к определенному классу или подклассу антител, в то время как остальная часть цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, выделенных из другого вида или относящихся к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, если они обладают требуемой биологической активностью (патент США № 4816567 и публикация Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Химерные антитела, представляющие интерес в данном описании изобретения, включают "приматизированные" антитела, содержащие антиген-связывающие последовательности вариабельной области, выделенные у примата, отличного от человека (например, низшие узконосые обезьяны, человекообразные обезьяны и т.д.), и последовательности константных областей человека.

Термин "фрагменты антитела" означает часть интактного антитела, предпочтительно содержащую антиген-связывающую или вариабельную область. Примеры фрагментов антитела включают Fab-, Fab'-, F(ab')2- и Fv-фрагменты; ди-антитела; линейные антитела; одноцепочечные антитела и мультиспецифические антитела, полученные из фрагментов антител.

"Интактное" антитело является таким антителом, которое содержит антиген-связывающую вариабельную область, а также константную область легкой цепи (CL) и константные области тяжелой цепи СН1, СН2 и СН3. Константные области могут быть константными областями нативной последовательности (например, константными областями нативной последовательности человека) или вариантом аминокислотной последовательности. Интактное антитело предпочтительно выполняет одну или несколько эффекторных функций.

"Эффекторные функции" антитела означают биологические активности, присущие Fc-области (Fc-область нативной последовательности или Fc-область варианта аминокислотной последовательности) антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают связывание C1q; комплемент-зависимую цитотоксичность; связывание Fc-рецептора; антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; снижение активности рецепторов на поверхности клетки (например, В-клеточный рецептор, BCR) и т.д.

В зависимости от аминокислотной последовательности константной области тяжелых цепей интактные антитела могут быть отнесены к разным "классам". Существуют пять основных классов интактных антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из указанных классов могут быть далее подразделены на "подклассы" (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA и IgA2. Константные области тяжелых цепей, соответствующие разным классам антител, именуются соответственно α, δ, ε, γ и μ. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации разных классов иммуноглобулинов хорошо известны.

Термины "антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность" и "ADCC" означают опосредуемое клеткой взаимодействие, в процессе которого неспецифические цитотоксичесие клетки, экспрессирующие Fc-рецепторы (FcR) (например, естественные клетки-киллеры (NK), нейтрофилы и макрофаги), узнают связанное антитело на клетке-мишени и вызывают лизис данной клетки-мишени. Первичные клетки, опосредующие ADCC, в частности NK-клетки, экспрессируют только FcγRIII, в то время как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Экспрессия FcR на гемопоэтических клетках суммирована в таблице 3, приведенной на странице 464 публикации Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991). Для оценки активности ADCC представляющей интерес молекулы можно выполнить анализ ADCC in vitro, аналогичный описанному в патентах США №№ 5500362 и 5821337. Эффекторные клетки, пригодные для выполнения таких анализов, включают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и естественные клетки-киллеры (NK). Альтернативно или дополнительно активность ADCC представляющей интерес молекулы можно определить in vivo, например, в животной моделе, аналогичной описанной в публикации Clynes et al., PNAS (USA), 95:652-656 (1998).

Термин "эффекторные клетки человека" означает лейкоциты, которые экспрессируют один или несколько FcR и выполняют эффекторные функции. Указанные клетки предпочтительно экспрессируют по меньшей мере FcγRIII и выполняют эффекторную функцию ADCC. Примеры лейкоцитов человека, опосредующих ADCC, включают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), естественные клетки-киллеры (NK), моноциты, цитотоксические Т-клетки и нейтрофилы, причем РВМС и NK-клетки являются особенно предпочтительными. Эффекторные клетки могут быть выделены из природного источника, такого как кровь или РВМС, в соответствии с приведенным описанием.

Термины "Fc-рецептор" или "FcR" означают рецептор, который связывается с Fc-областью антитела. Предпочтительным FcR является FcR человека с нативной последовательностью. Кроме того, предпочтительным FcR является такой рецептор, который связывается с антителом IgG (гамма-рецептор) и включает рецепторы подклассов FcγRI, FcγRII и FcγRIII, в том числе аллельные варианты и альтернативно сплайсированные формы указанных рецепторов. Рецепторы FcγRII включают FcγRIIA ("активирующий рецептор") и FcγRIIB ("ингибирующий рецептор"), которые имеют аналогичные аминокислотные последовательности, отличающиеся главным образом цитоплазматическими доменами. Активирующий рецептор FcγRIIA содержит активирующий сегмент на основе тирозина иммунорецептора (ITAM) в цитоплазматической области. Ингибирующий рецептор FcγRIIB содержит ингибирующий сегмент на основе тирозина иммунорецептора (ITIM) в цитоплазматической области. (См. публикацию M. in Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234 (1997)). Рецепторы FcR рассмотрены в публикациях Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods, 4:25-34 (1994) и de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41 (1995). Другие рецепторы FcR, в том числе рецепторы, которые могут быть идентифицированы в будущем, входят в определение термина "FcR", используемого в данном описании изобретения. Указанный термин включает также рецептор новорожденных FcRn, который является ответственным за передачу материнских антител IgG плоду (Guyer et al., J. Immunol., 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol., 24:249 (1994)).

Термины "комплемент-зависимая цитотоксичность" или "CDC" означают способность молекулы лизировать мишень в присутствии комплемента. Инициация пути активации комплемента происходит в результате связывания первого компонента системы комплементов (C1q) с молекулой (например, антителом), образующей комплекс с родственным антигеном. Для определения активации комплемента можно выполнить анализ CDC, описанный, например, в публикации Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996).

Термин "нативные антитела" обычно означает гетеротетрамерные гликопротеины порядка 150000 Дальтон, состоящие из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (Н) цепей. Каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, причем число дисульфидных связей является различным у тяжелых цепей разных изотипов иммуноглобулинов. Каждая тяжелая и легкая цепь имеет также дисульфидные мостики, равномерно расположенные внутри цепи. Каждая тяжелая цепь имеет у одного конца вариабельную область (VH), за которой следует ряд константных областей. Каждая легкая цепь имеет вариабельную область у одного конца (VL) и константную область у другого конца. Константная область легкой цепи согласуется с первой константной областью тяжелой цепи, и вариабельная область легкой цепи согласуется с вариабельной областью тяжелой цепи. Считается, что определенные аминокислотные остатки образуют поверхность раздела между вариабельными областями легкой цепи и тяжелой цепи.

Термин "вариабельный" означает, что определенные участки вариабельных областей имеют значительно отличающуюся последовательность у разных антител, при этом они служат для связывания и определяют специфичность каждого конкретного антитела к определенному антигену. Однако вариабельность распределена неравномерно в вариабельных областях антител. Она сконцентрирована в трех сегментах, именуемых гипервариабельными участками, расположенными в вариабельных областях легкой цепи и тяжелой цепи. Более консервативные участки вариабельных областей именуются остовными областями (FR). Вариабельные области нативных тяжелых и легких цепей содержат четыре остовные области, имеющие в основном β-складчатую конформацию, соединенную тремя гипервариабельными участками, образующими петли, которые соединяют и в некоторых случаях образуют часть β-складчатой конформации. Гипервариабельные участки в каждой цепи удерживаются в непосредственной близости друг от друга при помощи остовных областей, при этом гипервариабельные участки другой цепи способствуют образованию антиген-связывающего сайта антител (см. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesta, MD (1991)). Константные области не участвуют непосредственно в связывании антитела с антигеном, но выполняют разные эффекторные функции, например обеспечивают участие антитела в антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC).

Термин "гиперварибельный участок" в используемом здесь значении означает аминокислотные остатки антитела, ответственные за связывание с антигеном. Гипервариабельный участок обычно содержит аминокислотные остатки из "определяющей комплементарность области" или "CDR" (например, остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельной области легкой цепи и 31-35 (Н1), 50-65 (Н2) и 95-102 (Н3) в вариабельной области тяжелой цепи; публикация Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) и/или остатки из "гипервариабельной петли" (например, остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельной области легкой цепи и 26-32 (Н1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) в вариабельной области тяжелой цепи; публикация Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)).

Остатками "остовной области" или "FR" являются остатки вариабельной области, не являющиеся вышеуказанными остатками гипервариабельного участка.

В результате гидролиза антител папаином образуются два идентичных антиген-связывающих фрагмента, именуемые "Fab"-фрагментами, каждый из которых имеет один антиген-связывающий сайт, и остаточный "Fc"-фрагмент, в названии которого отражена способность легко кристаллизоваться. В результате обработки пепсином образуется F(ab')2-фрагмент, который имеет два антиген-связывающих сайта и поэтому способен перекрестно связывать антиген.

"Fv" является минимальным фрагментом антитела, содержащим полный антиген-распознающий и антиген-связывающий сайт. Указанная область включает димер вариабельной области одной тяжелой цепи и одной легкой цепи, которые прочно связаны нековалентной связью. Именно в такой конфигурации три гиперварибельных участка каждой вариабельной области взаимодействуют с образованием антиген-связывающего сайта на поверхности димера VH-VL. В общей сложности шесть гиперварибельных участков сообщают антителу антиген-связывающую специфичность. Однако даже одна вариабельная область (или половина Fv-фрагмента, содержащая только три гипервариабельных участка, специфичных к антигену) обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя и с меньшей степенью сродства по сравнению с полным сайтом связывания.

Fab-фрагмент содержит также константную область легкой цепи и первую константную область (СН1) тяжелой цепи. Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов добавлением нескольких остатков к карбоксильному концу области тяжелой цепи СН1, включающих один или несколько остатков цистеина из шарнирной области антитела. Fab'-SH означает Fab'-фрагмент, в котором один или несколько остатков цистеина константных областей имеют по меньшей мере одну свободную тиоловую группу. F(ab')2-фрагменты антитела первоначально были получены в виде пар Fab'-фрагментов, между которыми находились остатки цистеина шарнирной области. Известны также другие химические методы связывания фрагментов антитела.

"Легкие цепи" антител позвоночных любого вида могут быть отнесены к одному из двух хорошо различаемых типов, именуемых каппа (κ) и лямбда (λ), на основании аминокислотных последовательностей их константных областей.

"Одноцепочечный Fv-фрагмент" или "scFv-фрагмент" антитела содержит VH- и VL-области антитела, где указанные области присутствуют в одной полипептидной цепи. Полипептид Fv-фрагмента далее содержит полипептидный линкер между VH- и VL-областями, который позволяет scFv-фрагменту образовывать требуемую структуру для связывания антигена. Для ознакомления с scFv-фрагментом см. публикацию Plückthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994). scFv-фрагменты антитела против ErbB2 описаны в заявке WO 93/16185 и патентах США №№ 5571894 и 5587458.

Термин "ди-антитела" означает мелкие фрагменты антител с двумя антиген-связывающими сайтами, в которых вариабельная область тяжелой цепи (VH) присоединена к вариабельной области легкой цепи (VL) в одной полипептидной цепи (VH-VL). Благодаря использованию линкера, который является слишком коротким для спаривания двух областей в одной цепи, указанные области образуют пары с комплементарными областями другой цепи, создавая два антиген-связывающих сайта. Ди-антитела более полно описаны, например, в европейском патенте № 404097, заявке WO 93/11161 и публикации Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).

"Гуманизированные" формы антител, отличных от человеческих (например, грызуна), являются химерными антителами, содержащими минимальную последовательность, выделенную из иммуноглобулина, отличного от человеческого. Как правило, гуманизированные антитела представляют собой иммуноглобулины человека (антитело реципиента), в которых остатки из гипервариабельного участка реципиента заменены остатками из гипервариабельного участка вида, отличного от человека (антитело донора), такого как мышь, крыса, кролик или примат кроме человека, обладающими требуемой специфичностью, сродством и потенциалом. В некоторых случаях остатки остовной области (FR) иммуноглобулина человека заменяют соответствующими остатками, не принадлежащими человеку. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые отсутствуют в антителе реципиента или антителе донора. Указанные модификации создают для дальнейшего улучшения характеристик антитела. Как правило, гуманизированное антитело содержит по существу все остатки по меньшей мере одной и обычно двух вариабельных областей, в которых все или по существу все гипервариабельные петли соответствуют петлям иммуноглобулина, отличного от человеческого, и все или по существу все FR являются остовными областями иммуноглобулиновой последовательности человека. Кроме того, гуманизированное антитело необязательно содержит по меньшей мере часть константной области (Fc) иммуноглобулина, обычно иммуноглобулина человека. Для более подробного ознакомления см. публикации Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988) и Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992).

Гуманизированные антитела против ErbB2 включают huMab4D5-1, huMab4D5-2, huMab4D5-3, huMab4D5-4, huMab4D5-5, huMab4D5-6, huMab4D5-7 и huMab4D5-8 (HERCEPTIN®), представленные в таблице 3 патента США № 5821337, который включен в данное описание изобретения в качестве ссылки; гуманизированные антитела 520С9 (WO 93/21319) и 2С4, описанные ниже.

"Выделенное" антитело является антителом, которое было идентифицировано и отделено от компонента, находящегося вместе с ним в естественном окружении. Загрязняющими компонентами, присутствующими в естественном окружении антитела, являются вещества, которые препятствуют диагностическому или терапевтическому применению данного антитела и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения антитело очищают (1) более чем до 95 мас.% антитела при определении методом Лоури и наиболее предпочтительно более чем до 99 мас.%, (2) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности при использовании секвенатора с центрифугой или (3) до гомогенного состояния, определяемого методом SDS-PAGE в восстановительных или невосстановительных условиях при окрашивании кумасси голубым или предпочтительно серебром. Выделенное антитело включает антитело in situ в рекомбинантных клетках, так как отсутствует по меньшей мере один компонент, присутствующий в естественном окружении антитела. Однако выделенное антитело обычно получают в результате выполнения по меньшей мере одной стадии очистки.

Антитело, "связывающее" представляющий интерес антиген, например антиген ErbB2, является антителом, способным связывать указанный антиген с достаточной степенью сродства, благодаря чему данное антитело пригодно для направленного воздействия на клетку, экспрессирующую такой антиген. Антитело, связывающее ErbB2, обычно предпочтительно связывает ErbB2 в отличие от других рецепторов ErbB и по существу не взаимодействует с другими белками, такими как EGFR, ErbB3 или ErbB4. В таких вариантах осуществления изобретения степень связывания указанного антитела с белками, не относящимися к ErbB2 (например, связывание на поверхности клетки с эндогенным рецептором), будет составлять менее 10% по результатам анализа методом сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS) или радиоиммунопреципитации (RIA). Антитело против ErbB2 по существу не взаимодействует с белком neu крысы, например, как описано в публикациях Schecter et al., Nature, 312:513 (1984) и Drebin et al., Nature, 312:545-548 (1984).

Антитело, "блокирующее" активацию лигандом рецептора ErbB, является антителом, которое снижает или предотвращает вышеуказанную активацию, причем указанное антитело способно блокировать активацию лигандом рецептора ErbB значительно эффективнее, чем моноклональное антитело 4D5, например, примерно так же эффективно, как моноклональные антитела 7F3 или 2С4 либо их Fab-фрагменты, и предпочтительно примерно так же эффективно, как моноклональное антитело 2С4 или его Fab-фрагмент. Например, антитело, блокирующее активацию лигандом рецептора ErbB, может быть антителом, которое примерно на 50-100% эффективнее блокирует образование гетероолигомера ErbB по сравнению с антителом 4D5. Активацию лигандом рецептора ErbB можно блокировать любым способом, например, препятствуя связыванию лиганда с рецептором ErbB, образованию комплекса с ErbB, активации тирозинкиназы рецептора ErbB в комплексе с ErbB и/или фосфорилированию одного или нескольких остатков тирозинкиназы в рецепторе ErbB или под действием рецептора ErbB. Примеры антител, блокирующих активацию лигандом рецептора ErbB, включают в себя моноклональные антитела 2С4 и 7F3 (которые блокируют активацию HRG гетероолигомеров ErbB2/ErbB3 и ErbB2/ErbB4; и активацию EGF, TGF-α, амфирегулином, HB-EGF и/или эпирегулином гетероолигомера EGFR/ErbB2) и антитела L26, L96 и L288 (Klapper et al., Oncogene, 14:2099-2109 (1997)), которые блокируют связывание EGF и NDF с клетками T47D, экспрессирующими EGFR, ErbB2, ErbB3 и ErbB4.

Антитело, обладающее "биологическими характеристиками" требуемого антитела, такого как моноклональное антитело, получившее название 2С4, является антителом, которое обладает одной или несколькими биологическими характеристиками такого антитела, отличающими его от других антител, связывающихся с тем же антигеном (например, ErbB2). Например, антитело с биологическими характеристиками 2С4 может блокировать активацию HRG гетероолигомера ErbB, включающего ErbB2 и ErbB3, ErbB1 или ErbB4; блокировать активацию EGF, TGF-α, HB-EGF, эпирегулином и/или амфирегулином рецептора ErbB, включающего EGFR и ErbB2; блокировать EGF, TGF-α и/или HRG-опосредуемую активацию МАРК; и/или связываться с тем же эпитопом во внеклеточной области ErbB2, что и антитело 2С4 (которое, например, блокирует связывание моноклонального антитела 2С4 с ErbB2).

За исключением особо оговоренных случаев, термин "моноклональное антитело 2С4" означает антитело, имеющее антиген-связывающие остатки антитела 2С4 мыши или выделенные из указанного антитела, рассмотренного в нижеследующих примерах. Например, моноклональное антитело 2С4 может быть моноклональным антителом 2С4 мыши или его вариантом, таким как гуманизированное антитело 2С4, содержащим антиген-связывающие аминокислотные остатки моноклонального антитела 2С4 мыши. Примеры гуманизированных антител 2С4 приведены в данном описании изобретения и в заявке WO 01/00245, которая полностью включена в данное описание изобретения в качестве ссылки. За исключением особо оговоренных случаев термин "rhuMAb 2C4" в используемом здесь значении означает антитело, содержащее соответственно последовательности SEQ ID NO:3 и 4 вариабельной области легкой цепи (VL) и вариабельной области тяжелой цепи (VH), слитые с последовательностями константной области легкой и тяжелой цепи IgG1 человека (не относящиеся к аллотипу А), которое необязательно экспрессировано в клетке яичника китайского хомячка (СНО).

За исключением особо оговоренных случаев, термин "моноклональное антитело 4D5" означает антитело, содержащее антиген-связывающие остатки антитела 4D5 мыши или выделенные из указанного антитела (АТСС CRL 10463). Например, моноклональное антитело 4D5 может быть моноклональным антителом 4D5 мыши или его вариантом, таким как гуманизированное антитело 4D5, содержащее антиген-связывающие остатки моноклонального антитела 4D5 мыши. Типичные гуманизированные антитела 4D5 включают в себя huMАb4D5-1, huMАb4D5-2, huMАb4D5-3, huMАb4D5-4, huMАb4D5-5, huMАb4D5-6, huMАb4D5-7 и huMАb4D5-8 (HERCEPTIN®), описанные в патенте США № 5821337, причем huMАb4D5-8 (HERCEPTIN®) является предпочтительным гуманизированным антителом 4D5.

Термин "ингибирующий рост агент" в используемом здесь значении означает соединение или композицию, которая подавляет рост клетки, в частности ErbB-экспрессирующей раковой клетки in vitro или in vivo. Таким образом, ингибирующий рост агент может быть агентом, который значительно сокращает выраженное в процентах число ErbB-экспрессирующих клеток в S-фазе. Примеры ингибирующих рост агентов включают в себя агенты, которые блокируют прогрессию клеточного цикла (на стадии, не являющейся S-фазой), в частности агенты, индуцирующие задержку G1 и М-фазы. Типичные ингибиторы М-фазы включают в себя винкас (винкристин и винбластин), таксаны и ингибиторы типа II, такие как доксорубицин, эпирубицин, даунорубицин, этопозид и блеомицин. Агенты, задерживающие G1, вызывают также задержку S-фазы, в частности, ДНК-алкилирующие агенты, такие как тамоксифен, преднизон, дакарбазин, мехлортамин, цисплатин, метотрексат, 5-фторурацил и ара-С. Более полная информация приведена в публикации The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, (1995), especially p.13.

Примерами "ингибирующих рост" антител являются антитела, которые связываются с ErbB2 и подавляют рост раковых клеток, сверхэкспрессирующих ErbB2. Предпочтительные ингибирующие рост антитела против ErbB2 подавляют рост опухолевых клеток рака молочной железы SK-BR-3 в культуре клеток более чем на 20%, предпочтительно более чем на 50% (например, от около 50% до около 100%) при концентрации антитела около 0,5-30 мкг/мл, при определении подавления роста через шесть дней после воздействия указанного антитела на клетки SK-BR-3 (см. патент США № 5677171, выданный 14 октября 1997 г). Анализ подавления роста клеток SK-BR-3 более подробно описан в указанном патенте и в нижеследующем описании изобретения. Предпочтительное ингибирующее рост антитело является моноклональным антителом 4D5, например гуманизированным антителом 4D5.

Антитело, "индуцирующее гибель клетки", является антителом, которое вызывает гибель жизнеспособной клетки. Такая клетка обычно представляет собой клетку, экспрессирующую рецептор ErbB2, в частности сверхэкспрессирующую рецептор ErbB2. Указанная клетка предпочтительно является раковой клеткой, например клеткой молочной железы, яичника, желудка, эндометрия, слюнной железы, легкого, почки, ободочной кишки, щитовидной железы, поджелудочной железы или мочевого пузыря. При исследовании in vitro данная клетка может быть клеткой SK-BR-3, BT474, Calu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 или SKOV3. Гибель клетки in vitro можно определить при отсутствии комплемента и иммунокомпетентных эффекторных клеток, чтобы отличить гибель клетки, вызванную антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью (ADCC) или комплемент-зависимой цитотоксичностью (CDC). Таким образом, анализ гибели клеток может быть выполнен с использованием термоинактивированной сыворотки (то есть при отсутствии комплемента) и при отсутствии иммунокомпетентных эффекторных клеток. Чтобы определить способность антитела вызывать гибель клетки, можно выполнить анализ нарушения целостности мембраны, оцениваемого по поглощению иодида пропидия (PI), трипана синего (см. публикацию Moore et al., Cytotechnology, 17:1-11 (1995)) или 7AAD в сравнении с необработанными клетками. Предпочтительными антителами, индуцирующими гибель клетки, являются антитела, которые вызывают поглощение PI при выполнение анализа на поглощение PI клетками ВТ474 (см. ниже).

Антитело, "индуцирующее апоптоз", является антителом, которое вызывает запрограммированную гибель клетки, определяемую по связыванию аннексина V, фрагментации ДНК, сжатию клетки, расширению эндоплазматической сети, фрагментации клетки и/или образованию пузырьков в мембране (именуемых апоптозными тельцами). Такая клетка обычно сверхэкспрессирует рецептор ErbB2. Указанная клетка предпочтительно является опухолевой клеткой, например клеткой молочной железы, яичника, желудка, эндометрия, слюнной железы, легкого, почки, ободочной кишки, щитовидной железы, поджелудочной железы или мочевого пузыря. При исследовании in vitro данная клетка может быть клеткой SK-BR-3, BT474, Calu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 или SKOV3. Существуют разные методы определения происходящих в клетке событий, связанных с апоптозом. Например, транслокацию фосфатидилсерина (PS) можно измерить, осуществляя связывание с аннексином; фрагментацию ДНК можно определить по образованию лэддера ДНК; и конденсацию хроматина в ядре наряду с фрагментацией ДНК можно определить по увеличению числа гиподиплоидных клеток. Антитело, индуцирующее апоптоз, предпочтительно является таким антителом, которое вызывает примерно 2-50-кратную, предпочтительно примерно 5-50-кратную и наиболее предпочтительно примерно 10-50-кратную индукцию связывания аннексина по сравнению с необработанной клеткой при выполнении анализа связывания аннексина с использованием клеток ВТ474 (см. ниже). Проапоптозное антитело иногда является таким антителом, которое далее блокирует активацию лигандом рецептора ErbB (например, антитело 7F3), то есть данное антитело имеет биологические характеристики, присущие моноклональному антителу 2С4. В других случаях указанное антитело является таким антителом, которое существенно не блокирует активацию лигандом рецептора ErbB (например, 7С2). Кроме того, данное антитело может быть подобно антителу 7С2, которое, индуцируя апоптоз, не вызывает значительного уменьшения выраженного в процентах числа клеток в S-фазе (например, антитело, которое уменьшает число указанных клеток примерно на 0-10% по сравнению с контрольными клетками).

Термин "эпитоп 2С4" означает область во внеклеточном домене ErbB2, с которой связывается антитело 2С4. Для выявления антител, связывающихся с эпитопом 2С4, можно выполнить обычный перекрестноблокирующий анализ, аналогичный описанному в публикации Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Альтернативно можно произвести картирование эпитопов для определения связывания антитела с эпитопом 2С4 рецептора ErbB2 (например, один или несколько любых остатков в данной области примерно от остатка 22 до остатка 584 ErbB2 включительно; см. фиг.1А-В).

Термин "эпитоп 4D5" означает область во внеклеточном домене ErbB2, с которой связывается антитело 4D5 (ATCC CRL 10463). Указанный эпитоп расположен рядом с трансмембранным доменом ErbB2. Для выявления антител, связывающихся с эпитопом 4D5, можно выполнить обычный перекрестноблокирующий анализ, аналогичный описанному в публикации Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Альтернативно можно произвести картирование эпитопов для определения связывания антитела с эпитопом 4D5 рецептора ErbB2 (например, один или несколько любых остатков в данной области примерно от остатка 529 до остатка 625 включительно; см. фиг. 1А-В).

Термин "эпитоп 3Н4" означает область во внеклеточном домене ErbB2, с которой связывается антитело 3Н4. Указанный эпитоп включает остатки примерно от 541 до 599 включительно в аминокислотной последовательности внеклеточного домена ErbB2; см. фиг.1А-В.

Термин "эпитоп 7С2/7F3" означает область у N-конца внеклеточного домена ErbB2, с которой связываются антитела 7С2 и/или 7F3 (депонированные в коллекцию АТСС, см. ниже). Для выявления антител, связывающихся с эпитопом 7C2/7F3, можно выполнить обычный перекрестноблокирующий анализ, аналогичный описанному в публикации Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Альтернативно можно произвести картирование эпитопов для определения связывания антитела с эпитопом 7C2/7F3 рецептора ErbB2 (например, один или несколько любых остатков в данной области примерно от остатка 22 до остатка 53 ErbB2 включительно; см. фиг.1А-В).

Термин "млекопитающее" в соответствии с целями лечения означает любое животное, классифицируемое как млекопитающее, в том числе человека, домашних и сельскохозяйственных животных, животных в зоопарке, спортивных или комнатных животных, таких как собаки, лошади, кошки, коровы и т.д. Указанным млекопитающим предпочтительно является человек.

Опухоль, "восприимчивая к лечению", характеризуется статистически значимым улучшением при лечении антителом против ErbB по сравнению с отсутствием какого-либо лечения, или при лечении плацебо с использованием известной животной модели, или в процессе клинического исследования с участием людей, или реагирует на первоначальное лечение антителами против ErbB, но растет при продолжении лечения.

Термины "лечить" или "лечение" означают терапевтическое лечение, профилактические или предупредительные меры, которые должны предотвращать или замедлять (ослаблять) развитие у субъекта нежелательное физиологическое изменение или нарушение, в частности развитие или распространение рака. В соответствии с целями данного изобретения благоприятные или желаемые клинические результаты включают, не ограничиваясь ими, ослабление симптомов, уменьшение тяжести заболевания, стабилизацию (то есть отсутствие ухудшения) заболевания, задержку или замедление развития заболевания, улучшение или временное облегчение заболевания и ремиссию (частичную или полную), поддающиеся или не поддающиеся обнаружению. Термин "лечение" может также означать более продолжительное сохранение жизни по сравнению с ожидаемым при отсутствии лечения. Субъектами, нуждающимися в лечении, являются субъекты, уже страдающиеся указанным нарушением или заболеванием, а также субъекты, подверженные возникновению данного нарушения или заболевания, которое необходимо предотвратить.

Термин "нарушение" означает любое состояние, которое можно улучшить в результате лечения по настоящему изобретению. В определение данного термина входят хронические и острые нарушения или заболевания, включающие в себя патологические состояния, которые вызывают предрасположенность млекопитающего к возникновению данного нарушения. Неограничивающие примеры подлежащих лечению заболеваний включают в себя доброкачественные и злокачественные опухоли; лейкозы и лимфоидные злокачественные новообразования, в частности рак молочной железы, яичника, желудка, эндометрия, слюнной железы, легкого, почки, ободочной кишки, щитовидной железы, поджелудочной железы, предстательной железы или мочевого пузыря; нейронные, глиальные, астроцитальные, гипоталамусные и другие гландулярные, макрофаговые, эпителиальные, стромальные и бластоцельные нарушения; воспалительные, ангиогенные и иммунологические нарушения. Предпочтительным подлежащим лечению нарушением согласно изобретению является злокачественная опухоль.

Термин "терапевтически эффективное количество" означает количество лекарственного средства, оказывающее эффективное действие при лечении заболевания или нарушения у млекопитающего. В случае рака терапевтически эффективное количество лекарственного средства может уменьшить число раковых клеток, сократить размер опухоли, ингибировать (то есть в некоторой степени замедлить и предпочтительно прекратить) инфильтрацию раковых клеток в периферические органы, ингибировать (то есть в некоторой степени замедлить и предпочтительно прекратить) образование метастазов опухоли, в некоторой степени затормозить рост опухоли и/или в некоторой степени ослабить один или несколько симптомов, вызываемых раком. Лекарственное средство может предотвратить рост и/или уничтожить существующие раковые клетки в цитостатической и/или цитотоксической степени. Эффективность лечения рака можно измерить, определяя время до развития болезни (ТТР) и/или скорость реакции (RR).

Термины "рак" и "раковый" означают физиологическое состояние у млекопитающих, которое обычно характеризуется нерегулируемым ростом клеток. Термин "опухоль" означает одну или несколько раковых клеток. Примеры рака включают, не ограничиваясь ими, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз или лимфоидные злокачественные новообразования. Более конкретные примеры таких раковых заболеваний включают в себя плоскоклеточный рак (например, эпителиальный плоскоклеточный рак), рак легкого, в частности мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого ("NSCLC"), аденокарциному легкого и плоскоклеточную карциному легкого, рак брюшиной полости, печеночно-клеточный рак, рак желудка, в том числе рак желудочно-кишечного тракта, рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы, рак ободочной кишки, рак прямой кишки, рак прямой и ободочной кишки, карциному эндометрия или матки, карциному слюнной железы, рак почки, рак предстательной железы, рак наружных женских половых органов, рак щитовидной железы, карциному печени, карциному заднего прохода, карциному полового члена, а также рак головы и шеи.

Термин "ErbB-экспрессирующая раковая опухоль" означает раковую опухоль, содержащую клетки, на поверхности которых присутствует белок ErbB. Термин "ErbB2-экспрессирующая раковая опухоль" означает раковую опухоль, продуцирующую значительные количества рецептора ErbB2 на поверхности раковых клеток, с которым может связываться антитело против ErbB2 и оказывать терапевтическое действие на раковую опухоль.

Раковая опухоль, "характеризующаяся чрезмерной активацией" рецептора ErbB, является раковой опухолью, в клетках которой активация рецептора ErbB значительно превосходит уровень активации данного рецептора в нераковых клетках ткани такого же типа. Такая чрезмерная активация может привести к сверхэкспрессии рецептора ErbB и/или повышению уровней лиганда ErbB, участвующего в активации рецептора ErbB в раковых клетках. Такая чрезмерная активация может вызвать и/или может быть вызвана злокачественным состоянием раковой клетки. В некоторых вариантах осуществления изобретения раковая опухоль должна быть подвергнута диагностическому или прогностическому анализу для выявления амплификации и/или сверхэкспрессии рецептора ErbB, вызывающей такую чрезмерную активацию рецептора ErbB. Альтернативно или дополнительно указанная опухоль может быть подвергнута диагностическому или прогностическому анализу для выявления амплификации и/или сверхэкспрессии лиганда ErbB, способствующей чрезмерной активации рецептора. В определенной подгруппе таких раковых опухолей чрезмерная активация рецептора может быть вызвана аутокринным стимулирующим путем.

В "аутокринном" стимулирующем пути аутостимуляция возникает под действием раковой клетки, продуцирующей как лиганд ErbB, так и родственный рецептор ErbB. Например, раковая опухоль может экспрессировать или сверхэкспрессировать EGFR, а также экспрессировать или сверхэкспрессировать лиганд EGFR (например, EGF, TGF-α или HB-EGF). В другом варианте осуществления изобретения раковая опухоль может экспрессировать или сверхэкспрессировать ErbB2, а также экспрессировать или сверхэкспрессировать герегулин (например, γ-HRG).

Раковая опухоль, которая "сверхэкспрессирует" рецептор ErbB, является опухолью, на поверхности клеток которой значительно повышены уровни рецептора ErbB, такого как ErbB2, по сравнению с нераковой клеткой ткани такого же типа. Такая сверхэкспрессия может быть вызвана амплификацией гена или повышенной транскрипцией или трансляцией. Сверхэкспрессию рецептора ErbB можно определить при помощи диагностического или прогностического анализа, измеряя повышенные уровни белка ErbB на поверхности клетки (например, иммуногистохимическим анализом, IHC). Альтернативно или дополнительно можно измерить уровни ErbB-кодирующей нуклеиновой кислоты в клетке, например, методом флуоресцентной гибридизации in situ (FISH; см. заявку WO 98/45479, опубликованную в октябре 1998 г.), саузерн-блоттинга или полимеразной реакции синтеза цепи (PCR), такой как количественная PCR в реальном времени (RT-PCR). Сверхэкспрессию лиганда ErbB можно определить при помощи диагностического анализа, измеряя у субъекта уровни лиганда (или кодирующей его нуклеиновой кислоты), например, в результате выполнения биопсии опухоли или разных диагностических анализов, таких как IHC, FISH, саузерн-блоттинг, PCR или вышеописанные анализы in vivo. Сверхэкспрессию рецептора ErbB можно также исследовать, измеряя "слущивающийся" антиген (например, внеклеточного домена ErbB) в биологической жидкости, такой как сыворотка (см., например, патент США № 4933294, выданный 12 июня 1990 г.; заявку WO 91/05264, опубликованную 18 апреля 1991 г.; патент США № 5401638, выданный 28 мая 1995 г.; и публикацию Sias et al., J. Immunol. Methods, 132:73-80 (1990)). Помимо вышеуказанных анализов квалифицированному специалисту должны быть известны разные другие анализы in vivo. Например, клетки в организме субъекта можно подвергнуть воздействию антитела, необязательно меченого детектируемой меткой, например, радиоактивным изотопом, и определить связывание данного антитела с клетками в организме субъекта, например, путем наружного сканирования радиоактивности или анализа материала, полученного путем биопсии у субъекта, предварительно подвергнутого воздействию антитела.

Опухоли, сверхэкспрессирующие HER2, анализируют на основании иммуногистохимических оценок, соответствующих числу копий молекул HER2, экспрессированных одной клеткой, которые могут быть определены биохимическим методом: 0 = 0-10000 копий/клетку, 1+ = по меньшей мере около 200000 копий/клетку, 2+ = по меньшей мере около 500000 копий/клетку, 3+ = по меньшей мере около 2000000 копий/клетку. Сверхэкспрессия HER2 на уровне 3+, которая вызывает лиганд-независимую активацию тирозинкиназы (Hudziak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7159-7163 [1987]), имеет место примерно в 30% случаев рака молочной железы, и у таких субъектов уменьшаются шансы на выживание без рецидива заболевания и просто на выживание (Slamon et al., Science, 244:707-712 [1989]; Slamon et al., Science, 235:177-182 [1987]).

В отличие от вышеизложенного, раковая опухоль, "не характеризующаяся сверхэкспрессией рецептора ErbB2", является опухолью, в которой при выполнении диагностического анализа не обнаружена повышенная экспрессия рецептора ErbB по сравнению с нераковой клеткой ткани такого же типа.

"Гормон-независимая" раковая опухоль является опухолью, пролиферация которой не зависит от наличия гормона, связывающегося с рецептором, экспрессируемым клетками в раковой опухоли. Такие раковые опухоли поддаются клиническому регрессу только при использовании фармакологических или хирургических методов, уменьшающих концентрацию гормона в опухоли или рядом с ней. Примеры гормон-независимых раковых опухолей включают в себя андроген-независимый рак предстательной железы, эстроген-независимый рак молочной железы, рак эндометрия и рак яичника. Такие раковые опухоли могут возникать в виде гормон-зависимых опухолей и развиваться от гормон-чувствительной стадии к образованию гормон-резистентной опухоли после антигормональной терапии.

Термин "цитотоксический агент" в используемом здесь значении означает вещество, которое ингибирует или подавляет функцию клеток и/или вызывает разрушение клеток. В определение данного термина входят радиоактивные изотопы (например, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 и радиоактивные изотопы Lu), химиотерапевтические средства и токсины, такие как низкомолекулярные токсины или ферментативно активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, включая их фрагменты и/или варианты.

"Химиотерапевтическое средство" является химическим соединением, применимым для лечения рака. Примеры химиотерапевтических средств включают в себя алкилирующие агенты, такие как тиотепа и циклофосфамид (CYTOXAN™); алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этилэнимины и метиламеламины, включающие в себя алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилоломеламин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, гидрохлорид оксида мехлорэтамина, мелфалан, новембикин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урацилиприт; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин; антибиотики, такие как аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, калихеамицин, карабицин, карминомицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин, эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин, 5-FU; андрогены, такие как калустерон, пропионат дромостанолона, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; антиадреналиновые средства, такие как аминоглютетимид, митотан, трилостан; наполнитель фолиевой кислоты, такой как фролиновая кислота; ацеглатон; гликозид альдофосфамида; аминолевулиновая кислота; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; элфорнитин; ацетат эллиптиния; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевина; лентинан; лонидамин; митогуазон; митоксантрон; мопидамол; нитракрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; подофиллиновая кислота; 2-этилгидразид; прокарбазин; PSK®; разоксан; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновая кислота; триазиквон; 2,2',2"-трихлортриэтиламин; уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид ("Ara-C"); циклофосфамид; тиотепа; таксаны, например паклитаксель (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) и доцетаксель (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); хлорамбуцил; гемцитабин; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; платина; этопозид (VP-16); ифосфамид; митомицин С; митоксантрон; винкристин; винорелбин; навелбин; новантрон; тенипозид; дауномицин; аминоптерин; кселода; ибандронат; СРТ-11; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноевая кислота; эсперамицины; капецитабин и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные вышеуказанных средств. В определение данного термина входят также антигормональные средства, которые регулируют или ингибируют воздействие гормонов на опухоли, такие как антиэстрогены, включающие в себя, например, тамоксифен, ралоксифен, ароматаза-ингибирующие 4(5)-имидазолы, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и торемифен (Fareston); антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, лейпролид и госерелин; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные вышеуказанных средств.

В используемом здесь значении термин "лекарственное средство, направленно доставляемое к EGFR" означает терапевтический агент, который связывается с EGFR и необязательно ингибирует активацию EGFR. Примеры таких агентов включают в себя антитела и мелкие молекулы, связывающиеся с EGFR. Примеры антител, связывающихся с EGFR, включают в себя MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB 8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (см. патент США № 4943533, Mendelsohn et al.) и их варианты, такие как химеризованное антитело 225 (С225 или цетуксимаб; ERBUTIX®) и видоизмененное антитело 225 человека (Н225) (см. заявку WO 96/40210, Imclone Systems Inc.); антитела, связывающиеся с мутантом EGFR типа II (патент США № 5212290); гуманизированные и химерные антитела, связывающиеся с EGFR, аналогичные описанным в патенте США № 5891996; и антитела человека, связывающиеся с EGFR, такие как АВХ-EGF (см. заявку WO 98/50433, Abgenix). Антитело против EGFR может быть конъюгировано с цитотоксическим агентом, образуя таким образом иммуноконъюгат (см., например, европейский патент № 659439A2, Merck Patent GmbH). Примеры мелких молекул, связывающихся с EGFR, включают в себя ZD1839 или гефитиниб (IRESSA™; Astra Zeneca), СР-358774 (TARCEVA™; Genentech/OSI) и AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen).

"Ингибитор тирозинкиназы" представляет собой молекулу, которая в некоторой степени подавляет активность тирозинкиназы, такой как рецептор ErbB. Примеры таких ингибиторов включают в себя лекарственные средства, направленно доставляемые к EGFR, рассмотренные в предыдущем абзаце, а также хиназолины, такие как PD 153035,4-(3-хлоранилино)хиназолин, пиридопиримидины, пиримидопиримидины, пирролопиримидины, такие как CGP 59326, CGP 60261 и CGP 62706, и пиразолопиримидины, 4-(фениламино)-7Н-пирроло-[2,3-d]пиримидины, куркумин (диферулоилметан, 4,5-бис(4-фторанилино)фталимид), тирфостины, содержащие нитротиофеновые части; PD-0183805 (Warner-Lamber); антисмысловые молекулы (например, молекулы, связывающиеся с ErbB-кодирующей нуклеиновой кислотой); хиноксалины (патент США № 5804396); трифостины (патент США № 5804396), ZD6474 (Astra Zeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); ингибиторы pan-ErbB, такие как CI-1033 (Pfizer); аффинитак (ISIS 3521; Isis/Lilly); мезилат иматиниба (Gleevac; Novartis); PKI 166 (Novartis); GW2016 (Glaxo SmithKline); CI-1033 (Pfizer); EKB-569 (Wyeth); семаксаниб (Sugen); ZD6474 (AstraZeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); INC-1C11 (Imclone); или описанные в нижеследующих публикациях патентов: патент США № 5804396; WO 99/09016 (American Cyanimid); WO 98/43960 (American Cyanimid); WO 97/38983 (Warner Lambert); WO 99/06378 (Warner Lambert); WO 99/06396 (Warner Lambert); WO 96/30347 (Pfizer, Inc.); WO 96/33978 (Zeneca); WO 96/3397 (Zeneca) и WO 96/33980 (Zeneca).

Термин "антиангиогенное средство" означает соединение, которое блокирует или в некоторой степени препятствует образованию кровеносных сосудов. Антиангиогенный фактор может, например, представлять собой мелкую молекулу или антитело, связывающееся с фактором роста или рецептором фактора роста, участвующим в стимуляции ангиогенеза. Предпочтительным антиангиогенным фактором в данном изобретении является антитело, связывающееся с эндотелиальным фактором роста сосудов (VEGF).

Термин "цитокин" является родовым обозначением белков, высвобождаемых одной популяцией клеток, воздействующих на другие клетки в качестве межклеточных медиаторов. Примерами таких цитокинов являются лимфокины, монокины и типичные полипептидные гормоны. В определение цитокинов входят гормон роста, в частности гормон роста человека, N-метионильный гормон роста человека и гормон роста крупного рогатого скота; паращитовидный гормон; тироксин; инсулин; проинсулин; релаксин; прорелаксин; гликопротеиновые гормоны, такие как фолликулостимулирующий гормон (FSH), гормон, стимулирующий щитовидную железу (TSH), и лютеинизирующий гормон (LH); фактор роста печени; фактор роста фибробластов; пролактин; плацентарный лактоген; α- и β-фактор некроза опухоли; муллериан-ингибирующее вещество; гонадотропин-специфический пептид мыши; ингибин; активин; эндотелиальный фактор роста сосудов; интегрин; тромбопоэтин (ТРО); фактор роста нервов, такой как NGF-β; фактор роста тромбоцитов; трансформирующие факторы роста (TGF), такие как TGF-α и TGF-β; инсулиноподобный фактор роста I и II; эритропоэтин (ЕРО); остеоиндуцирующие факторы; интерфероны, такие как α-, β- и γ-интерферон; колониестимулирующие факторы (CSF), такие как CSF макрофагов (M-CSF); CSF гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF) и CSF гранулоцитов (G-CSF); интерлейкины (IL), такие как IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; фактор некроза опухоли, такой как TNF-α или TNF-β; и другие полипептидные факторы, включающие в себя LIF и кит-лиганд (KL). В используемом здесь значении термин "цитокин" означает белки, выделенные из природных источников или из культуры рекомбинантных клеток, и биологически активные эквиваленты цитокинов с нативной последовательностью.

Термин "пролекарство" в значении, используемом в данной заявке, означает предшественник или производное фармацевтически активного вещества, которое является менее токсичным для опухолевых клеток по сравнению с исходным лекарственным средством и может быть активировано ферментом или превращено в более активную исходную форму. См., например, публикации Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy", Biochemical Society Transactions, 14, pp.375-382, 615^th Meeting Belfast (1986) и Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp.247-267, Humana Press (1985). Пролекарства по данному изобретению включают, не ограничиваясь ими, фосфатсодержащие пролекарства, тиофосфатсодержащие пролекарства, сульфатсодержащие пролекарства, пептидсодержащие пролекарства, пролекарства, модифицированные D-аминокислотой, гликозилированные пролекарства, β-лактамсодержащие пролекарства, необязательно замещенные феноксиацетамидсодержащие пролекарства или необязательно замещенные фенилацетамидсодержащие пролекарства, 5-фторцитозин и другие 5-фторуридиновые пролекарства, которые могут быть превращены в более активное свободное цитотоксическое средство. Примеры цитотоксических средств, из которых могут быть получены производные пролекарственные формы, пригодные для использования в данном изобретении, включают, не ограничиваясь ими, вышеуказанные химиотерапевтические средства.

Термин "липосома" означает мелкий пузырек, состоящих из разных типов липидов, фосфолипидов и/или поверхностно-активного вещества, который пригоден для доставки в организм млекопитающего лекарственного средства (в частности, антител против ErbB2, описанных в данной заявке, и необязательно химиотерапевтического средства). Компоненты липосомы обычно имеют двухслойную структуру, подобную липидной структуре биологических мембран.

Термин "вкладыш в упаковке" означает инструкции, обычно вкладываемые в коммерческие упаковки лекарственных средств, которые содержат информацию о показаниях, применении, дозировке, введении, противопоказаниях и/или предупреждения, относящиеся к использованию таких лекарственных средств.

Термин "кардиозащитное средство" означает соединение или композицию, которая предотвращает или ослабляет нарушение функции миокарда (то есть кардиомиопатию и/или застойную сердечную недостаточность), обусловленное введением нуждающемуся субъекту лекарственного средства, такого как антрациклиновый антибиотик и/или антитело против ErbB2. Кардиозащитное средство может, например, блокировать или ослаблять опосредованное свободными радикалами кардиотоксическое действие и/или предотвращать или уменьшать поражение, вызванное окислительным стрессом. Примеры кардиозащитных средств, входящих в определение данного термина, включают в себя хелатообразователь железа дексразоксан (ICRF-187) (Seifert et al., The Annals of Pharmacotherapy, 28:1063-1072 (1994)); средство, снижающее содержание липидов, и/или антиоксидант, такой как пробукол (Singal et al., J. Mol. Cell Cardiol., 27:1055-1063 (1995)); амифостин (сложный эфир аминотиол-2-[(3-аминопропил)амино]этантиодигидрофосфорной кислоты, именуемый также WR-2721, и его дефосфорилированная поглощаемая клетками форма, именуемая WR-1065) и S-3-(3-метиламинопропиламино)пропилфосфортиовая кислота (WR-151327), см. публикацию Green et al., Cancer Research, 54:738-741 (1994); дигоксин (Bristow, M.R., In: Bristow MR, ed. Drug-Induced Heart Disease. New York: Elsevier 191-215 (1980)); бета-блокаторы, такие как метопролол (Hjalmarson et al., Drugs 47:Suppl 4:31-9 (1994) и Shaddy et al., Am. Heart J., 129: 197-9 (1995)); витамин Е; аскорбиновая кислота (витамин С); акцепторы свободных радикалов, такие как олеаноловая кислота, урсоловая кислота и N-ацетилцистеин (NAC); спинулавливающие соединения, такие как альфа-фенил-трет-бутилнитрон (PBN); (Paracchini et al., Anticancer Res., 13:1607-1612 (1993)); селенорганические соединения, такие как Р251 (Elbesen), и тому подобные.

"Выделенная" молекула нуклеиновой кислоты является молекулой нуклеиновой кислоты, которая идентифицирована и отделена по меньшей мере от одной загрязняющей молекулы нуклеиновой кислоты, с которой она обычно связана в природном источнике нуклеиновой кислоты антитела. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты отличается по форме или положению, в котором она встречается в естественных условиях. Поэтому выделенная молекула нуклеиновой кислоты отличается от молекулы нуклеиновой кислоты, присутствующей в естественных клетках. Однако выделенная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, находившуюся в клетках, обычно экспрессирующих антитело, где данная молекула нуклеиновой кислоты занимает в хромосоме положение, отличающееся от подобного положения в естественных клетках.

Термин "регулярные последовательности" означает последовательности ДНК, необходимые для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в определенном организме-хозяине. Регулярные последовательности, пригодные для прокариотов, включают, например, промотор, необязательно операторную последовательность и сайт связывания рибосомы. Известно, что эукариотические клетки используют промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры.

Нуклеиновая кислота является "функционально связанной", когда она находится в функциональной взаимосвязи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, ДНК для препоследовательности или секреторной лидерной последовательности функционально связана с ДНК для полипептида, если она экспрессирована в виде пребелка, участвующего в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию последовательности; или сайт связывания рибосомы функционально связан с кодирующей последовательностью, если его расположение облегчает трансляцию. Термин "функционально связанный" обычно означает, что связанные последовательности ДНК являются смежными и, в случае секреторной лидерной последовательности, они являются смежными и находятся в фазе считывания. Однако энхансеры необязательно должны быть смежными. Связывание осуществляется путем лигирования в положении удобных сайтов рестрикции. Если такие сайты отсутствуют, используют синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры в соответствии с общепринятой практикой.

Термины "клетка", "линия клеток" и "культура клеток", используемые в данном описании изобретения, имеют взаимозаменяемые значения и включают в себя потомство клеток. Таким образом, термины "трансформанты" и "трансформированные клетки" означают первичные клетки и полученные из них культуры независимо от числа переносов. Кроме того, очевидно, что в потомстве содержание ДНК не может быть совершенно идентичным вследствие намеренных или непреднамеренных мутаций. В объем настоящего изобретения входит мутантное потомство, выполняющее такую же функцию или обладающее такой же биологической активностью, что и первоначально трансформированная клетка. Другие значения терминов будут понятны из контекста.

Способы идентификации опухолей, восприимчивых к лечению антителами против HER2

Источники опухолей и опухолевых клеток

Опухоли можно охарактеризовать как восприимчивые к терапии антителом 2С4 или функционально эквивалентными антителами, то есть антителами, обладающими одной или несколькими биологическими характеристиками антитела 2С4, например, на основании присутствия гетеродимеров EGFR-ErbB2 и/или ErbB2-ErbB3 на поверхности клетки, служащих в качестве меры активации HER2. Образцы опухоли можно исследовать на наличие гетеродимеров любым методом, известным в данной области. Наличие гетеродимеров предпочтительно определяют одним или несколькими нижеописанными методами.

Так как активация HER2 является результатом гетеродимеризации и фосфорилирования рецептора, особенно важным методом идентификации опухолей, восприимчивых к терапии антителом 2С4 или функционально эквивалентными антителами, является обнаружение фосфорилирования рецептора ErbB, в частности фосфорилирования рецептора ErbB2 (HER2), в соответствии с нижеследующим описанием.

Источники опухолевых клеток, которые могут быть использованы при выполнении анализа, включают, не ограничиваясь ими, материал, полученный в результате биопсии опухоли, циркулирующие опухолевые клетки, циркулирующие плазматические белки, асцитическую жидкость, ксенотрансплантированные опухоли и другие модели опухолей, культуры первичных клеток или линии клеток, выделенные из опухолей или обладающие опухолеподобными свойствами, а также консервированные образцы опухоли, например, фиксированные в формалине или залитые парафином. В объем настоящего изобретения входит скрининг панелей опухолевых клеток разного типа с целью обнаружения гетеродимеров EGFR-ErbB2, и/или ErbB2-ErbB3, и/или фосфорилирования рецептора ErbB. Опухолевые клетки такого же типа, что и опухолевые клетки, при тестировании которых были получены положительные результаты в отношении наличия гетеродимеров и/или фосфорилирования рецептора ErbB, такого как рецептор ErbB (HER2), могут быть подвергнуты терапии антителом 2С4. Описанные ниже модели опухолей приведены в качестве примеров и не ограничивают объем данного изобретения.

В одном варианте осуществления изобретения опухолевые клетки, полученные у субъекта, имеющего в данный момент опухоль, исследуют в отношении реакции на терапию антителом 2С4. Если результаты исследования подтверждают восприимчивость клеток благодаря наличию гетеродимеров HER2/HER3 и/или HER2/HER1 или фосфорилирования рецептора ErbB, данный субъект может быть подвергнут лечению антителом, обладающим одной или несколькими биологическими характеристиками, присущими антителу 2С4. Данного субъекта предпочтительно подвергают лечению антителом rhuMAb 2C4.

В другом варианте осуществления изобретения опухолевые клетки, полученные из опухоли определенного типа, или клетки, которые, как известно, обладают характеристиками опухоли определенного типа, анализируют на наличие гетеродимеров EGFR-ErbB2 и/или ErbB2-ErbB3 или фосфорилирование рецептора ErbB, предпочтительно рецептора ErbB2 (HER2). При обнаружении гетеродимеров EGFR-ErbB2, и/или ErbB2-ErbB3, и/или фосфорилирования рецептора ErbB считается, что опухоль данного типа подлежит лечению антителом против ErbB2, обладающим одной или несколькими биологическими характеристиками антитела 2С4. Субъекты, имеющие опухоль подобного типа, могут быть подвергнуты лечению таким антителом.

Ксенотрансплантаты из линии клеток

Размноженные in vitro опухолевые клетки, в частности опухолевые клетки, выращенные в культуре, и линии опухолевых клеток можно ксенотрансплантировать мышам, имплантируя указанные клетки непосредственно на участок тела, представляющий интерес. Такие методы хорошо известны специалисту в данной области. Клетки анализируют на наличие гетеродимеров EGFR-ErbB2 и/или ErbB2-ErbB3 или фосфорилирование рецептора ErbB, в частности рецептора ErbB2 (HER2).

В одном варианте осуществления изобретения опухолевые клетки имплантируют подкожно мыши, предпочтительно бестимусной "голой" мыши. В другом варианте осуществления изобретения опухолевые клетки имплантируют в физиологически родственный участок тела для создания соответствующей модели опухоли in situ. Например, клетки из линии раковых клеток молочной железы можно имплантировать в разных концентрациях в жировую ткань молочной железы бестимусным "голым" мышам для более точного моделирования биологии рака молочной железы. Опухолевые клетки могут быть исследованы на наличие гетеродимеров EGFR-ErbB2 или ErbB2-ErbB3 либо фосфорилирование рецептора ErbB до или после имплантации. Опухолевые клетки предпочтительно анализируют после образования из имплантированных клеток опухоли заранее определенного размера. Мыши могут быть подвергнуты терапии антителом 2С4 или функционально эквивалентным антителом при использовании в качестве контрольных животных мышей, не подвергаемых лечению.

Подобные модели можно получить для опухоли любого типа, из которой были выделены культивируемые клетки или линии клеток. Пригодные типы опухолей включают, не ограничиваясь ими, опухоли мочевого пузыря, головного мозга, молочной железы, ободочной кишки, пищевода, почки, печени, легкого, яичника, поджелудочной железы, предстательной железы, желудка, яичка и матки, а также лейкоз, меланому и саркому. В одном варианте осуществления изобретения для имплантации используют опухолевые клетки или линии клеток, сверхэкспрессирующие ErbB2, а в другом варианте осуществления изобретения для имплантации используют опухолевые клетки или линии клеток, экспрессирующие рецептор ErbB2 на нормальном уровне или ниже нормального уровня. В еще одном варианте осуществления изобретения для имплантации используют опухолевые клетки или линии клеток, не восприимчивые к воздействию препарата HERCEPTIN®.

В конкретном варианте осуществления изобретения в жировую ткань гонады имплантируют примерно 20 миллионов опухолевых клеток молочной железы MDA-175. Экспрессию димеров HER2/HER1 и/или HER2/HER3 на поверхности ксенотрансплантированных клеток определяют одним из описанных ниже методов. Мыши, которым были имплантированы указанные клетки, могут быть также подвергнуты лечению антителом 2С4 в дозах 0,3 мг/кг, 10 мг/кг, 30 мг/кг или 100 мг/кг. Специалист в данной области может определить другие схемы приема лекарственного средства.

Хотя настоящее изобретение относится к любой опухоли, экспрессирующей HER2, особенно пригодны для анализа или лечения по настоящему изобретению солидные опухоли, такие как рак молочной железы, рак яичника, рак легкого, рак предстательной железы и рак прямой и ободочной кишки.

Ксенотрансплантаты опухоли

Образцы опухоли млекопитающего, предпочтительно человека, можно получить и имплантировать мышам, предпочтительно бестимусным "голым" мышам. Образцы опухоли можно получить любым методом, известным в данной области. В одном варианте осуществления изобретения образцы опухоли иссекают хирургическим путем, таким как биопсия, или во время операции по удалению опухоли у млекопитающего. В другом варианте осуществления изобретения образец опухоли получают, выделяя циркулирующие опухолевые клетки из крови млекопитающего.

В конкретном варианте осуществления изобретения срезы солидной опухоли человека размером 5Ч5 мм и диаметром 0,5-1 мм имплантируют в бока бестимусным "голым" мышам, обычно по четыре фрагмента каждой мыши. После достижения имплантированными опухолями среднего диаметра, равного примерно 10-15 мм, они могут быть последовательно пассированы с использованием более мелких фрагментов опухоли. Методы создания и исследования ксенотрансплантатов опухоли человека описаны в нижеследующих ссылках, которые полностью включены в данное описание изобретения: Fiebig et al., «Human Tumor Xenografts: Predictivity, Characterization and Discovery of New Anticancer Agents», in Contributions to Oncology: Relevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development, Fiebig & Burger, eds. (Basel, Karger 1999), vol.54, pp.29-50; Berger et al., "Establishment and Characterization of Human Tumor Xenografts in Thymus-Aplastic Nude Mice", in Immunodeficient Mice in Oncology, Fiebig & Berger, eds. (Basel, Karger 1992), pp.23-46; Fiebig & Burger, "Human Tumor Xenografts and Explants", in Models in Cancer Research, Teicher, ed. (Humana Press 2002), pp.113-137.

Считается, что на основании ксенотрансплантатов человека можно с высокой степенью достоверности прогнозировать поведение опухоли у субъекта-донора, так как ксенотрансплантат растет подобно солидной опухоли, дифференцируется, образует строму и сосудистую систему и вызывает некроз центральных клеток. В большинстве случаев ксенотрансплантаты сохраняют большую часть молекулярных, гистологических и патофизиологических характеристик свежей опухоли, выделенной у субъекта. Опухолевые клетки мыши, содержащие первую или последовательно пассированную опухоль, можно исследовать на наличие гетеродимеров EGFR-ErbB2 и/или ErbB2-ErbB3 и фосфорилирование рецептора ErbB. Мыши могут быть также подвергнуты терапии антителом 2С4 или функционально эквивалентным антителом.

В одном варианте осуществления изобретения вновь созданную или полученную панель ксенотрансплантатов опухоли человека исследуют на наличие гетеродимеров EGFR-ErbB2 или ErbB2-ErbB3 либо фосфорилирование рецептора ErbB. В приведенной выше публикации Fiebig & Burger описана панель, включающая более 300 ксенотрансплантатов опухоли человека, полученных из целого ряда распространенных раковых опухолей, таких как опухоль мочевого пузыря, головного мозга, молочной железы, ободочной кишки, пищевода, почки, печени, легкого, яичника, поджелудочной железы, предстательной железы, желудка, яичка и матки, а также лейкоз, меланома и саркома. В одном варианте осуществления изобретения всю панель исследуют на наличие гетеродимеров или фосфорилирование рецептора ErbB, в частности рецептора ErbB2 (HER2). В отношении гетеродимеров или фосфорилирования рецептора ErbB могут быть также исследованы подразделы указанной панели, если они созданы с учетом типа, сверхэкспрессии, пониженной или нормальной экспрессии ErbB2 или отсутствия восприимчивости к HERCEPTIN®. На основании полученных данных опухоли могут быть классифицированы как предполагаемые мишени для терапии антителом 2С4 на основании наличия гетеродимеров или фосфорилирования рецептора ErbB, в частности рецептора ErbB2 (HER2). Субъекты, имеющие опухоли, классифицированные подобным образом, могут гораздо лучше реагировать на терапию антителом 2С4 или функционально эквивалентным антителом.

Образцы опухоли могут быть исследованы на наличие гетеродимеров EGFR-ErbB2 или ErbB2-ErbB3 либо фосфорилирование рецептора ErbB до или после имплантации. В одном варианте осуществления изобретения примерно один грамм опухоли из первого и/или последовательно пассированного ксенотрансплантата далее исследуют на молекулярном уровне в отношении гетеродимеров или быстро замораживают в жидком азоте и хранят при ˜80°С для последующего исследования. Ксенотрансплантаты опухолей могут быть далее исследованы методом анализа на двухслойной мягком агаре, именуемым также клоногенным анализом, который описан, например, в приведенной выше публикации Fiebig & Burger. Ксенотрансплантаты солидных опухолей человека механически или протеолитически диссимилируют с образованием одноклеточной суспензии, которую культивируют на многолуночных планшетах, покрытых слоем вышеуказанного мягкого агара. Рост опухолевых клеток in vitro ведет к образованию колоний, которые могут быть далее исследованы в отношении молекулярных характеристик, таких как наличие гетеродимеров или фосфорилирование рецептора ErbB, либо в отношении других гистохимических или морфологических характеристик.

В. Обнаружение гетеродимеров EGFR-ErbB2 и ErbB2-ErbB3

Для обнаружения гетеродимеров ERGF-ErbB2 или ErbB2-ErbB3 в опухолях можно использовать любой метод, известный в данной области. Ниже описано несколько предпочтительных методов. Указанные методы позволяют обнаружить нековалентные белок-белковые взаимодействия или каким-либо другим способом определить пространственную близость представляющих интерес белков. Описанные ниже методы приведены в виде примеров и не должны ограничивать объем настоящего изобретения.

Коиммунопреципитация и иммуноблоттинг

Для обнаружения гетеродимеров EGFR-ErbB2 или ErbB2-ErbB3 можно использовать методы на основе иммуноаффинности, такие как иммунопреципитация или ELISA. В одном варианте осуществления изобретения антитела против ErbB2 используют для иммунопреципитации комплексов, содержащих ErbB2, из опухолевых клеток и полученный иммунопреципитат анализируют на наличие EGFR или ErbB3 методом иммуноблоттинга. В другом варианте осуществления изобретения на стадии иммунопреципитации можно использовать антитела против EGFR или ErbB3, и последующий анализ иммунопреципитата можно производить, используя антитела против ErbB2. В другом варианте осуществления изобретения для осаждения комплексов можно использовать лиганды ErbB, специфичные к HER1, HER3 и комплексам HER2/HER1 или HER2/HER3, после чего полученные комплексы анализируют на наличие HER2. Например, лиганды можно конъюгировать с авидином и очищать комплексы на колонке с биотином.

В других вариантах осуществления изобретения при выполнении анализов методом ELISA или с использованием многослойного иммуносэндвича антитела к ErbB2 иммобилизуют на твердофазном носителе, осуществляют контактирование с опухолевыми клетками или лизатом опухолевых клеток, промывают и затем подвергают воздействию антитела против EGFR или ErbB3. О наличии гетеродимеров свидетельствует связывание гетеродимера антителом, которое можно обнаружить прямым методом или при помощи вторичного антитела, конъюгированного с детектируемой меткой. В определенных вариантах осуществления изобретения антитело против EGFR или ErbB3 иммобилизуют и на стадии обнаружения используют антитело против ErbB2. В других вариантах осуществления изобретения вместо антител против рецепторов ErbB или в комбинации с указанными антителами можно использовать лиганды рецепторов ErbB.

После иммунопреципитации с использованием антитела против EGFR, ErbB2 или ErbB3 в качестве альтернативы или дополнения к иммуноблоттингу может быть выполнен функциональный анализ на обнаружение гетеродимеров. В одном варианте осуществления изобретения после иммунопреципитации с использованием антитела против ErbB3 выполняют анализ на определение активности тирозинкиназы рецептора в иммунопреципитате. Так как рецептор ErbB3 не обладает активностью, присущей тирозинкиназе, наличие активности тирозинкиназы в иммунопреципитате свидетельствует о том, что рецептор ErbB3 вероятнее всего связан с рецептором ErbB2. Публикации Graus-Porta et al., EMBO J., 16:1647-55 (1997); Klapper et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:4995-5000 (1999). Полученный результат может быть подтвержден иммуноблоттингом с использованием антител против ErbB2. В другом варианте осуществления изобретения после иммунопреципитации с использованием антитела против ErbB2 выполняют анализ на определение активности тирозинкиназы рецептора EGFR. При выполнении данного анализа иммунопреципитат вводят в соприкосновение с радиоактивным АТР и пептидным субстратом, который имитирует сайт трансфосфорилирования ErbB2 при помощи EGFR in vivo. Фосфорилирование пептида свидетельствует о коиммунопреципитации и таким образом подтверждает гетеродимеризацию EGFR с ErbB2. Методы определения активности тирозинкиназы рецептора хорошо известны в данной области и включают в себя анализы, которые позволяют обнаружить фосфорилирование субстратов-мишеней, например, при помощи антитела против фосфотирозина и активации путей трансдукции родственного сигнала, таких как путь МАРК.

Специалисту в данной области должны быть очевидны варианты вышеуказанных методов и анализов.

Для ковалентного связывания гетеродимеров на поверхности живых клеток можно также использовать химическое или УФ перекрестное сшивание. Публикация Hunter et al., Biochem. J. 320:847-53. Примеры химических кросс-линкеров включают в себя дитиобис(сукцинимидил)пропионат (DSP) и 3,3'-дитиобис(сульфосукцинимидил)пропионат (DTSSP). В одном варианте осуществления изобретения клеточные экстракты, полученные из химически перекрестно сшитых опухолевых клеток, анализируют методом SDS-PAGE и иммуноблоттинга с использованием антител к EGFR и/или ErbB3. Сильно сдвинутая полоса, соответствующая определенной молекулярной массе, вероятнее всего представляет гетеродимеры EGFR-ErbB2 или ErbB2-ErbB3, так как ErbB2 является предпочтительным партнером для образования гетеродимеров с EGFR и ErbB3. Полученный результат может быть подтвержден последующим выполнением иммуноблоттинга с использованием антител против ErbB2.

FRET и методы на основе флуоресценции

Для обнаружения гетеродимеров EGFR-ErbB2 или ErbB2-ErbB3 можно также использовать метод переноса резонансной энергии флуоресценции (FRET). При помощи метода FRET можно обнаружить изменения структуры белка и белок-белковые взаимодействия in vivo и in vitro на основании переноса энергии от донорного флуорофора к акцепторному флуорофору. Публикация Selvin, Nat. Struct. Biol., 7:730-34 (2000). Перенос энергии происходит только тогда, когда донорный флуорофор находится в достаточной близости от акцепторного флуорофора. В типичном эксперименте методом FRET два белка или два сайта в одном белке метят разными флуоресцентными зондами. Один из зондов, являющийся донорным зондом, возбуждают до достижения более высокого энергетического состояния под действием падающего света с определенной длиной волны. Донорный зонд передает свою энергию второму зонду, являющемуся акцепторным зондом, в результате чего происходит снижение интенсивности флуоресценции донора и увеличение флуоресцентного излучения акцептора. Для измерения величины переноса энергии интенсивность донора в образце, меченном донорным и акцепторным зондами, сравнивают с интенсивностью в образце, меченном только донорным зондом. Интенсивность акцептора необязательно сравнивают в образцах, содержащих донор/акцептор и только акцептор. В данной области известны пригодные зонды, которые включают в себя, например, проникающие через мембрану красители, такие как флуоресцеин и родамин, органические красители, такие как цианиновые красители и атомы лантанидов. См. приведенную выше публикацию Selvin. Методы и приборы для обнаружения и измерения переноса энергии также известны в данной области. См. приведенную выше публикацию Selvin.

В данной области известны также методы на основе FRET, пригодные для обнаружения и измерения белок-белковых взаимодействий в отдельных клетках. Например, для обнаружения димеров рецепторов на поверхности клетки можно использовать микроскопию по методу переноса резонансной энергии флуоресценции с фотоотбеливанием донора (pbFRET) и микроскопию по методу визуализации времени жизни флуоресценции (FLIM). См. приведенную выше публикацию Selvin; Gadella & Jovin, J. Cell. Biol., 129:1543-58 (1995). В одном варианте осуществления изобретения метод pbFRET используют для исследования клеток "в суспензии" или "in situ" с целью обнаружения и измерения образования гетеродимеров EGFR-ErbB2 или ErbB2-ErbB3, как это описано в публикации Nagy et al., Cytometry, 32:120-131 (1998). Указанные методы позволяют измерить сокращение срока жизни флуоресценции донора вследствие переноса энергии. В конкретном варианте осуществления изобретения для исследования гетеродимеризации EGFR-ErbB2 или ErbB2-ErbB3 можно использовать метод FRET типа проточной цитометрии Форстера (FCET), описанный в публикациях Nagy et al., см. выше, и Brockhoff et al., Cytometry, 44:338-48 (2001).

Метод FRET предпочтительно используют в сочетании со стандартными методами иммуногистохимического мечения. Публикация Kenworthy, Methods, 24:289-96 (2001). Например, антитела, конъюгированные с приемлемыми флуоресцентными красителями, можно использовать в качестве зондов для мечения двух разных белков. Если белки находятся в непосредственной близости друг от друга, флуоресцентные красители действуют в качестве доноров и акцепторов для FRET. Перенос энергии детектируют стандартными методами. Перенос энергии можно обнаружить при помощи проточной цитометрии или систем цифровой микроскопии, таких как конфокальная микроскопия или флуоресцентная микроскопия в широком поле, включающих камеру, оснащенную прибором с зарядовой связью (CCD).

В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитела против ErbB2 и антитела против EGFR или ErbB3 непосредственно метят двумя разными флуорофорами, например, методом, описанным в приведенной выше публикации Nagy et al. Опухолевые клетки или лизаты опухолевых клеток вводят в соприкосновение с по-разному меченными антителами, которые действуют в качестве доноров и акцепторов для FRET в присутствии гетеродимеров EGFR-ErbB2 или ErbB2-ErbB3. Альтернативно немеченые антитела против ErbB2 и антитела против EGFR или ErbB3 используют вместе с по-разному меченными вторичными антителами, которые служат в качестве доноров и акцепторов. См., например, приведенную выше публикацию Brockhoff et al. Если метки находится в непосредственной близости друг от друга, можно обнаружить перенос энергии и наличие гетеродимеров.

В других вариантах осуществления изобретения флуоресцентными красителями метят лиганды рецепторов ErbB, специфичные к HER2 и HER1 или HER3, и используют их для исследования методом FRET.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения наличие гетеродимеров на поверхности опухолевых клеток определяют методом солокализации рецептора ErbB2 с рецептором EGFR или ErbB3 при помощи стандартных прямых или непрямых иммунофлуоресцентных методов и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Альтернативно для обнаружения связывания антитела и солокализации рецептора ErbB2 с рецептором EGFR или ErbB3 в высокопроизводительном формате, таком как многолуночный микропланшет, применяют визуализацию методом лазерного сканирования (LSI), описанную в публикации Zuck et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:11122-27 (1999).

В других вариантах осуществления изобретения наличие гетеродимеров EGFR-ErbB2 и/или ErbB2-ErbB3 определяют путем идентификации ферментативной активности, которая зависит от пространственной близости компонентов гетеродимера. Антитело против ErbB2 конъюгируют с первым ферментом и антитело против EGFR или ErbB3 конъюгируют со вторым ферментом. Добавляют первый субстрат для первого фермента, при этом в реакционной смеси образуется второй субстрат для второго фермента. Это вызывает взаимодействие с другой молекулой, вследствие чего происходит образование детектируемого соединения, такого как краситель. Наличие другого химического вещества разрушает второй субстрат, прекращая таким образом взаимодействие со вторым ферментом, если только первый и второй ферменты и, следовательно, два антитела не находятся в непосредственной близости друг от друга. В конкретном варианте осуществления изобретения опухолевые клетки или клеточные лизаты вводят в соприкосновение с антителом против ErbB2, конъюгированным с глюкозооксидазой, и антителом против ErbB3 или ErbB1, конъюгированным с пероксидазой из хрена. В реакционную смесь добавляют глюкозу вместе с предшественником красителя, таким как DAB, и каталазой. Присутствие гетеродимеров определяют по изменению цвета при окрашивании DAB.

Система анализа eTag™

Гетеродимеры можно обнаружить при помощи методов на основе системы анализа eTag™ (Aclara Bio Sciences, Mountain View, CA), описанной, например, в заявке WO 83502 и заявке на патент США 2001/0049105, опубликованной 6 декабря 2001 г, которые полностью включены в данное описание изобретения в качестве ссылки. eTag™, или "электрофоретическая метка", содержит детектируемую репортерную часть, такую как флуоресцентная группа. Указанная метка может также содержать "модификатор подвижности", который включает часть, характеризующуюся уникальной электрофоретической подвижностью. Указанные части позволяют отделить метку eTag™ от смеси комплекса и обнаружить ее в определенных электрофоретических условиях, таких как капиллярный электрофорез (СЕ). Часть метки eTag™, содержащая репортерную часть и необязательно модификатор подвижности, связывают с частью, связывающейся с первой мишенью, при помощи отщепляемой связующей группы с образованием первого связывающего соединения. Часть, связывающаяся с первой мишенью, специфически узнает конкретную первую мишень, такую как нуклеиновая кислота или белок. Часть, связывающаяся с первой мишенью, не имеет каких-либо ограничений и может быть, например, полинуклеотидом или полипептидом. Часть, связывающаяся с первой мишенью, предпочтительно является антителом или фрагментом антитела. Альтернативно часть, связывающаяся с первой мишенью, может быть лигандом рецептора ErbB или его связывающимся фрагментом.

Связующая группа предпочтительно содержит расщепляемую часть, такую как ферментный субстрат, или любую химическую связь, которая может быть расщеплена в определенных условиях. Когда часть, связывающаяся с первой мишенью, связывается со своей мишенью, вводят и/или активируют расщепляющий агент, при этом связующая группа расщепляется, высвобождая часть метки eTag™, содержащую репортерную часть и модификатор подвижности. Таким образом, присутствие "свободной" метки eTag™ свидетельствует о связывании с мишенью части, связывающейся с первой мишенью.

Второе связывающее соединение предпочтительно содержит расщепляющий агент и часть, связывающуюся со второй мишенью, которая специфически узнает вторую мишень. Часть, связывающаяся со второй мишенью, также не имеет каких-либо ограничений и может быть, например, антителом, фрагментом антитела, лигандом рецептора ErbB или компетентно связывающимся фрагментом лиганда. Расщепляющий агент расщепляет связующую группу в первом связывающем соединении только в том случае, если первое связывающее соединение и второе связывающее соединение находятся в непосредственной близости друг от друга.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения первое связывающее соединение содержит метку eTag™, где антитело к ErbB2 служит в качестве части, связывающейся с первой мишенью. Второе связывающее соединение содержит антитело к EGFR или ErbB3, связанное с расщепляющим агентом, способным расщеплять связующую группу метки eTag™. Расщепляющий агент предпочтительно должен быть активирован для расщепления связующей группы. Опухолевые клетки или лизаты опухолевых клеток вводят в соприкосновение с меткой eTag™, которая связывается с ErbB2, и с модифицированным антителом против EGFR или ErbB3, которое связывается с EGFR или ErbB3 на поверхности клетки. Несвязанное связывающее соединение предпочтительно удаляют и при необходимости активируют расщепляющий агент. При наличии гетеродимеров EGFR-ErbB2 или ErbB2-ErbB3 расщепляющий агент расщепляет связующую группу и высвобождает метку eTag™ вследствие близости расщепляющего агента к связующей группе. Свободную метку eTag™ можно обнаружить любым методом, известным в данной области, таким как капиллярный электрофорез.

В одном варианте осуществления изобретения расщепляющий агент является активируемым химическим веществом, которое воздействует на связующую группу. Например, расщепляющий агент может быть активирован под воздействием света.

В другом варианте осуществления изобретения метку eTag™ создают, используя антитело к EGFR или ErbB3 в качестве части, связывающейся с первой мишенью, и второе связывающее соединение создают, используя антитело к ErbB2.

Обнаружение фосфорилирования рецептора ErbB

Наличие фосфорилирования рецептора ErbB может служить свидетельством активации HER2.

В одном варианте осуществления изобретения фосфорилирование рецептора ErbB анализируют методом иммунопреципитации одного или нескольких рецепторов ErbB, таких как рецептор ErbB2 (HER2), и вестерн-блоттинга. Например, положительную реакцию определяют по наличию полосы фосфо-HER2 в геле, используя антитело против фосфотирозина для обнаружения фосфорилированных остатков тирозина в образовавших иммунопреципитат рецепторах ErbB. Антитела против фосфотирозина можно приобрести коммерческим путем в компании Pan Vera (Madison, WI), которая является филиалом компании Invitrogen, Chemicon International Inc. (Temecula, CA), или в компании Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY). Отрицательную реакцию определяют по отсутствию указанной полосы.

В другом варианте осуществления изобретения фосфорилирование рецептора ErbB2 (HER2) анализируют иммуногистохимическим методом, используя фосфоспецифическое антитело против HER2 (клон PN2A; Thor et al., J. Clin. Oncol., 18(18):3230-3239 (2000)).

Другие методы обнаружения фосфорилирования рецепторов ErbB включают, не ограничиваясь ими, KIRA ELISA (патенты США №№ 5766863, 5891650, 5914237, 6025145 и 6287784), масс-спектрометрию (сравнение величины фосфорилированного и нефосфорилированного рецептора HER2) и анализ пространственной близости меток е-Tag с использованием антитела против HER2 (например, используя набор для анализа eTag™ компании Aclara BioSciences (Mountain View, CA). Более подробно анализ eTag™ рассмотрен выше в данном описании изобретения.

Получение антител

Ниже приведено описание типичных методов получения терапевтических и диагностических антител, используемых в соответствии с настоящим изобретением. Хотя приведенное описание обычно относится к получению антител против ErbB2, специалист в данной области может легко адаптировать рассмотренные методы для получения антител против любых рецепторов ErbB.

В качестве антигена ErbB2 для получения антител можно использовать, например, растворимую форму внеклеточного домена рецептора ErbB2 или его часть, содержащего требуемый эпитоп. Альтернативно для получения антител можно использовать клетки, экспрессирующие рецептор ErbB2 на своей поверхности (например, клетки NIH-3T3, трансформированные для сверхэкспрессии ErbB2; или линию раковых клеток, таких как клетки SK-BR-3, см. публикацию Stancovski et al., PNAS (USA), 88:8691-8695 (1991)). Специалисту в данной области должны быть очевидны другие формы ErbB2, пригодные для получения антител.

Поликлональная антитела

Поликлональные антитела предпочтительно получают у животных в результате нескольких подкожных (sc) или внутрибрюшинных (ip) инъекций родственного антигена и адъюванта. Родственный антиген можно конъюгировать с белком, который является иммуногенным для иммунизируемого вида, таким как гемоцианин лимфы улитки, сывороточный альбумин, бычий тироглобулин или ингибитор соевого трипсина, используя бифункциональный агент или агент, образующий производное соединение, например, сложный эфир малеимидобензоилсульфосукцинимида (конъюгирование при помощи остатков цистеина), N-гидроксисукцинимид (при помощи остатков лизина), глутаральдегид, янтарный ангидрид, SOCl2 или R1N=C=NR, где R и R1 являются разными алкильными группами.

Животных иммунизируют против данного антигена, иммуногенных конъюнгатов или производных соединений, для чего, например, 100 мкг или 5 мкг белка или конъюгата (соответственно для кроликов или мышей) объединяют с 3 объемами полного адъюванта Фрейнда и полученный раствор инъецируют внутрикожно на нескольких участках тела. Через месяц животным вторично инъецируют от 1/5 до 1/10 первоначального количества пептида или конъюгата в полном адъюванте Фрейнда, делая несколько подкожных инъекций на разных участках тела. Через 7-14 дней у животных берут пробы крови и анализируют сыворотку для определения титра антител. Животным продолжают делать инъекции до стабилизации титра. Животным предпочтительно вторично инъецируют конъюгат такого же антигена, но конъюгированного с другим белком и/или с использованием другого перекрестно сшивающего реагента. Конъюгаты можно также получить в культуре рекомбинантных клеток в виде слитого белка. Кроме того, для усиления иммунной реакции можно использовать агрегирующие агенты, такие как квасцы.

Моноклональные антитела

Моноклональные антитела получают из популяции по существу гомогенных антител, то есть такой популяции, в которой образующие ее отдельные антитела являются идентичными за исключением возможных естественных мутаций, которые могут присутствовать в незначительном количестве. Таким образом, термин "моноклональный" означает, что данное антитело не являются смесью разных антител.

Например, моноклональные антитела можно получить методом создания гибридомы, который впервые был описан в публикации Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), или методами рекомбинантных ДНК (патент США № 4816567).

В методе создания гибридромы мышь или другое пригодное животное-хозяин, такое как хомячок, иммунизируют вышеописанным методом для получения лимфоцитов, продуцирующих или способных продуцировать антитела, специфически связывающиеся с белком, используемым для иммунизации. Альтернативно лимфоциты могут быть иммунизированы in vitro. Затем лимфоциты сливают с миеломными клетками, используя приемлемый агент, вызывающий слияние клеток, такой как полиэтиленгликоль, с образованием клетки гибридомы (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).

Полученные таким образом клетки гибридомы высевают и выращивают в приемлемой культуральной среде, которая предпочтительно содержит одно или несколько веществ, подавляющих рост или выживание неслитых родительских миеломных клеток. Например, если в родительских миеломных клетках отсутствует фермент гипоксантингуанин-фосфорибозилтрансфераза (HGPRT или HPRT), культуральная среда для гибридом обычно включает гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда НАТ), которые предотвращают рост клеток, не содержащих HGPRT.

Предпочтительными миеломными клетками являются клетки, которые эффективно слиты, поддерживают устойчивое высокое продуцирование антитела выбранными антитело-продуцирующими клетками и чувствительны к среде, такой как среда НАТ. Кроме того, предпочтительными линиями миеломных клеток являются линии миеломных клеток мышей, в частности клетки, полученные из опухолей мышей MOPC-21 и МРС-11, которые можно приобрести в Salk Institure Cell Distribution Center, San Diego, California, USA, и клетки SP-2 или X63-Ag8-653, которые можно приобрести в Американской коллекции типовых культур, Rockville, Maryland, USA. Линии миеломных клеток человека и гетеромиеломных клеток мыши-человека также можно использовать для продуцирования моноклональных антител человека (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984) и Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

Культуральную среду, в которой выращивают клетки гибридомы, анализируют на продуцирование моноклональных антител, направленных против данного антигена. Специфичность связывания моноклональных антител, продуцируемых клетками гибридомы, предпочтительно определяют методом иммунопреципитации или анализом связывания in vitro, таким как радиоиммуноанализ (RIA) или твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA).

Сродство связывания моноклонального антитела можно, например, определить при помощи анализа Скатчарда, описанного в публикации Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).

После идентификации клеток гибридомы, которые продуцируют антитела, обладающие требуемой специфичностью, сродством и/или активностью, клоны можно субклонировать, ограничивая разведение, и выращивать стандартными методами (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Культуральные среды, пригодные для указанной цели, включают, например, среду D-MEM или RPMI-1640. Кроме того, клетки гибридомы можно выращивать in vivo в виде асцитических опухолей в организме животного.

Моноклональные антитела, секретированные субклонами, отделяют от культуральной среды, асцитической жидкости или сыворотки известными методами очистки антител, такими как, например, хроматография белков с использованием гидроксилапатита на колонке с А-сефарозой, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография.

ДНК, кодирующую моноклональные антитела, легко выделить и секвенировать известными методами (например, при помощи олигонуклеотидных зондов, способных специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи антител мыши). Клетки гибридомы являются предпочтительным источником такой ДНК. Выделенную ДНК можно ввести в экспрессирующие векторы, которые затем переносят в клетки-хозяева, такие как клетки E. coli, клетки COS обезьян, клетки яичника китайского хомячка (СНО) или миеломные клетки, которые в противном случае не продуцируют белок антитела, для синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. Рекомбинантная экспрессия ДНК, кодирующей антитело, в бактериях описана в публикациях Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) и Plückthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992).

В другом варианте осуществления изобретения моноклональные антитела или фрагменты указанных антител можно выделить из библиотек фагов антител, созданных методами, описанными в публикации McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). В публикациях Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) описано соответственно выделение антител мыши и человека с использованием библиотек фагов. В нижеследующих публикациях описано получение высокоаффинных (в нМ диапазоне) антител человека методом перестановки цепи (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), а также методом комбинаторного инфицирования и рекомбинации in vivo, предназначенным для создания больших библиотек фагов (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). Таким образом, указанные методы являются приемлемыми альтернативами традиционным методам получения моноклональных антител с использованием гибридомы, служащими для выделения моноклональных антител.

Кроме того, ДНК можно модифицировать, например, путем замены гомологичных последовательностей мыши кодирующей последовательностью константных областей тяжелой и легкой цепей человека (патент США № 4816567 и публикация Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)) или ковалентного связывания с кодирующей последовательностью иммуноглобулина всей или части кодирующей последовательности неиммуноглобулинового полипептида.

Такие неиммуноглобулиновые полипептиды обычно вводят вместо константных областей антитела или вместо вариабельных областей одного антиген-связывающего сайта антитела для создания химерного двухвалентного антитела, содержащего один антиген-связывающий сайт, обладающий специфичностью к одному антигену, или другой антиген-связывающий сайт, обладающий специфичностью к другому антигену.

Гуманизированные антитела

В данной области описаны методы гуманизации антител, отличных от человеческих.

Гуманизированное антитело предпочтительно содержит один или несколько аминокислотных остатков, введенных в него из источника, отличного от человека. Указанные аминокислотные остатки, отличные от человеческих, часто именуют "чужеродными" остатками, которые обычно получают из "чужеродной" вариабельной области. Гуманизация может быть произведена методом, разработанным Уинтером и соавторами (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 333:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), путем замены соответствующих последовательностей антитела человека последовательностями гипервариабельного участка. Такие "гуманизированные" антитела являются химерными антителами (патент США № 4816567), в которых часть интактной вариабельной области человека заменена соответствующей последовательностью вида, отличного от человека. На практике гуманизированные антитела обычно являются антителами человека, в которых некоторые остатки гипервариабельного участка и, возможно, некоторые остатки остовной области (FR) заменены остатками из аналогичных сайтов в антителах грызунов.

Выбор вариабельных областей человека как легкой, так и тяжелой цепей, предназначенных для создания гуманизированных антител, имеет очень важное значение для ослабления антигенности. В соответствии с так называемым "наиболее подходящим" методом последовательность вариабельной области антитела грызуна исследуют с использованием всей библиотеки известных последовательностей вариабельной области человека. Последовательность человека, которая ближе всего соответствует последовательности грызуна, принимают в качестве остовной области (FR) человека для гуманизированного антитела (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Clothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). В другом методе используют определенную остовную область, выделенную из согласованной последовательности всех антител человека определенной подгруппы легких или тяжелых цепей. Тот же остов можно использовать для нескольких разных гуманизированных антител (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)).

Кроме того, важно, чтобы антитела были гуманизированы с сохранением высокого сродства к данному антигену и других полезных биологических свойств. Для достижения данной цели гуманизированные антитела получают в соответствии с предпочтительным методом, который предполагает исследование исходных последовательностей и разных концептуальных гуманизированных продуктов с использованием трехмерных моделей исходных и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулина широко применяются и хорошо известны специалистам в данной области. Существуют компьютерные программы, которые иллюстрируют и отображают вероятные трехмерные конформационные структуры выбранных последовательностей иммуноглобулина. Анализ полученных изображений позволяет определить вероятную роль остатков в функционировании выбранной последовательности иммуноглобулина, то есть остатков, влияющих на способность выбранного иммуноглобулина связываться со своим антигеном. Подобным образом можно выбрать и объединить остатки FR из последовательности реципиента и чужеродной последовательности с достижением требуемых характеристик антитела, в частности повышенного сродства к антигенам-мишеням. Как правило, остатки гипервариабельного участка непосредственно и наиболее активно влияют на связывание с антигеном.

Типичные гуманизированные антитела против ErbB2, связывающиеся с ErbB2 и блокирующие активацию лигандом рецептора ErbB, описаны в заявке WO 01/0245, которая включена в данное описание изобретения в качестве ссылки. Гуманизированные антитела, представляющие особый интерес, блокируют EGF, TGF-α и/или HRG-опосредованную активацию МАРК практически так же эффективно, как моноклональное антитело 2С4 мыши (или его Fab-фрагмент), и/или связываются с ErbB2 по существу так же эффективно, как моноклональное антитело 2С4 мыши (или его Fab-фрагмент). Гуманизированные антитела могут, например, содержать остатки гипервариабельного участка, отличные от человеческих, которые введены в вариабельную область тяжелой цепи человека, и могут далее содержать остовную область (FR) с заменой остатков в положении, выбираемом из группы, включающей 69Н, 71Н и 73Н в соответствии с системой нумерации вариабельной области, приведенной в публикации Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). В одном варианте осуществления изобретения гуманизированное антитело содержит FR с заменой остатков в двух или всех положениях 69Н, 71Н и 73Н.

Типичное гуманизированное антитело, представляющее интерес для данного изобретения, содержит определяющие комплементарность остатки вариабельной области тяжелой цепи GFTFTDYTMX, где Х предпочтительно означает D или S (SEQ ID NO:7); DVNPNSGGSIYNQRFKG (SEQ ID NO:8) и/или NLGPSFYFDY (SEQ ID NO:9), необязательно содержащие аминокислотные модификации указанных остатков CDR, которые сохраняют или улучшают сродство указанного антитела. Например, в вышеуказанных последовательностях CDR вариабельной области тяжелой цепи представляющего интерес варианта антитела может быть заменено от одного до около семи или около пяти аминокислотных остатков. Такие варианты антитела можно получить в результате "созревания аффинности", как это описано ниже. Наиболее предпочтительное гуманизированное антитело содержит аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, приведенную в SEQ ID NO:4 (фигура 1В).

Гуманизированное антитело может содержать определяющие комплементарность остатки вариабельной области легкой цепи KASQDVSIGVA (SEQ ID NO:10); SASYX1X2X3, где Х1 предпочтительно означает R или L, Х2 предпочтительно означает Y или Е и Х3 предпочтительно означает Т или S (SEQ ID NO:11); и/или QQYYIYPYT (SEQ ID NO:12), помимо остатков CDR вариабельной области тяжелой цепи, указанных в предыдущем абзаце. Такие гуманизированные антитела необязательно включают в себя аминокислотные модификации вышеуказанных остатков CDR, которые сохраняют или улучшают сродство антитела. Например, в вышеуказанных последовательностях CDR вариабельной области легкой цепи представляющего интерес варианта антитела может быть заменено от одного до около семи или около пяти аминокислотных остатков. Такие варианты антитела можно получить в результате "созревания аффинности", как это описано ниже. Наиболее предпочтительное гуманизированное антитело содержит аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, приведенную в SEQ ID NO:3 (фиг.1А).

Настоящая заявка относится также к антителам с созревшей аффиностью, которые связываются с ErbB2 и блокируют активность лиганда рецептора ErbB. Исходное антитело может быть антителом человека или гуманизированным антителом, например антителом, содержащим последовательности вариабельной области легкой и/или тяжелой цепи, приведенные соответственно в SEQ ID NO:3 и 4 (то есть вариант 574; фиг.1А и В). Антитело с созревшей аффинностью предпочтительно связывается с рецептором ErbB2 с более высокой степенью сродства, чем антитело 2С4 мыши или вариант 574 (например, сродство связывания возрастает примерно с двух или четырех раз до ста или тысячи раз при выполнении анализа методом ELISA внеклеточного домена ErbB2 (ECD)). Типичные заменяемые остатки CDR вариабельной области тяжелой цепи включают в себя H28, Н30, Н34, Н35, Н64, Н96, Н99 или комбинации двух или более остатков (например, два, три, четыре, пять, шесть или семь указанных остатков). Примеры заменяемых остатков CDR вариабельной области легкой цепи включают в себя L28, L50, L53, L56, L91, L92, L93, L94, L96, L97 или комбинации двух или более остатков (например, два, три, четыре, пять или примерно до десяти вышеуказанных остатков).

В объем настоящего изобретения входят разные формы гуманизированного антитела или антитела с созревшей аффинностью. Например, гуманизированное антитело или антитело с созревшей аффинностью может представлять собой фрагмент антитела, такой как Fab, который необязательно конъюгирован с одним или несколькими цитотоксическими агентами с образованием иммуноконъюгата. Альтернативно гуманизированное антитело или антитело с созревшей аффинностью может быть интактным антителом, таким как интактное антитело IgG1.

Антитела человека

В качестве альтернативы гуманизации можно получить антитела человека. Например, можно создать трансгенных животных (например, мышей), способных в результате иммунизации продуцировать полный спектр антител человека без продуцирования эндогенного иммуноглобулина. Например, в научной литературе описано, что ген гомозиготной делеции соединительной области тяжелой цепи (JH) антитела у химерных и гаметических мутантных мышей полностью подавляет продуцирование эндогенного антитела. Перенос гена гаметического иммуноглобулина человека в организм таких гаметических мутантных мышей вызывает продуцирование антител человека при антигенной стимуляции. См., например, публикации Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993) и патенты США №№ 5591669, 5589369 и 5545807.

Альтернативно можно использовать метод отображения фага (McCafferty et al., Nature, 348:552-553 (1990)) для продуцирования антител и фрагментов антител человека in vitro из набора генов вариабельной области (V) иммуноглобулина, полученного у неиммунизированных доноров.

В соответствии с указанным методом гены вариабельной области (V) антитела клонируют в рамке считывания в главном или минорном гене белка оболочки нитевидного бактериофага, такого как М13 или fd, и отображают в виде функционально активных фрагментов антитела на поверхности фаговой частицы. Так как нитевидная частица содержит копию одноцепочечной ДНК генома фага, выбор на основе функциональных свойств антитела позволяет выбрать ген, кодирующий антитело, обладающее такими свойствами. Таким образом, фаг имитирует некоторые свойства В-клетки. Фаг может быть отображен в разных форматах; для ознакомления с указанными форматами см., например, публикацию Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology, 3:564-571 (1993). Для отображения фага можно использовать несколько источников сегментов V-гена. В публикации Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) описано выделение различных антител против оксазолона из небольшой произвольной комбинаторной библиотеки V-генов, выделенных из селезенки иммунизированных мышей. В соответствии с методами, описанными в публикациях Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) или Griffith et al., EMBO J., 12:725-734 (1993), можно создать набор V-генов, полученных у неиммунизированных людей-доноров, и выделить антитела к разным антигенам (включая аутоантигены). См. также патенты США №№ 5565332 и 5573905.

Как указывалось выше, антитела человека можно также получить при помощи активированных in vitro В-клеток (см. патенты США №№ 5567610 и 5229275).

Антитела против ErbB2 человека описаны в патенте США № 5772997, выданном 30 июня 1998 г., и в заявке WO 97/00271, опубликованной 3 января 1997 г.

Фрагменты антител

Разработаны разные методы получения фрагментов антител.

Указанные фрагменты обычно получают в результате протеолитического гидролиза интактных антител (см., например, публикации Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24:107-117 (1992) и Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Однако подобные фрагменты теперь можно получить непосредственно в рекомбинантных клетках-хозяевах. Например, фрагменты антител можно выделить из вышеописанных библиотек фагов антител. Альтернативно Fab'-SH-фрагменты можно получить непосредственно из E. coli и химически связать с образованием F(ab')2-фрагментов (Carter et al., Bio/Technology, 10:163-167 (1992)). В соответствии с другим подходом F(ab')2-фрагменты можно выделить непосредственно из культуры рекомбинантных клеток-хозяев. Квалифицированному специалисту в данной области должны быть известны другие методы получения фрагментов антител. В других вариантах осуществления изобретения выбранным антителом является одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv). См. заявку WO 93/16185, патенты США №№ 5571894 и 5587458. Фрагмент антитела может также быть линейным антителом, например, описанным в патенте США № 5641870. Фрагменты линейных антител могут быть моноспецифическими или биспецифическими.

Биспецифические антитела

Биспецифические антитела являются антителами, обладающими специфичностью связывания в отношении по меньшей мере двух разных эпитопов. Типичные биспецифические антитела могут связываться с двумя разными эпитопами белка ErbB2. Другие такие антитела могут объединять сайт связывания ErbB2 с сайтами связывания EGFR, ErbB3 и/или ErbB4. Альтернативно домен антитела против ErbB2 может быть объединен с доменом, связывающимся с запускающей молекулой на лейкоците, такой как молекула Т-клеточного рецептора (например, CD2 или СD3), или Fc-рецепторами для IgG (FcγR), такими как FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) и FcγRIII (CD16), чтобы направить защитные механизмы клетки на ErbB2-экспрессирующую клетку. Биспецифические антитела можно также использовать для локализации цитотоксических агентов в клетках, экспрессирующих ErbB2. Указанные антитела имеют ErbB2-связывающий домен и домен, связывающий цитотоксический агент (такой как сапорин, антиинтерферон-α, алкалоид барвинка, цепь рицина А, метотрексат или гаптен, меченный радиоактивным изотопом). Биспецифические антитела можно получить в виде непроцессированных антител или фрагментов антител (например, F(ab')2-фрагмент биспецифических антител).

В заявке WO 96/16673 описано биспецифическое антитело против ErbB2/FcγRIII, и в патенте США № 5837234 описано биспецифическое антитело против ErbB2/FcγRI. Биспецифическое антитело против ErbB2/Fcα описано в заявке WO 98/02463. В патенте США № 5821337 описано биспецифическое антитело против ErbB2/CD3.

Методы получения биспецифических антител хорошо известны в данной области. Традиционное получение непроцессированных биспецифических антител основано на коэкспрессии двух пар тяжелых и легких цепей иммуноглобулина, где две цепи обладают разными специфичностями (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). Благодаря произвольному набору тяжелых и легких цепей иммуноглобулина указанные гибридомы (квадромы) продуцируют потенциальные смеси, состоящие из 10 разных молекул антител, из которых только одна имеет правильную биспецифическую структуру. Очистка правильной молекулы, которую обычно производят при помощи аффинной хроматографии, является довольно трудоемким процессом и дает низкий выход продукта. Аналогичные методы описаны в заявке WO 93/08829 и в публикации Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991).

В соответствии с другим методом вариабельные области антитела с требуемыми специфичностями связывания (сайты связывания антитело-антиген) сливают с последовательностями константной области иммуноглобулина. Указанное слияние предпочтительно осуществляют, используя константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую по меньшей мере часть шарнирных областей СН2 и СН3. Желательно иметь первую константную область тяжелой цепи (СН1), содержащую сайт, необходимый для связывания с легкой цепью, по меньшей мере в одном из положений слияния. ДНК, кодирующие слитую тяжелую цепь иммуноглобулина и при желании легкую цепь иммуноглобулина, вводят в отдельные экспрессирующие векторы и котрансфецируют в приемлемый организм-хозяин. Это создает хорошую гибкость в процессе регулирования взаимных пропорций трех полипептидных фрагментов в тех случаях, когда неравные соотношения трех полипептидных цепей, используемых в данной конструкции, обеспечивают оптимальный выход. Однако кодирующие последовательности для двух или всех трех полипептидных цепей можно вводить в один экспрессирующий вектор, когда экспрессия по меньшей мере двух полипептидных цепей в равных соотношениях обеспечивает высокий выход или когда указанные соотношения не имеют конкретного значения.

В предпочтительном варианте данного метода биспецифические антитела состоят из тяжелой цепи гибридного иммуноглобулина, обладающей первой специфичностью связывания в одном домене, и пары тяжелых и легких цепей гибридного иммуноглобулина (обладающей второй специфичностью связывания) в другом домене. Установлено, что подобная ассимметричная структура облегчает отделение требуемого биспецифического соединения от нежелательных комбинаций цепей иммуноглобулина, так как наличие легкой цепи иммуноглобулина только в одной половине биспецифической молекулы облегчает разделение. Данный метод описан в заявке WO 94/04690. Более подробно с получением биспецифических антител можно ознакомиться, например, в публикации Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

В соответствии с другим методом, описанным в патенте США № 5731168, поверхность раздела между двумя молекулами антитела может быть создана так, чтобы максимально увеличить процентное число гетеродимеров, выделяемых из культуры рекомбинантных клеток. Предпочтительная поверхность раздела включает по меньшей мере часть СН3-домена константной области антитела. В соответствии с данным методом одну или несколько небольших аминокислотных боковых цепей, отходящих от поверхности раздела первой молекулы антитела, заменяют более крупными боковыми цепями (такими как тирозин или триптофан). На поверхности раздела второй молекулы антитела создают компенсирующие "полости" идентичного или подобного размера для создания больших боковых цепей на поверхности второй молекулы антитела путем замены больших аминокислотных боковых цепей меньшими цепями (такими как аланин или треонин). Таким образом создается механизм увеличения выхода гетеродимера по сравнению с другими нежелательными конечными продуктами, такими как гомодимеры.

Биспецифические антитела включают в себя перекрестносшитые, или "гетероконъюгированные", антитела. Например, одно антитело в гетероконъюгате можно быть связано с авидином, и другое антитело может быть связано с биотином. Такие антитела было предложено использовать для направленной доставки клеток иммунной системы к нежелательным клеткам (патент США № 4676980) и для лечения ВИЧ-инфекции (заявки WO 91/00360, WO 92/200373 и европейский патент № 03089). Гетероконъюгированные антитела можно получить любыми известными методами перекрестного сшивания. Приемлемые перекрестносшивающие агенты хорошо известны в данной области и описаны в патенте США № 4676980 наряду с целым рядом методов перекрестного сшивания.

В научной литературе описаны также методы получения биспецифических антител из фрагментов антител. Например, биспецифические антитела можно получить путем химического связывания. В публикации Brennan et al., Science, 229:81 (1985) описан способ, в соответствии с которым интактные антитела протеоолитически расщепляют с образованием F(ab')2-фрагментов. Указанные фрагменты восстанавливают в присутствии агента, образующего комплекс с дитиолом, такого как арсенит натрия, используемого для стабилизации соседних дитиолов и предотвращения образования межмолекулярных дисульфидных связей. Полученные Fab'-фрагменты затем превращают в тионитробензоатные производные (TNB). Одно из производных Fab'-TNB затем вновь превращают в Fab'-тиол, производя восстановление меркаптоэтиламином, и смешивают с эквимолярным количеством другого производного Fab'-TNB, в результате чего образуется биспецифическое антитело. Полученные биспецифические антитела можно использовать в качестве агентов для селективной иммобилизации ферментов.

Недавно разработанные методы облегчают прямое выделение Fab'-SH-фрагментов из E. coli, которые могут быть химически связаны с образованием биспецифических антител. В публикации Shalaby et al., J. Exp. Med., 175:217-225 (1992) описано получение молекулы F(ab')2-фрагмента полностью гуманизированного биспецифического антитела. Каждый Fab'-фрагмент отдельно секретируют из E. coli и подвергают прямому химическому связыванию in vitro с образованием биспецифического антитела. Полученное таким образом биспецифическое антитело способно связываться с клетками, сверхэкспрессирующими рецептор ErbB2, и с нормальными Т-клетками человека, а также запускать литическую активность цитотоксических лимфоцитов человека против клеток-мишеней опухоли молочной железы человека.

В научной литературе описаны разные методы получения и выделения фрагментов биспецифических антител непосредственно из культуры рекомбинантных клеток. Например, биспецифические антитела были продуцированы с использованием лейциновых зипперов. Публикация Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Пептиды лейциновых зипперов из белков Fos и Jun связывают с Fab'-фрагментами двух разных антител путем слияния генов. Гомодимеры антител восстанавливают в шарнирной области с образованием мономеров и затем вторично окисляют с образованием гетеродимеров антител. Указанный метод можно также использовать для получения гомодимеров антител. Метод получения "ди-антитела", описанный в публикации Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993), представляет собой альтернативный механизм получения фрагментов биспецифических антител. Указанные фрагменты содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH), соединенную с вариабельной областью легкой цепи (VL) при помощи линкера, который является слишком коротким для спаривания двух областей в одной и той же цепи. Таким образом, VH- и VL-области одного фрагмента спаривают с комплементарными VL- и VH-областями другого фрагмента, в результате чего образуются два антиген-связывающих сайта. В научной литературе описан также другой метод получения фрагментов биспецифического антитела, включающий использование одноцепочечных Fv (sFv) димеров. См. публикацию Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).

В объем настоящего изобретения входят антитела, имеющие более двух валентностей. Например, можно получить триспецифические антитела. Публикация Tutt et al., J. Immunol., 147:60 (1991).

Другие модификации аминокислотных последовательностей

В объем настоящего изобретения входят модификации аминокислотных последовательностей в антителах против ErbB2. Например, может быть желательно улучшить сродство связывания и/или другие биологические свойства антител. Варианты аминокислотных последовательностей в антителах против ErbB2 получают путем замены соответствующих нуклеотидов в нуклеиновой кислоте антитела против ErbB2 или синтеза пептидов. Такие модификации включают, например, делеции, и/или вставки, и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антитела против ErbB2. Любую комбинацию делеций, вставок и замен создают с целью получения конечной конструкции, обладающей требуемыми характеристиками. Замены аминокислот могут также изменять посттрансляционные процессы в антителах против ErbB2, в частности изменение числа сайтов гликозилирования или их положение.

Приемлемый метод идентификации определенных остатков или областей антител против ErbB2, представляющих собой предпочтительные участки для мутагенеза, получил название "мутагенез методом сканирования аланина" и описан в публикации Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989). При осуществлении данного метода идентифицируют остаток или группу остатков-мишеней (например, заряженные остатки, такие как arg, asp, his, lys и glu) и заменяют их нейтральной или отрицательно заряженной аминокислотой (наиболее предпочтителен аланин или полиаланин) для осуществления взаимодействия указанных аминокислот с антигеном ErbB2. В сайты замещения, содержащие аминокислоты, функционально пригодные для замены, вводят дополнительные или другие аминокислоты. Таким образом, хотя сайт для введения вариантной аминокислотной последовательности определяют заранее, характер созревания сам по себе не требует предварительного определения. Например, для анализа характера мутации на данном сайте выполняют сканирование ala или неспецифический мутагенез в кодоне или области-мишени и экспрессированные варианты антитела против ErbB2 исследуют в отношении требуемой активности.

Вставки в аминокислотную последовательность включают в себя амино- и/или карбоксиконцевые слияния, длина которых изменяется от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или более остатков, а также вставки одного или нескольких аминокислотных остатков внутри последовательности. Примеры концевых вставок включают в себя антитело против ErbB2 с N-концевым метионильным остатком или антитело, слитое с цитотоксическим полипептидом. Другие инсерционные варианты молекул антитела против ErbB2 включают в себя слияние N- или С-конца антител против ErbB2 с репортерной молекулой, ферментом (например, ADEPT) или полипептидом, который увеличивает полупериод существования антитела в сыворотке крови.

Вариантом другого типа является вариант с заменой аминокислот. В указанных вариантах по меньшей мере один аминокислотный остаток в молекуле антитела против ErbB2 заменяют другим остатком. Сайты, представляющие наибольший интерес для заместительного мутагенеза, включают в себя гипервариабельные участки, но в объем настоящего изобретения входят также замены в остовной области (FR). Замены консервативных остатков показаны в таблице 1 под заголовком "Предпочтительные замены". Если такие замены вызывают изменение биологической активности, то могут быть произведены более существенные замены, приведенные под заголовком "Иллюстративные замены" в Таблице 1, или описанные ниже при рассмотрении классов аминокислот, после чего производят скрининг продуктов.

Таблица 1Исходный остатокИллюстративные заменыПредпочтительные заменыAla (A)val; leu; ilevalArg (R)lys; gln; asnlysAsn (N)gln; his; asp; lys; argglnAsp (D)glu; asngluCys (C)ser; alaserGln (Q)asn; gluasnGlu (E)asp; glnaspGly (G)AlaalaHis (H)asn; gln; lys; argargIle (I)leu; val; met; ala; phe; норлейцинleuLeu (L)норлейцин; ile; val; met; ala; pheileLys (K)arg; gln; asnargMet (M)leu; phe; ileleuPhe (F)leu; val; ile; ala; tyrtyrPro (P)AlaalaSer (S)ThrthrThr (T)SerserTrp (W)tyr; phetyrTyr (Y)trp; phe; thr; serpheVal (V)ile; leu; met; phe; ala; норлейцинleu

Значительные изменения биологических свойств антитела происходят в результате выбора заменяемых остатков, которые существенно отличаются по своему воздействию на сохранение (а) структуры полипептидного остова на участке замены, например, в виде складчатой или спиральной конформации, (b) заряда или гидрофобности молекулы на сайте-мишени или (с) основного объема боковой цепи. Естественные остатки делят на группы с учетом свойств боковых цепей:

(1) гидрофобные: норлейцин, met, ala, val, leu, ile;

(2) нейтральные гидрофильные: cys, ser, thr;

(3) кислотные: asp, glu;

(4) основные: asn, gln, his, lys, arg;

(5) остатки, влияющие на ориентацию цепи: gly, pro;

(6) ароматические: trp, tyr, phe.

Замены неконсервативных остатков предполагают замену остатка одного класса остатком другого класса.

Любой остаток цистеина, не участвующий в сохранении соответствующей конформации антитела против ErbB2, может быть также заменен, обычно серином, для улучшения устойчивости молекулы к окислению и предотвращения аберрантного перекрестного сшивания. И, наоборот, в антитело могут быть введены цистеиновые связи для улучшения его устойчивости (в частности, когда антитело является фрагментом антитела, таким как Fv-фрагмент).

Особенно предпочтительный тип заместительного варианта включает замену одного или нескольких остатков гипервариабельного участка в исходном антителе (например, гуманизированном антителе или антителе человека). Полученный(ые) вариант(ы), выбранный для дальнейшей разработки, обычно обладает улучшенными биологическими свойствами по сравнению с исходным антителом, из которого данный вариант был получен. Обычный способ получения таких заместительных вариантов включает созревание аффинности с использованием отображения фага. Коротко говоря, несколько сайтов гипервариабельного участка (например, 6-7 сайтов) мутируют с созданием всех возможных замен аминокислот на каждом сайте. Полученные таким образом варианты антител отображают в одновалентном виде на нитевидных фаговых частицах в виде слияний с продуктом гена III М13, упакованного в каждой частице. Варианты с отображенным фагом затем исследуют в отношении их биологической активности (например, сродства связывания) в соответствии с приведенным здесь описанием. Для идентификации пригодных для модификации сайтов гипервариабельного участка можно произвести мутагенез методом сканирования аланина, чтобы выявить остатки гипервариабельного участка, оказывающие существенное влияние на связывание антигена. Альтернативно или дополнительно можно выполнить анализ кристаллической структуры комплекса антиген-антитело для обнаружения точек контактирования между антителом и ErbB2 человека. Такие контактирующие и соседние остатки могут быть заменены в соответствии с рассмотренными методами. После создания таких вариантов выполняют скрининг панели вариантов описанными здесь методами и для дальнейшей разработки отбирают антитела, демонстрирующие лучшие свойства при выполнении одного или нескольких анализов.

Другим типом замены аминокислот является изменение исходного паттерна гликозилирования антитела. Указанная замена предполагает удаление одной или нескольких углеводных частей, обнаруженных в антителе, и/или добавление одного или нескольких сайтов гликозилирования, отсутствующих в данном антителе.

Гликозилирование антител обычно является N-связанным или О-связанным. N-связанное гликозилирование предполагает присоединение углеводной части к боковой цепи остатка аспарагина. Трипептидные последовательности аспарагин-Х-серин и аспарагин-Х-треонин, где Х означает любую аминокислоту, за исключением пролина, являются распознающими последовательностями для ферментного присоединения углеводной части к боковой цепи аспарагина. Таким образом, наличие указанных трипептидных последовательностей в полипептиде создает потенциальный сайт гликозилирования. О-связанное гликозилирование предполагает присоединение одного из сахаров N-ацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы к гидроксиаминокислоте, обычно серину или треонину, хотя можно также использовать 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин.

Введение сайтов гликозилирования в антитело обычно выполняют путем изменения аминокислотной последовательности таким образом, чтобы она содержала одну или несколько вышеуказанных трипептидных последовательностей (для N-связанных сайтов гликозилирования). Указанное изменение можно также произвести путем добавления или замены одного или нескольких остатков серина или треонина в последовательности исходного антитела (для О-связанных сайтов гликозилирования).

Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие варианты аминокислотной последовательности антитела против ErbB2, получают разными методами, известными в данной области. Указанные методы включают, не ограничиваясь ими, выделение из природного источника (в случае естественных вариантов аминокислотной последовательности) или получение при помощи олигонуклеотид-опосредованного (или сайтнаправленного) мутагенеза, мутагенеза методом PCR или мутагенеза с использованием полигенного экспрессирующего кластера ранее полученного варианта или не являющегося вариантом антитела против ErbB2.

Может быть желательно модифицировать антитела по данному изобретению в отношении эффекторной функции, например, для усиления антиген-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC) и/или комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC) антитела. Указанная цель может быть достигнута путем замены одной или нескольких аминокислот в Fc-области антитела. Альтернативно или дополнительно в Fc-область можно ввести один или несколько остатков цистеина, что вызывает образование дисульфидной связи между цепями в данной области. Полученное таким образом гомодимерное антитело может обладать улучшенной интернализацией и/или более высоким комплемент-опосредованным уничтожением клеток и антитело-зависимой клеточной цитотоксичностью (ADCC). См. публикации Caron et al., J. Exp. Med. 176:1191-1195 (1992) и Shopes, B., J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992). Гомодимерные антитела с повышенной противоопухолевой активностью можно также получить, используя гетеробифункциональные кросс-линкеры, описанные в публикации Wolff et al., Cancer Research, 53:2560-2565 (1993). Альтернативно можно создать антитело, имеющее две Fc-области, которое поэтому обладает лучшими свойствами комплемент-опосредованного лизиса и ADCC. См. публикацию Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989).

Для увеличения полупериода существования антитела в сыворотке крови в указанное антитело (особенно во фрагмент антитела) можно ввести эпитоп связывания рецептора сохранения, как это описано в патенте США № 5739277. В используемом здесь значении термин "эпитоп связывания рецептора сохранения" означает эпитоп Fc-области молекулы IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3 или igG4), который является ответственным за увеличение полупериода существования молекулы IgG в сыворотке крови.

Скрининг антител с требуемыми свойствами

Выше были описаны методы получения антител. Далее при желании можно отобрать антитела с определенными биологическими характеристиками.

Чтобы идентифицировать антитело, блокирующее активацию лигандом рецептора ErbB, можно определить способность антитела блокировать связывание лиганда ErbB с клетками, экспрессирующими рецептор ErbB (например, в виде конъюгата с другим рецептором ErbB, с которым представляющий интерес рецептор ErbB образует гетероолигомер ErbB). Например, клетки, которые в естественном состоянии экспрессируют рецепторы ErbB гетероолигомера ErbB или трансфецированы для экспрессии указанных рецепторов, можно инкубировать с данным антителом и подвергнуть воздействию меченого лиганда ErbB. Затем можно определить способность антитела против ErbB2 блокировать связывание лиганда с рецептором ErbB в гетероолигомере ErbB.

Например, ингибирование связывания HRG с линиями опухолевых клеток молочной железы MCF7 антителами против ErbB2 с использованием монослойных культур MCF7 на льду на 24-луночном планшете можно выполнять в соответствии с описанием, приведенным в заявке WO 01/00245. В каждую лунку можно добавить моноклональные антитела против ErbB2 и инкубировать в течение 30 минут. Затем можно добавить ¹²⁵I-меченный rHRGβ1177-224 (25 пм) и продолжить инкубацию в течение 4-16 часов. Можно построить кривые дозовой зависимости и вычислить значение IC₅₀ для представляющего интерес антитела. В одном варианте осуществления изобретения антитело, блокирующее активацию лигандом рецептора ErbB, имеет значение IC₅₀ для ингибирования связывания HRG с клетками MCF7 при выполнении данного анализа, равное примерно 50 нМ или меньше, более предпочтительно 10 нМ или меньше. Если антитело является фрагментом антитела, таким как Fab-фрагмент, значение IC₅₀ для ингибирования связывания HRG с клетками MCF7 при выполнении данного анализа равно примерно 100 нМ или меньше, более предпочтительно 50 нМ или меньше.

Альтернативно или дополнительно можно оценить способность антитела против ErbB2 блокировать лиганд-стимулированное фосфорилирование тирозина рецептора ErbB, присутствующего в гетероолигомере ErbB. Например, клетки, эндогенно экспрессирующие рецепторы ErbB или трансфецированные для экспрессии указанных рецепторов, можно инкубировать с данным антителом и затем подвергнуть анализу на активность фосфорилирования тирозина в зависимости от лиганда ErbB с использованием моноклонального антитела против фосфотирозина (которое необязательно конъюгировано с детектируемой меткой). Анализ активации рецептора киназы, описанный в патенте США № 5766863, применим также для определения активации рецептора ErbB и блокирования антителом указанной активности.

В одном варианте осуществления изобретения можно произвести скрининг антитела, ингибирующего стимуляцию HRG фосфорилирования тирозина р180 в клетках MCF7, в соответствии с описанием, приведенным в нижеследующем примере 1. Например, клетки MCF7 можно культивировать на 24-луночных планшетах, добавляя в каждую лунку моноклональные антитела к ErbB2 и инкубируя в течение 30 минут при комнатной температуре; затем в каждую лунку можно добавить rHRGβ1177-244 до конечной концентрации, равной 0,2 нМ, и продолжить инкубацию в течение 8 минут. Из лунок можно отсосать среду и прекратить реакцию путем добавления 100 мкл буфера для образца c додецилсульфатом натрия (SDS) (5% SDS, 25 мМ DTT и 25 мМ Трис-буфера с HCl, рН 6,8). Каждый образец (25 мкл) можно разделить электрофорезом в 4-12% градиентном геле (Novex) и электрофоретически перенести на мембрану из поливинилидендифторида. Можно получить иммуноблоты антифосфотирозина (при 1 мкг/мл) и при помощи денситометрии в отраженном свете произвести количественное определение интенсивности основной реакционноспособной полосы при Mr ˜180000. Выбранное антитело предпочтительно должно ингибировать стимуляцию HRG фосфорилирования тирозина р180 примерно на 0-35% по сравнению с контрольным образцом, используемым в данном анализе. Можно построить кривую зависимости от дозы для ингибирования стимуляции HRG фочсфорилирования тирозина р180, определенного методом денситометрии в отраженном свете, и вычислить значение IC₅₀ для представляющего интерес антитела. В одном варианте осуществления изобретения антитело, блокирующее активацию лигандом рецептора ErbB, имеет значение IC₅₀ для ингибирования стимуляции HRG фосфорилирования тирозина р180 при выполнении данного анализа, равное примерно 50 нМ или меньше, более предпочтительно 10 нМ или меньше. Если антитело является фрагментом антитела, таким как Fab-фрагмент, значение IC₅₀ для ингибирования стимуляции HRG фосфорилирования тирозина р180 при выполнении данного анализа равно примерно 100 нМ или меньше, более предпочтительно 50 нМ или меньше.

Кроме того, можно оценить ингибирующее действие данного антитела на рост клеток MDA-MB-175, например, методом, описанным в публикации Schaefer et al., Oncogene, 15:1385-1394 (1997). В соответствии с данным анализом клетки MDA-MB-175 можно обработать моноклональным антителом против ErbB2 (10 мкг/мл) в течение 4 дней и окрасить кристаллическим фиолетовым. Результаты инкубации с антителом против ErbB2 показывают, что ингибирующее действие на рост данной линии клеток аналогично действию, оказываемому моноклональным антителом 2С4. В другом варианте осуществления изобретения экзогенный HRG существенно не изменяет указанное ингибирующее действие. Данное антитело способно ингибировать пролиферацию клеток MDA-MB-175 в большей степени, чем моноклональное антитело 4D5 (и необязательно в большей степени, чем моноклональное антитело 7F3) как в присутствии, так и в отсутствие экзогенного HRG.

В одном варианте осуществления изобретения представляющее интерес антитело против ErbB2 может блокировать герегулин-зависимое связывание ErbB2 с ErbB3 в клетках MCF7 и SK-BR-5 при определении методом коиммунопреципитации, аналогичным описанному в примере 1, гораздо эффективнее, чем моноклональное антитело 4D5, и предпочтительно значительно эффективнее, чем моноклональное антитело 7F3.

Для идентификации ингибирующих рост антител против ErbB2 можно произвести скрининг антител, подавляющих рост раковых клеток, сверхэкспрессирующих ErbB2. В одном варианте осуществления изобретения выбранное ингибирующее рост антитело способно подавлять рост клеток SK-BR-3 в культуре клеток примерно на 20-100% и предпочтительно примерно на 50-100% при концентрации антитела около 0,5-30 мкг/мл. Для идентификации таких антител можно выполнить анализ клеток SK-BR-3, описанный в патенте США № 5677171. В соответствии с данным анализом клетки SK-BR-3 выращивают в смеси сред F12 и DMEM с соотношением 1:1, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки, глутамин и пенициллин-стрептомицин. Клетки SK-BR-3 культивируют в количестве 20000 клеток в 35 мм чашке для культивирования клеток (2 мл/35 мм чашку). В каждую чашку добавляют 0,5-30 мкг/мл антитела против ErbB2. Через шесть дней при помощи электронного цитометра COULTER™ подсчитывают число клеток по сравнению с необработанными клетками. Антитела, ингибирующие рост клеток SK-BR-3 примерно на 20-100% или примерно на 50-100%, могут быть отобраны в качестве ингибирующих рост антител.

Для отбора антител, индуцирующих гибель клеток, можно оценить разрушение клеточной мембраны в сравнении с контрольным образцом, определяя поглощение иодида пропидия (PI), трипана синего или 7AAD. Предпочтительным анализом является поглощение PI с использованием клеток ВТ474. В соответствии с данным анализом клетки ВТ474 (которые можно приобрести в Американской коллекции типовых культур (Rockville, MD)) культивируют в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (D-MEM):среде Гама F-12 (50:50), содержащей 10% термоинактивированной FBS (Hyclone) и 2 мМ L-глутамина. (Таким образом, данный анализ выполняют при отсутствии комплемента и иммунокомпетентных эффекторных клеток.) Клетки ВТ474 высевают с плотностью 3×10⁶ в каждую чашку размером 100×20 мм и оставляют для прикрепления в течение ночи. Затем среду удаляют и заменяют свежей средой без добавок или средой, содержащей 10 мкг/мл соответствующего моноклонального антитела. Клетки инкубируют в течение 3 дней. После каждой обработки монослои промывают PBS и отделяют трипсинизацией. Затем клетки центрифугируют со скоростью 1200 об/мин в течение 5 минут при 40°С, осадок вторично суспендируют в 3 мл охлаждаемого льдом Са²⁺-связывающего буфера (10 мМ Hepes, рН 7,4, 140 мМ NaCl, 2,5 мМ CaCl₂) и аликвоты помещают в пробирки размером 12×75 с крышкой, оснащенной 35 мм сетчатым фильтром (1 мл/одна пробирка, 3 пробирки/группу, подвергнутую обработке) для удаления скоплений клеток. Затем в пробирки вводят PI (10 мкг/мл). Образцы могут быть подвергнуты анализу при помощи проточного цитометра FACSCAN™ с использованием программного обеспечения CellQuest FACSCONVERT™ (Becton Dickinson). Антитела, которые вызывают гибель клеток на статистически значимых уровнях, определяемую по поглощению PI, могут быть отобраны в качестве антител, индуцирующих гибель клеток.

Для отбора антител, индуцирующих апоптоз, может быть выполнен анализ связывания аннексина с использованием клеток ВТ474. Клетки ВТ474 культивируют и высевают в чашки, описанные в предыдущем абзаце. Затем среду удаляют и заменяют свежей средой без добавок или средой, содержащей 10 мкг/мл моноклонального антитела. После инкубации в течение трех дней монослои промывают PBS и отделяют трипсинизацией. Затем клетки центрифугируют, вторично суспендируют в Са²⁺-связывающем буфере и аликвоты помещают в описанные выше пробирки для выполнения анализа гибели клеток. Затем в пробирки вводят меченый аннексин (например, аннексин V-FTIC) (1 мкг/мл). Образцы могут быть подвергнуты анализу при помощи проточного цитометра FACSCAN™ с использованием программного обеспечения CellQuest FACSCONVERT™ (Becton Dickinson). Антитела, которые вызывают связывание аннексина на статистически значимых уровнях по сравнению с контрольным образцом, отбирают в качестве антител, индуцирующих апоптоз.

Помимо анализа связывания аннексина может быть выполнен анализ на окрашивание ДНК с использованием клеток ВТ474. Для выполнения данного анализа клетки ВТ474, обработанные представляющим интерес антителом при помощи метода, описанного в предыдущих двух абзацах, инкубируют с 9 мкг/мл HOECHST 33342™ в течение 2 часов при 37°С и затем анализируют в проточном цитометре EPICS ELITE™ (Coulter Corporqtion) с использованием программного обеспечения MODFIT LT™ (Verity Software House). Антитела, которые при выполнении данного анализа изменяют процент апоптозных клеток в 2 раза или больше (предпочтительно в 3 раза или больше) по сравнению с необработанными клетками (до 100% апоптозных клеток), могут быть отобраны в качестве проапоптозных антител.

Для скрининга антител, которые связываются с эпитопом рецептора ErbB2, связанного представляющим интерес антителом, может быть выполнен обычный перекрестноблокирующий анализ, аналогичный описанному в публикации Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Альтернативно или дополнительно можно произвести картирование эпитопов методами, известными в данной области (см., например, фиг.1А и 1В).

Иммуноконъюгаты

Данное изобретение относится также к иммуноконъюгатам, содержащим антитело, конъюгированное с цитотоксическим агентом, таким как химиотерапевтическое средство, токсин (например, низкомолекулярный токсин или ферментативно активный токсин бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, включая их фрагменты и/или варианты) или радиоактивный изотоп (то есть радиоконъюгат).

Химиотерапевтические средства, пригодные для получения таких иммуноконъюгатов, были описаны выше. В объем настоящего изобретения входят также конъюгаты антитела и одного или нескольких низкомолекулярных токсинов, таких как калихеамицин, майтанзин (патент США № 5208020), трихотин и СС1065.

В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело конъюгируют с одной или несколькими молекулами майтанзина (например, от около 1 до около 10 молекул майтанзина на одну молекулу антитела). Майтанзин может быть превращен в May-SS-Me, который можно восстановить в May-SH3 и подвергнуть взаимодействию с модифицированным антителом (Chari et al., Cancer Research, 52:127-131 (1992)) с образованием иммуноконъюгата майтанзиноид-антитело.

Другой представляющий интерес иммуноконъюгат содержит антитело против ErbB2, конъюгированное с одной или несколькими молекулами калихеамицина. Семейство антибиотиков, включающее калихеамицин, способно вызывать разрывы двухцепочечной ДНК в субпикомолярных концентрациях. Структурные аналоги калихеамицина, которые могут быть использованы в данном изобретении, включают, не ограничиваясь ими, γ1I, α2I, α3I, N-ацетил-γ1I, PSAG и θI1 (Hinman et al., Cancer Research, 53:3336-3342 (1993) и Lode et al., Cancer Research, 58:2925-2928 (1998). См. также патенты США №№ 5714586, 5712374, 5264586 и 5773001, которые включены в данное описание изобретения в качестве ссылки.

Ферментативно активные токсины и их фрагменты, которые могут быть использованы в данном изобретении, включают в себя цепь А дифтерии, несвязывающиеся активные фрагменты дифтерийного токсина, цепь А экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), цепь А рицина, цепь А абрина, цепь А модекцина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белки диантина, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор Sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены. См., например, заявку WO 93/21232, опубликованную 28 октября 1993 г.

Настоящее изобретение далее относится к иммуноконъюгату, образованному антителом и соединением, обладающим нуклеолитической активностью (например, рибонуклеаза или ДНК-эндонуклеаза, такая как дезоксирибонуклеаза; ДНКаза).

Для получения радиоконъюгированных антител против ErbB2 можно использовать разные радиоактивные изотопы. Примеры радиоактивных изотопов включают в себя At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 и радиоактивные изотопы Lu.

Конъюгаты антитела и цитотоксического агента могут быть получены с использованием разных бифункциональных белок-связывающих агентов, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитиол)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат, иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат HCL), активные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бисазидосоединения (такие как бис(п-азидобензоил)гександиамин) производные бисдиазония (такие как бис(п-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, иммунотоксин рицина можно получить методом, описанным в публикации Vitetta et al., Science, 238:1098 (1987). Меченная углеродом-14 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилентриаминопентауксусная кислота (MX-DTPA) является типичным хелатообразователем для конъюгирования радиоактивного изотопа с антителом. См. заявку WO 94/11026. Линкер может быть расщепляемым линкером, облегчающим высвобождение цитотоксического средства в клетке. Например, можно использовать кислотолабильный линкер, пептидазачувствительный линкер, диметиловый линкер или дисульфид-содержащий линкер (Chari et al., Cancer Research, 52:127-131 (1992)).

Альтернативно слитый белок, содержащий антитело против ErbB2 и цитотоксический агент, можно получить методами рекомбинантных ДНК или синтеза пептидов.

В еще одном варианте осуществления изобретения антитело может быть конъюгировано с "рецептором" (таким как стрептавидин) для направленной предоставки в опухоль, в соответствии с которым субъекту вводят конъюгат антитело-рецептор, затем при помощи очищающего агента из кровотока удаляют несвязанный конъюгат и вводят "лиганд" (например, авидин), конъюгированный с цитотоксическим агентом (например, с радиоактивным изотопом).

Антитело-зависимая фермент-опосредованная терапия с использованием пролекарства (ADEPT)

Антитела по настоящему изобретению можно также использовать при лечении методом ADEPT в результате конъюгирования антитела с активирующим пролекарство ферментом, который превращает пролекарство (например, пептидильное химиотерапевтическое средство, см. заявку WO 81/01145) в активное противораковое средство. См., например, заявку WO 88/07378 и патент США № 4975278.

Фермент, входящий в состав иммуноконъюгата, пригодного для лечения методом ADEPT, включает любой фермент, способный воздействовать на пролекарство так, что оно превращается в более активную цитотоксическую форму.

Ферменты, пригодные для использования в способе по настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь ими, щелочную фосфатазу, способную превращать фосфат-содержащие пролекарства в свободные лекарственные средства; арилсульфатазу, способную превращать сульфат-содержащие пролекарства в свободные лекарственные средства; цитозиндиаминазу, способную превращать нетоксичный 5-фторцитозин в противораковое средство - 5-фторурацил; протеазы, такие как протеаза Serratia, термолизин, субтилизин, карбоксипептидазы и катепсины (такие как катепсины В и L), которые способны превращать пептид-содержащие пролекарства в свободные лекарственные средства; D-аланилкарбоксипептидазы, способные превращать пролекарства, содержащие D-аминокислотные заместители; углевод-расщепляющие ферменты, такие как β-галактозидаза и нейраминидаза, способные превращать гликозилированные пролекарства в свободные лекарственные средства; β-лактамазу, способную превращать производные лекарственных средств с β-лактамами в свободные лекарственные средства; и пенициллинамидазы, такие как пенициллин-V-амидаза или пенициллин-G-амидаза, способные превращать производные лекарственных средств по их атомам азота амина с феноксиацетильной или фенилацетильной группами в свободные лекарственные средства. Альтернативно антитела, обладающие ферментативной активностью, известные также в данной области как "абзимы", можно использовать для превращения пролекарств по данному изобретению в свободные активные лекарственные средства (см., например, публикацию Massey, Nature, 328:457-458 (1987)). Конъюгаты антитело-абзим можно получить в соответствии с описанным здесь способом для доставки абзима к популяции опухолевых клеток.

Ферменты по данному изобретению могут быть ковалентно связаны с антителами против ErbB2 методами, известными в данной области, такими как использование вышеописанных гетеробифункциональных перекрестносшивающих реагентов. Альтернативно слитые белки, содержащие по меньшей мере одну антиген-связывающую область антитела по данному изобретению, связанную по меньшей мере с одной функционально активной частью фермента по данному изобретению, можно получить методами рекомбинантных ДНК, хорошо известными в данной области (см., например, публикацию Neuberger et al., Nature, 312: 604-608 (1984).

Другие модификации антител

В объем настоящего изобретения входят другие модификации антител. Например, антитело может быть связано с одним из целого ряда небелковых полимеров, таких как полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, полиоксиалкилены или сополимеры полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля. Данное антитело может быть также или альтернативно связано с одной или несколькими разными частями, такими как флуоресцентная метка, часть с известной электрофоретической подвижностью или часть, способная расщеплять специфическую линкерную молекулу.

Антитело может быть также заключено в микрокапсулы, полученные, например, методами коацервации или межфазной полимеризации (например, гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и полиметилметакрилатные микрокапсулы), в коллоидные системы доставки лекарственных средств (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методы описаны в публикации Remington's Pharmaceutical Sciences, 16^th edition, Oslo, A., Ed., (1980).

Антитела против ErbB2, рассмотренные в данном описании изобретения, могут быть также получены в виде иммунолипосом. Липосомы, содержание антитело, получают методами, известными в данной области, в частности, описанными в публикациях Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); патентах США №№ 4485045 и 4544545 и заявке WO 97/38731, опубликованной 23 октября 1997 г. Липосомы, увеличивающие время циркуляции в крови, описаны в патенте США № 5013556.

Особенно пригодные липосомы можно получить методом выпаривания с обращенной фазой с использованием липидной композиции, содержащей фосфатидилхолин, холестерин и PEG-производное фосфатидилэтаноламина (PEG-PE). Липосомы экструдируют через фильтры с определенным размером пор, в результате чего образуются липосомы требуемого диаметра. Fab'-фрагменты антитела по настоящему изобретению могут быть конъюгированы с указанными липосомами методом, описанным в публикации Martin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982), при помощи реакции замены дисульфидной связи. Указанная липосома может необязательно содержать химиотерапевтическое средство. См. публикацию Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 81(19):1484 (1989).

Векторы, клетки-хозяева и методы рекомбинантных ДНК

Данное изобретение относится также к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей антитела, включая гуманизированные антитела против ErbB2, векторам и клеткам-хозяевам, содержащим указанную нуклеиновую кислоту, и методам рекомбинантных ДНК, служащим для получения указанного антитела.

Для рекомбинантного продуцирования антитела выделяют кодирующую его нуклеиновую кислоту и вводят в реплицируемый вектор для дальнейшего клонирования (амплификации ДНК) или экспрессии. ДНК, кодирующую моноклональное антитело, можно легко выделить и секвенировать известными методами (например, при помощи олигонуклеотидных зондов, способных специфически связываться с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи антитела). Существует много векторов. Вектор обычно включает, не ограничиваясь ими, один или несколько нижеследующих компонентов: сигнальную последовательность, ориджин репликации, один или несколько маркерных генов, энхансер, промотор и последовательность, терминирующую транскрипцию.

Сигнальная последовательность

Антитела против ErbB2 можно получить методами рекомбинантных ДНК не только прямым путем, но также в виде полипептидов, слитых с гетерологичным полипептидом, который предпочтительно является сигнальной последовательностью или другим полипептидом, имеющим специфический сайт расщепления у N-конца зрелого белка или полипептида. Выбранная гетерологичная сигнальная последовательность предпочтительно является такой последовательностью, которую узнает и процессирует (то есть расщепляет сигнальная пептидаза) клетка-хозяин. Для прокариотических клеток-хозяев, которые не узнают и не процессируют нативную сигнальную последовательность антитела против ErbB2, указанную сигнальную последовательность заменяют прокариотической сигнальной последовательностью, выбираемой, например, из группы, включающей щелочную фосфатазу, пенициллиназу, lpp или лидерные последовательности термостабилизированного энтеротоксина II. Для секреции в дрожжах нативная сигнальная последовательность может быть заменена, например, лидерной последовательностью дрожжевой инвертазы, лидерной последовательностью α-фактора (включая лидерные последовательности α-фактора Saccharomyces и Kluyveromyces) или лидерной последовательностью кислой фосфатазы, лидерной последовательностью глюкоамилазы C. albicans или сигнальной последовательностью, описанной в заявке WO 90/13646. Для экспрессии в клетках млекопитающих используют сигнальные последовательности млекопитающих, а также сигнальные последовательности, секретируемые вирусами, например сигнальную последовательность вируса простого герпеса gD.

ДНК для такой предковой области лигируют в рамке считывания с ДНК, кодирующей антитело против ErbB2.

Ориджин репликации

Как экспрессирующие, так и клонирующие векторы содержат последовательность нуклеиновой кислоты, которая позволяет вектору реплицировать в одной или нескольких выбранных клетках-хозяевах. В клонирующих векторах указанная последовательность обычно является последовательностью, которая позволяет вектору реплицировать независимо от хромосомной ДНК хозяина и включает ориджины репликации, или автономно реплицирующие последовательности. Такие последовательности хорошо известны для ряда бактерий, дрожжей и вирусов. Ориджин репликации из плазмиды pBR322 пригоден для большинства грамотрицательных бактерий, плазмидный ориджин 2 μ пригоден для дрожжей, и разные вирусные ориджины (SV40, полиома, аденовирус, VSV или BPV) пригодны для клонирующих векторов в клетках млекопитающих. Ориджин репликации обычно не нужен для экспрессирующих векторов млекопитающих (ориджин SV40 обычно используют только потому, что он содержит ранний промотор).

Ген селекции

Экспрессирующие и клонирующие векторы могут содержать ген селекции, именуемый также селектируемым маркером. Типичные гены селекции кодируют белки, которые (а) сообщают устойчивость к антибиотикам и другим токсинам, таким как ампициллин, неомицин, метотрексат или тетрациклин, (b) определяют ауксотрофную недостаточность комплемента или (с) обеспечивают доставку важных питательных веществ, отсутствующих в комплексных средах, например ген, кодирующий D-аланинрацемазу для Bacilli.

Одним примером схемы селекции является использование лекарственного средства для подавления роста клетки-хозяина. Клетки, успешно трансформированные гетерологичным геном, продуцируют белок, сообщающий лекарственную устойчивость, и поэтому выживают в режиме селекции. В примерах такой доминантной селекции используют такие лекарственные средства, как неомицин, микофенольная кислота и гигромицин.

Другим примером приемлемых селектируемых маркеров для клеток млекопитающих являются такие маркеры, которые позволяют идентифицировать компетентные клетки, поглощающие нуклеиновую кислоту антитела против ErbB2, такую как DHFR, тимидинкиназа, металлотионеин-I и -II, предпочтительно гены металлотионеина приматов, аденозиндеаминаза, орнитиндекарбоксилаза и т.д.

Например, клетки, трансформированные геном селекции DHFR, сначала идентифицируют, культивируя все трансформанты в культуральной среде, содержащей метотрексат (Mtx), конкурентный антагонист DHFR. Соответствующая клетка-хозяин при использовании DHFR дикого типа представляет собой линию клеток яичника китайского хомячка (СНО), лишенную активности DHFR.

Альтернативно клетки-хозяева (в частности, клетки-хозяева дикого типа, содержащие эндогенный DHFR), трансформированные или котрансформированные последовательностями ДНК, кодирующими антитело против ErbB2, белком DHFR дикого типа или другим селектируемым маркером, таким как аминогликозид-3'-фосфотрансфераза (АРН), могут быть отобраны путем выращивания клеток в среде, содержащей агент селекции для селектируемого маркера, такой как аминогликозидный антибиотик, например канамицин, неомицин или G418. См. патент США № 4965199.

Геном селекции, пригодным для использования в дрожжах, является ген trp1, присутствующий в дрожжевой плазмиде YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)). Ген trp1 создает селектируемый маркер для мутантного штамма дрожжей с отсутствием способности расти в триптофане, например АТСС № 44076 или РЕР4-1. Публикация Jones, Genetics, 85:12 (1977). Повреждение trp1 в геноме дрожжевой клетки-хозяина создает эффективную среду для обнаружения трансформации при выращивании в отсутствие триптофана. Аналогичным образом дрожжевые штаммы с отсутствием Leu2 (АТСС 20622 или 38626) дополняют известными плазмидами, несущими ген Leu2.

Кроме того, векторы, выделенные из кольцевой плазмиды pKD1 в 1,6 мкм, можно использовать для трансформации дрожжей Kluyveromyces. Альтернативно в научной литературе описана экспрессирующая система для K. lactis, предназначенная для крупномасштабного продуцирования рекомбинантного телячьего химозина. Публикация Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990). В научной литературе описаны также устойчивые многокопийные экспрессирующие векторы для секреции зрелого рекомбинантного сывороточного альбумина человека с использованием промышленных штаммов Kluyveromyces. Публикация Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991).

Промотор

Экспрессирующие и клонирующие векторы обычно содержат промотор, узнаваемый организмом-хозяином и функционально связанный с нуклеиновой кислотой антитела против ErbB2. Промоторы, пригодные для использования с прокариотическими хозяевами, включают в себя промотор phoA, β-лактамазу и лактозные промоторные системы, щелочную фосфатазу, триптофановую (trp) промоторную систему и гибридные промоторы, такие как промотор tac. Однако можно использовать другие известные бактериальные промоторы. Промоторы, предназначенные для использования в бактериальных системах, содержат также последовательность Шайна-Дальгарно (S.D.), функционально связанную с ДНК, кодирующей антитело против ErbB2.

Известны промоторные последовательности для эукариотических клеток. Фактически все эукариотические гены имеют область с высоким содержанием АТ, расположенную на расстоянии примерно 25-30 оснований вверху от сайта инициации транскрипции. Другая последовательность, обнаруженная на расстоянии 70-80 оснований вверху от начала транскрипции многих генов, представляет собой область CNCAAT, где N может быть любым нуклеотидом. У 3'-конца большинства эукариотических генов находится последовательность ААТААА, которая может быть сигналом к добавлению поли А концевого сегмента к 3'-концу кодирующей последовательности. Все указанные последовательности вводят в эукариотические экспрессирующие векторы.

Примеры приемлемых промоторных последовательностей, предназначенных для использования в дрожжевых клетках-хозяевах, включают в себя промоторы для 3-фосфоглицераткиназы или других гликолитических ферментов, таких как энолаза, глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа, гексокиназа, пируват-декарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкозо-6-фосфат-изомераза, 3-фосфоглицерат-мутаза, пируваткиназа, триосефосфат-изомераза, фосфоглюкозо-изомераза и глюкокиназа.

Другие дрожжевые промоторы, которые являются индуцируемыми промоторами, дополнительным преимуществом которых является контроль транскрипции в условиях выращивания, представляют собой промоторные области для спиртовой дегидрогеназы 2, изоцитохрома С, кислой фосфатазы, вырожденных ферментов, участвующих с азотном обмене, металлотионеина, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и ферментов, ответственных за потребление мальтозы и галактозы. Приемлемые векторы и промоторы для экспрессии в дрожжах далее описаны в европейском патенте № 73657. Дрожжевые энхансеры можно успешно использовать с дрожжевыми промоторами.

Транскрипцию антитела против ErbB2 из векторов в клетках-хозяевах млекопитающих контролируют, например, промоторами, полученными из геномов вирусов, таких как вирус полиомы, вирус оспы птиц, аденовирус (такой как аденовирус 2), вирус папилломы крупного рогатого скота, вирус саркомы птиц, цитомегаловирус, ретровирус, вирус гепатита В и наиболее предпочтительно вакуолизирующий обезьяний вирус 40 (ОВ-40), из гетерологичных промоторов млекопитающих, таких как эффекторный промотор или иммуноглобулиновый промотор, из промоторов теплового шока, при условии, что такие промоторы совместимы с системами клеток-хозяев.

Ранние и поздние промоторы вируса ОВ-40 обычно получают в виде рестрикционного фрагмента ОВ-40, который содержит также ориджин репликации вируса ОВ-40. Предранний промотор цитомегаловируса человека обычно получают в виде рестрикционного фрагмента HindIII E. Система для экспрессии ДНК в клетках-хозяевах млекопитающих с использованием в качестве вектора вируса папилломы крупного рогатого скота описана в патенте США № 4419446. Модификация указанной системы описана в патенте США № 4601978. См. также публикацию Reyes et al., Nature, 297:598-601 (1982), в которой описана экспрессия кДНК β-интерферона человека в клетках мыши под контролем промотора тимидинкиназы, полученного из вируса простого герпеса. Альтернативно в качестве промотора можно использовать длинный концевой повтор вируса саркомы Рауса.

Энхансер

Транскрипцию ДНК, кодирующей антитело против ErbB2 по данному изобретению, высшими эукариотами часто можно усилить введением в вектор энхансерной последовательности. В настоящее время известно много энхансерных последовательностей, выделяемых из генов млекопитающих (глобин, этастаза, альбумин, α-фетопротеин и инсулин). Однако обычно используют энхансер из вируса эукариотических клеток. Такие примеры включают в себя энхансер вируса ОВ-40 в поздней области ориджина репликации (100-270 п.о.), энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер вируса полиомы в поздней области ориджина репликации и энхансеры аденовируса. См. также публикацию Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982), в которой описаны энхансерные элементы, предназначенные для активации эукариотических промоторов. Энхансер может быть сплайсирован в вектор в положении от 5'- или 3'-конца до кодирующей последовательности антитела против ErbB2, но предпочтительно энхансер размещают на 5'-концевой сайте в направлении от промотора.

Терминирующий транскрипцию компонент

Экспрессирующие векторы, используемые в эукариотических клетках-хозяевах (клетки дрожжей, грибов, насекомых, растений, животных и человека или содержащие ядро клетки других многоклеточных организмов), содержат также последовательности, необходимые для терминации транскрипции и стабилизации мРНК. Такие последовательности обычно находятся в 5'-концевых и иногда в 3'-концевых нетранслированных областях эукариотических или вирусных ДНК или кДНК. Указанные области содержат нуклеотидные сегменты, транскрибированные в виде полиаденилированных фрагментов в нетранслированной части мРНК, кодирующей антитело против ErbB2. Одним пригодным терминирующим транскрипцию компонентом является область полиаденилирования гормона роста крупного рогатого скота. См. заявку WO 94/11026 и приведенные в ней экспрессирующие векторы.

Селекция и трансформация клеток-хозяев

Приемлемые клетки-хозяева для клонирования или экспрессии ДНК в векторах по настоящему изобретению являются описанными выше прокариотическими, дрожжевыми или высшими эукариотическими клетками. Приемлемые прокариотические клетки, пригодные для указанной цели, включают в себя эубактерии, такие как грамотрицательные или грамположительные микроорганизмы, например, Enterobacteriaceae, такие как Escherichia, например E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, в частности Salmonella typhimurium, Serratia, в частности Serratia marcescans, и Shigella, а также Bacilli, такие как B. subtilis и B. licheniformis (например, B. licheniformis 41P, рассмотренные в DD 266710, опубликованном 12 апреля 1989 г.), Pseudomonas, такие как P. aeruginosa, и Streptomyces. Одним предпочтительным клонирующим хозяином E. coli является E. coli 294 (АТСС 31446), хотя другие штаммы, такие как E. coli B, E. coli X1776 (АТСС 31537) и E. coli W3110 (АТСС 27325), также являются приемлемыми. Приведенные примеры являются иллюстративными и не ограничивают объем настоящего изобретения.

Помимо прокариотов, приемлемыми хозяевами для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих антитело против ErbB2, являются эукариотические микроорганизмы, такие как нитевидные грибы или дрожжи. Saccharomyces cerevisiae или обычные хлебопекарные дрожжи являются наиболее часто используемыми хозяевами среди низших эукариотических микроорганизмов-хозяев. Однако существует целый ряд других родов, видов и штаммов, пригодных для использования в данном изобретении, таких как Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces, такие как K. lactis, K. fragilis (АТСС 12424), K. bulgaricus (АТСС 16045), K. wickeramii (ATCC 24178), K. waltii (ATCC 56500), K. drosophilarum (ATCC 36906), K. thermotolerans и K. marxianus; yarrowia (европейский патент № 402226); Pichia pastoris (европейский патент № 183070); Candida; Trichoderma reesia (европейский патент № 244234); Neurospora crassa; Schwanniomyces, такие как Schwanniomyces occidentalis; и нитевидные грибы, такие как, например, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium и Aspergillus, в частности A. nudilans и A. niger.

Приемлемые клетки-хозяева для экспрессии гликозилированного антитела против ErbB2 получают из многоклеточных организмов. Примеры клеток беспозвоночных включают в себя клетки растений и насекомых. Идентифицированы многочисленные бакуловирусные штаммы, варианты и соответствующие приемлемые клетки-хозяева насекомых, такие как Spodoptera frugiperda (гусеница), Aedes aegypti (комар), Aedes albopictus (комар), Drosophila melanogaster (дрозофила) и Bombyx mori. В научной литературе описаны разные вирусные штаммы, предназначенные для трансфекции, например вариант L-1 Autographa californica NPV и штамм Bm-5 Bombyx mori NPV, и такие вирусы можно использовать в качестве вышеописанных вирусов по настоящему изобретению, в частности, для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda.

Культуры растительных клеток, такие как хлопок, кукуруза, картофель, соя, петуния, томат и табак, можно также использовать в качестве хозяев.

Однако наибольший интерес представляют клетки позвоночных, поэтому наиболее распространенным методом является размножение клеток позвоночных в культуре (культуре ткани). Примерами приемлемых линий клеток-хозяев млекопитающих являются линия клеток CV1 почки обезьяны, трансформированная вирусом ОВ-40 (COS-7, ATCC CRL 1651); линия эмбриональных клеток почки человека (клетки 293 или клетки 293, субклонированные для выращивания в суспензионной культуре, публикация Graham et al., J. Gen. Virol., 36:59 (1977)); клетки почки детеныша хомячка (ВНК, АТСС CCL 10); клетки яичника китайского хомячка/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); клетки Сертоли мышей (ТМ4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); клетки почки обезьяны (CV1 ATCC CCL 70); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76, ATCC CRL-1587); клетки карциномы шейки матки человека (HELA, ATCC CCL 2); клетки почки собаки (MDCK, ATCC CCL 34); клетки печени крысы (BRL 3A, ATCC CRL 1442); клетки легкого человека (W138, ATCC CCL 75); клетки печени человека (Hep G2, HB 8065); опухолевые клетки молочной железы мышей (ММТ 060562, АТСС CCL51); клетки TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); клетки MRC 5; клетки FS4 и линия клеток гепатомы человека (Hep G2).

Клетки-хозяева трансформируют вышеописанными экспрессирующими или клонирующими векторами для продуцирования антитела против ErbB2 и культивируют в обычных питательных средах, модифицированных соответствующим образом для индукции промоторов, селекции трансформантов или амплификации генов, кодирующих требуемые последовательности.

Культивирование клеток-хозяев

Клетки-хозяева, используемые для продуцирования антитела против ErbB2 по данному изобретению, можно культивировать в разных средах. Для культивирования клеток-хозяев пригодны коммерчески доступные среды, такие как среда F10 Гама (Sigma), минимальная поддерживающая среда (МЕМ) (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) и модифицированная по способу Дульбекко среда Игла ((DMEM), Sigma). Кроме того, в качестве культуральных сред для клеток-хозяев можно использовать любые среды, описанные в публикациях Ham et al., Meth. Enz., 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem., 102:255 (1980), патентах США №№ 4767704, 4657866, 4927762, 4560655 или 5122469; заявках WO 90/03430, WO 87/00195 или заменяющем патенте США № 30985. В любые указанные среды могут быть при необходимости введены гормоны и/или другие факторы роста (такие как инсулин, трансферрин или эпидермальный фактор роста), соли (такие как хлорид натрия, кальций, магний и фосфат), буферы (такие как HEPES), нуклеотиды (такие как аденозин и тимидин), антибиотики (такие как препарат GENTAMYCIN®), микроэлементы (определяемые как неорганические соединения, обычно присутствующие в микромолярных конечных концентрациях) и глюкоза или эквивалентный источник энергии. В указанные среды могут быть также введены любые другие необходимые добавки в соответствующих концентрациях, которые должны быть известны специалистам в данной области. Условия культивирования, в частности температура, рН и тому подобные, аналогичны ранее используемым для экспрессии отобранных клеток-хозяев и должны быть известны специалистам в данной области.

Очистка антитела против ErbB2

При использовании методов рекомбинантных ДНК антитела могут быть продуцированы внутриклеточно, в периплазматическом пространстве или секретированы непосредственно в среду. Если антитело продуцировано внутриклеточно, на первой стадии удаляют дебрис, относящийся к клеткам-хозяевам или лизированным фрагментам, например, центрифугированием или ультрафильтрацией. В публикации Carter et al., Bio/Technology, 10:163-167 (1992) описан способ выделения антител, секретированных в периплазматическое пространство E. coli. Клеточную пасту оттаивают в присутствии ацетата натрия (рН 3,5), EDTA и фенилметилсульфонилфторида (PMSF) в течение примерно 30 минут. Клеточный дебрис можно удалить центрифугированием. Если антитело секретировано в среду, супернатанты таких экспрессирующих систем сначала концентрируют, используя коммерчески доступный фильтр для концентрирования белка, например устройство для ультрафильтрации компании Amicon или Millipore Pellicon. На любой из вышеуказанных стадий может быть использован ингибитор протеазы, такой как PMSF, для подавления протеолиза и введены антибиотики для предотвращения роста случайных загрязняющих микроорганизмов.

Антитело, полученное из клеток, может быть очищено при помощи хроматографии с использованием гидроксилапатита, гель-электрофореза, диализа и аффинной хроматографии, причем аффинная хроматография является предпочтительным методом очистки. Пригодность белка А в качестве аффинного лиганда зависит от вида и изотипа любого Fc-домена иммуноглобулина, присутствующего в антителе. Белок А можно использовать для очистки антител, имеющих тяжелые цепи γ1, γ2 или γ4 человека (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). Белок G рекомендован для всех изотипов мыши и γ3 человека (Guss et al., EMBO J., 5:1567-1575 (1986)). Матрица, к которой присоединяют аффинный лиганд, чаще всего является агарозой, но существуют и другие матрицы. Механически устойчивые матрицы, такие как стекло с определенным размером пор или полистиролдивинилбензол, позволяют увеличить скорости потока и сократить время обработки по сравнению с использованием агарозы. Если антитело содержит СН3-область, для очистки используют смолу Bakerbond ABX™ (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ). В зависимости от выделяемого антитела можно использовать также другие методы очистки белка, такие как фракционирование на ионообменной колонке, осаждение этанолом, ВЭЖХ с обращенной фазой, хроматография на силикагеле, хроматография на гепарине SEPHAROSE™, хроматография на анионо- или катионообменной смоле (в частности, на колонке с полиаспарагиновой кислотой), хроматофокусирование, SDS-PAGE и осаждение сульфатом аммония.

После выполнения одной или нескольких стадий предварительной очистки смесь, содержащую представляющее интерес антитело и загрязняющие примеси, можно подвергнуть очистке при помощи гидрофобной хроматографии с низким показателем рН, используя элюирующий буфер при рН около 2,5-4,5, которую предпочтительно выполняют при низких концентрациях соли (например, около 0-0,25 М соли).

Фармацевтические препараты

Лекарственные препараты, содержащие антитела, используемые в соответствии с настоящим изобретением, получают с возможностью хранения, смешивая антитело, обладающее требуемой степенью чистоты, с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, наполнителями или стабилизаторами (Remingron's Pharmaceutical Sciences 16^th edition, Osol, A. Ed. (1980)), в форме лиофилизованных препаратов или водных растворов. Приемлемые носители, наполнители или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях и включают в себя буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включающие в себя аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония, хлорид гексаметония, хлорид бензалкония, хлорид бензетония; феноловый, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол и м-крезол); низкомолекулярные (менее примерно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включающие в себя глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как EDTA; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, Zn-белковые комплексы); и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (PEG). Предпочтительные лиофилизованные препараты, содержащие антитело против ErbB2, описаны в заявке WO 97/04801, которая включена в данное описание изобретения в качестве ссылки.

Препарат по данному изобретению может также содержать несколько активных соединений, необходимых для лечения определенного заболевания, предпочтительно соединений, обладающих комплементарным действием и не оказывающих вредного влияния друг на друга. Например, в один препарат может быть желательно ввести антитела, связывающиеся с EGFR, ErbB2 (например, антитело, которое связывается с другим эпитопом рецептора ErbB2), ErbB3, ErbB4, или эндотелиальный фактор роста сосудов (VEGF). Альтернативно или дополнительно данная композиция может далее включать химиотерапевтическое средство, цитотоксический агент, цитокин, ингибирующий рост агент, антигормональный агент, лекарственное средство, направленно доставляемое к EGFR, антиангиогенное средство и/или кардиозащитное средство. Такие молекулы могут присутствовать в комбинации в количествах, которые являются эффективными для достижения данной цели.

Активные ингредиенты могут быть также заключены в микрокапсулы, полученные, например, методами коацервации или межфазной полимеризации, в гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и полиметилметакрилатные микрокапсулы, в коллоидные системы доставки лекарственных средств (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэсмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методы описаны в публикации Remington's Pharmaceutical Sciences, 16^th edition, Oslo, A., Ed., (1980).

Можно получить препараты пролонгированного действия. Приемлемые примеры препаратов пролонгированного действия включают в себя полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитело, которые имеют форму формованных частиц, таких как пленки или микрокапсулы. Примеры матриц с пролонгированным высвобождением лекарственного средства включают в себя сложные полиэфиры, гидрогели (например, поли-2-гидроксиэтилметакрилат или поливиниловый спирт), полиактиды (патент США № 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и γ-этил-L-глутамата, не разлагающийся этиленвинилацетат, разлагающиеся сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, такие как LUPRON DEPOT™ (инъецируемые микросферы, состоящие из сополимера молочной кислоты и гликолевой кислоты и ацетата лейпролида) и поли-D-(-)-3-гидроксимасляную кислоту.

Препараты, используемые для введения in vivo, должны быть стерильными. Указанная цель легко достигается фильтрацией через стерильные фильтрующие мембраны.

Лечение антителами против ErbB2

Предполагается, что антитела против ErbB2 по настоящему изобретению могут быть использованы для лечения разных заболеваний или нарушений. Типичные состояния или нарушения включают в себя доброкачественные или злокачественные опухоли; лейкозы и лимфоидные злокачественные новообразования; другие нарушения, в частности, нарушения, относящиеся к нейронам, глиальным клеткам, астроцитам, гипоталамусу, железистым клеткам, макрофагам, эпителиальным клеткам, стромальным клеткам, бластоцитам, а также воспалительные, ангиогенные и иммунологические нарушения. Антитела против ErbB2 предпочтительно используют для лечения опухолей, чувствительных к воздействию таких антител, методами, рассмотренными в данном описании изобретения.

Подлежащим лечению заболеванием или нарушением обычно является рак. Примеры такого рака включают в себя, не ограничиваясь ими, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз или лимфоидные злокачественные новообразования. Более конкретные примеры такого рака включают в себя плоскоклеточный рак (например, эпителиальный плоскоклеточный рак), рак легкого, включающий в себя мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого и плоскоклеточный рак легкого, рак брюшной полости, печеночно-клеточный рак, рак желудка, включающий рак желудочно-кишечного тракта, рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы, рак ободочной кишки, рак прямой кишки, рак прямой и ободочной кишки, карциному эндометрия или матки, карциному слюнной железы, рак почки, рак предстательной железы, рак наружных женских половых органов, рак щитовидной железы, карциному печени, карциному заднего прохода, карциному полового члена, а также рак головы и шеи. Подлежащая лечению раковая опухоль должна быть восприимчива к лечению антителами против ErbB2 на основании идентификации гетеродимеров HER2/HER3 и/или НER2/HER1 или фосфорилирования рецептора ErbB в образце опухоли. Определенную группу раковых опухолей, в которых может быть обнаружено образование гетеродимеров HER2/HER3 и/или НER2/HER1 и/или фосфорилирование рецептора ErbB, составляют, не ограничиваясь ими, рак молочной железы, рак легкого, рак яичника, включая прогрессирующую, не поддающуюся лечению или рецидивирующую форму рака яичника, рак предстательной железы, рак прямой и ободочной кишки и рак поджелудочной железы.

Раковая опухоль обычно содержит ErbB2-экспрессирующие клетки, благодаря которым антитело против ErbB2 может связываться с раковой опухолью. Хотя раковая опухоль может характеризоваться сверхэкспрессией рецептора ErbB2, настоящее изобретение далее относится к способу лечения рака, который не считается раковой опухолью, сверхэкспрессирующей ErbB2. Определить экспрессию ErbB2 в раковой опухоли можно при помощи разных диагностических/прогностических анализов. В одном варианте осуществления изобретения сверхэкспрессию ErbB2 можно определить методом IHC, например, при помощи HERCEPTEST® (Dako). Залитые парафином срезы ткани, полученные в результате биопсии опухоли, анализируют методом IHC и оценивают полученные результаты по интенсивности окрашивания белка ErbB2 следующим образом:

Оценка 0

окрашивание отсутствует или окрашивание мембраны составляет менее 10% опухолевых клеток.

Оценка 1+

слабое/едва уловимое окрашивание мембраны обнаружено у более чем 10% опухолевых клеток. В клетках окрашена только часть мембраны.

Оценка 2+

слабое/среднее полное окрашивание мембраны наблюдается у более чем 10% опухолевых клеток.

Оценка 3+

среднее/сильное полное окрашивание мембраны наблюдается у более чем 10% опухолевых клеток.

Опухоли, получившие оценки 0 или 1+, определяющие сверхэкспрессию ErbB2, можно считать опухолями, не сверхэкспрессирующими ErbB2, в то время как опухоли, получившие оценки 2+ или 3+, можно считать опухолями, сверхэкспрессирующими ErbB2.

Альтернативно или дополнительно могут быть выполнены анализы методом FISH, такие как INFORM™ (Ventana, Arizona) или PATHVISION™ (Vysis, Illinois), с использованием фиксированной в формалине или залитой парафином опухолевой ткани для определения степени сверхэкспрессии ErbB2 (если таковая имеется) в опухоли.

В одном варианте осуществления изобретения рак может представлять собой раковую опухоль, которая экспрессирует (и может, но не сверхэкспрессирует) EGFR. Примеры раковых опухолей, которые могут экспрессировать/сверхэкспрессировать EGFR, включают в себя плоскоклеточный рак (например, эпителиальный плоскоклеточный рак), рак легкого, включая мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), аденокарциному легкого и плоскоклеточную карциному легкого, рак брюшной полости, печеночно-клеточный рак, рак желудка, включая рак желудочно-кишечного тракта, рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы, рак ободочной кишки, рак прямой кишки, рак прямой и ободочной кишки, карциному эндометрия или матки, карциному слюнной железы, рак почка, рак предстательной железы, рак наружных женских половых органов, рак щитовидной железы, карциному печени, карциному заднего прохода, карциному полового члена, а также рак головы и шеи.

Настоящее изобретение особенно пригодно для идентификации у нуждающихся субъектов рака молочной железы, рака предстательной железы, в частности рака, не поддающегося лечению путем удаления предстательной железы (CRPC), и рака яичника, которые, по-видимому, восприимчивы к лечению антителом против HER2, блокирующим активацию лигандами гетеродимера ErbB, содержащего HER2, таким как моноклональное антитело 2С4 или rhuMAb 2C4.

Рак, подлежащий лечению по настоящему изобретению, может характеризоваться избыточной активацией рецептора ErbB, например EGFR. Такая избыточная активация может быть обусловлена сверхэкспрессией или повышенным продуцированием рецептора ErbB или лиганда ErbB. В одном варианте осуществления изобретения выполняют диагностический или прогностический анализ для выявления у субъекта, страдающего раком, избыточной активации рецептора ErbB. Например, можно определить амплификацию гена ErbB и/или сверхэкспрессию рецептора ErbB в раковой опухоли. В данной области существуют разные анализы для определения такой амплификации/сверхэкспрессии, которые включают в себя вышеописанные анализы IHC, FIHS и анализы "слущивающегося" антигена. Альтернативно или дополнительно известными методами можно определить уровни лиганда ErbB, такого как TGF-α, в опухоли или связанного с опухолью. Такие анализы позволяют обнаружить белок и/или нуклеиновую кислоту, кодирующую данный белок, в анализируемом образце. В одном варианте осуществления изобретения уровни лиганды ErbB в опухоли можно определить иммуногистохимическим методом (IHC); см., например, публикацию Scher et al., Clin. Cancer Research, 1:545-550 (1995). Альтернативно или дополнительно можно определить уровни нуклеиновой кислоты, кодирующей лиганд ErbB, в анализируемом образце; например, методами FISH, саузерн-блоттинга или PCR.

Кроме того, сверхэкспрессию или амплификацию рецептора ErbB или лиганда ErbB можно определить при помощи диагностического анализа in vivo, например, путем введения молекулы (такой как антитело), меченной детектируемой меткой (например, радиоактивным изотопом), которая связывается с молекулой, подлежащей обнаружению, после чего субъекта обследуют с целью локализации данной метки.

Если подлежащий лечению рак является гормон-независимым раком, экспрессию гормона (например, андрогена) и/или его родственного рецептора в опухоли можно определить при помощи любых известных анализов, например, описанных выше. Альтернативно или дополнительно у субъекта может быть диагностирован гормон-независимый рак, если указанный субъект больше не реагирует на лечение антиандрогенными средствами.

В некоторых вариантах осуществления изобретения субъекту вводят иммуноконъюгат, содержащий антитело против ErbB2, конъюгированное с цитотоксическим агентом. Иммуноконъюгат и/или белок ErbB2, с которым связан данный иммуноконъюгат, интернализируется клеткой, в результате чего повышается терапевтическая эффективность иммуноконъюгата в отношении уничтожения раковой клетки, с которой он связывается. В предпочтительном варианте осуществления изобретения цитотоксические агент направленно воздействует или подавляет нуклеиновую кислоту в раковой клетке. Примеры таких цитотоксических агентов включают в себя майтансиноиды, калихеамицины, рибонуклеазы и ДНК-эндонуклеазы.

В конкретном варианте осуществления изобретения вводимым антителом является антитело rhuMAb 2C4 или его функционально активный эквивалент. RhuMAb 2C4 является гуманизированным моноклональным антителом, созданным на основе остовных последовательностей IgG1 человека, которое содержит две тяжелые цепи (449 остатков) и две легкие цепи (214 остатков). Антитело rhuMAb 2V4 существенно отличается от другого антитела против HER2 препарата HERCEPTIN® (Trastuzumab) в эпитоп-связывающих областях легкой и тяжелой цепей. В результате этого антитело rhuMAb 2C4 связывается с совершенно другим эпитопом рецептора HER2. Настоящее изобретение относится к чувствительным методам идентификации раковых опухолей, восприимчивых к лечению антителом rhuMAb 2С4 или его функционально активными эквивалентами. Следует отметить, что раковые опухоли, восприимчивые к лечению антителом rhuMAb 2C4, необязательно должны сверхэкспрессировать HER2.

Антитела против ErbB2 или иммуноконъюгаты вводят нуждающемуся субъекту, являющемуся человеком, известными методами, такими как внутривенное введение, например, в виде болюса, или непрерывное вливание в течение определенного периода времени, внутримышечное, внутрибрюшинное, интрацереброспинальное, подкожное, интраартикулярное, внутрисуставное, подоболочечное, пероральное, местное введение или ингаляция. Внутривенное или подкожное введение антитела является предпочтительным.

Введение антитела против ErbB2 может быть объединено с другими схемами лечения. Комбинированное введение включает совместное введение с использованием раздельных препаратов или одного фармацевтического препарата и последовательное введение в любом порядке, причем в том случае, если оба (или все) активные средства одновременно оказывают свое биологическое действие, желательно их вводить через определенный промежуток времени.

В одном конкретном варианте осуществления изобретения нуждающегося субъекта лечат двумя разными антителами против ErbB2. Например, субъекта можно легчить первым антителом против ErbB2, блокирующим активацию лигандом рецептора ErbB, или антителом, обладающим биологическими характеристиками моноклонального антитела 2С4, а также вторым антителом против ErbB2, которое является ингибирующим рост антителом (например, HERCEPTIN®) или антителом против ErbB2, которое вызывает апоптоз сверхэкспрессирующей ErbB2 клетки (например, 7С2, 7F3 или их гуманизированные варианты). Такая комбинированная терапия предпочтительно оказывает синергическое лечебное действие. Например, нуждающегося субъекта можно сначала подвергнуть лечению препаратом HERCEPTIN® и затем антителом rhuMAb 2C4, если данный субъект не реагирует на лечение препаратом HERCEPTIN®. В другом варианте осуществления изобретения нуждающегося субъекта можно сначала подвергнуть лечению антителом rhuMAb 2C4 и затем проводить лечение препаратом HERCEPTIN®. В другом варианте осуществления изобретения нуждающийся субъект может быть одновременно подвергнут лечению антителом rhuMAb 2С4 и препаратом HERCEPTIN®.

Кроме того, может быть желательно объединить введение одного или нескольких антител против ErbB2 с введением антитела, направленного против другого опухолеспецифического антигена. Другое антитело в данном случае может, например, связываться с EGFR, ErbB3, ErbB4 или эндотелиальным фактором роста сосудов (VEGF).

В одном варианте осуществления изобретения лечение по настоящему изобретению включает комбинированное введение антитела (или антител) против ErbB2 и одного или нескольких химиотерапевтических средств или ингибирующих рост агентов, включая совместное введение коктейлей, содержащих разные химиотерапевтические средства. Предпочтительные химиотерапевтические средства включают в себя таксаны (такие как паклитаксель и доцетаксель) и/или антрациклиновые антибиотики. Схемы приготовления и применения таких химиотерапевтических средств могут быть выбраны в соответствии с инструкциями изготовителей или эмпирически определены квалифицированным специалистом. Схемы приготовления и применения лекарственных средств для химиотерапии описаны также в публикации Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992).

Антитело может быть объединено с антигормональным соединением, например с антиэстрогенным соединением, таким как тамоксифен, антипрогестероном, таким как онапристон (см. европейский патент № 616812), или антиандрогеном, таким как флутамид, и использовано в дозах, известных для таких молекул. Если подлежащий лечению рак представляет собой гормон-зависимую раковую опухоль, субъект может быть сначала подвергнут антигормональной терапии, и после того как рак станет гормон-независимым, субъекту может быть введено антитело против ErbB2 (и необязательно другие лекарственные средства, рассмотренные в данном описании изобретения).

Иногда может быть желательно одновременно вводить субъекту кардиозащитное средство (для предотвращения или уменьшения нарушения функции миокарда, вызываемого таким лечением) либо один или несколько цитокинов. Кроме того, можно одновременно вводить средство, направленно доставляемое к EGFR, или антиангиогенное средство. Помимо вышеуказанных схем лечения, субъект может быть подвергнут хирургическому удалению раковых клеток и/или лучевой терапии.

Антитела против ErbB2 могут быть также объединены с лекарственным средством, направленно доставляемым к EGFR, аналогичным описанным в разделе "Определение терминов", в результате чего достигается комплементарное и потенциально синергическое терапевтическое действие.

Примеры дополнительных лекарственных средств, которые могут быть объединены с антителом, включают в себя химиотерапевтические средства, такие как карбоплатин, таксан (например, паклитаксель или доцетаксель), гемцитабин, навелбин, цисплатин, оксалиплатин, или комбинации указанных средств, такие как карбоплатин/доцетаксель; другое антитело против HER2 (например, ингибирующее рост антитело против HER2, такое как HERCEPTIN®, или антитело против HER2, вызывающее апоптоз, такое как 7С2 или 7F3, включая их гуманизированные варианты или варианты с созревшей аффинностью); ингибитор фарнезилтрансферазы; антиангиогенное средство (например, антитело против VEGF); лекарственное средство, направленно доставляемое к EGFR (например, С225 или ZD1839); цитокин (например, IL-2, IL-12, G-CSF или GM-CSF); или комбинации вышеуказанных средств.

Приемлемые дозы для любых вышеуказанных совместно вводимых средств могут быть аналогичны применяемым в настоящее время и могут быть уменьшены благодаря объединенному (синергическому) действию данного лекарственного средства и антитела против ErbB2.

Соответствующая доза антитела для профилактики или лечения заболевания зависит от типа и тяжести подлежащего лечению заболевания, течения заболевания, использования антитела для профилактических или лечебных целей, ранее проводившейся терапии, истории болезни и чувствительности к антителу, а также решения лечащего врача. Антитело предпочтительно вводят субъекту однократно или на протяжении ряда процедур. В зависимости от типа и тяжести заболевания предполагаемая начальная доза, вводимая субъекту, составляет примерно от 1 мкг/кг до 15 мг/кг (например, 0,1-20 мг/кг), которую вводят однократно, в виде нескольких раздельных доз или непрерывного вливания. Обычная суточная доза может составлять от около 1 мкг/кг до 100 мг/кг или больше в зависимости от вышеуказанных факторов. В случае повторного введения в течение нескольких дней или более продолжительного периода времени в зависимости от состояния субъекта лечение продолжают до желаемого подавления симптомов заболевания. Предпочтительная доза антитела составляет от около 0,05 мг/кг до около 10 мг/кг. Таким образом, субъекту можно вводить одну или несколько доз, равных примерно 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 4,0 мг/кг или 10 мг/кг (или любую комбинацию указанных доз). Такие дозы можно вводить с перерывами, например, через одну или три недели (например, так, чтобы субъект получил от около двух до около двадцати, в частности около шести, доз антитела против ErbB2). Сначала может быть введена более высокая ударная доза и затем одна или несколько более низких доз. Типичная схема введения лекарственного средства включает введение начальной ударной дозы антитела против ErbB2, равной примерно 4 мг/кг, с последующим еженедельным введением поддерживающей дозы, равной примерно 2 мг/кг. Однако можно использовать другие схемы введения лекарственного средства. Ход лечения можно легко контролировать известными методами и анализами.

В конкретном варианте осуществления изобретения антитело rhuMAb 2C4 вводят в виде постоянной дозы, равной 420 мг (которая эквивалента дозам, равным 6 мг/кг, для субъекта с массой тела 70 кг), один раз в 3 недели. Лечение может быть начато с введения более высокой ударной дозы (например, 840 мг, эквивалентной 12 мг/кг массы тела) для более быстрого достижения стабильной концентрации в сыворотке крови.

В нижеследующих примерах приведены также специальные схемы введения лекарственного средства.

Помимо введения субъекту белка антитела, настоящая заявка относится к введению антитела методом генотерапии. Такое введение нуклеиновой кислоты, кодирующей данное антитело, определяется термином "введение терапевтически эффективного количества антитела". См., например, заявку WO 96/07321, опубликованную 14 марта 1996 г., в которой описано применение генотерапии для создания внутриклеточных антител.

Существуют два основных способа доставки нуклеиновой кислоты (необязательно находящейся в векторе) в клетки субъекта in vivo и ex vivo. Для доставки in vivo нуклеиновую кислоту инъецируют субъекту обычно на участке тела, где необходимо данное антитело. Для доставки ex vivo у субъекта удаляют клетки, нуклеиновую кислоту вводят в указанные выделенные клетки и модифицированные клетки вводят непосредственно субъекту или, например, указанные клетки инкапсулируют в пористые мембраны, которые имплантируют субъекту (см., например, патенты США №№ 4892538 и 5283187). Существует целый ряд методов введения нуклеиновых кислот в жизнеспособные клетки. Указанные методы отличаются в зависимости от введения нуклеиновой кислоты в культивируемые клетки in vitro или in vivo в клетки предполагаемого хозяина. Методы, пригодные для введения нуклеиновой кислоты в клетки млекопитающего in vitro, включают в себя использование липосом, электропорацию, микроинъекции, слияние клеток, DEAE-декстран, осаждение фосфатом кальция и т.д. Обычно используемым вектором для доставки гена ex vivo является ретровирус.

Применяемые в настоящее время предпочтительные методы доставки нуклеиновой кислоты in vivo включают в себя введение вирусных векторов (таких как аденовирус, вирус простого герпеса I или аденоассоциированный вирус) и систем на основе липидов (приемлемыми липидами для опосредованного липидами переноса гена являются, например, DOTMA, DOPE и DC-Chol). В некоторых случаях источник нуклеиновой кислоты желательно снабдить агентом, обеспечивающим направленную доставку к клеткам-мишеням, таким как антитело, специфичное к белку поверхностной мембраны клетки или клетки-мишени, лиганд для рецептора на клетке-мишени и т.д. В случае применения липосом для направленной доставки и/или облегчения поглощения можно использовать белки, которые связываются с белком поверхностной мембраны клетки, определяющим эндоцитоз, например капсидные белки или их фрагменты, тропные для определенного типа клеток, антитела к белкам, которые подвергаются интернализации в процессе циклизации, и белки, которые обеспечивают направленную доставку внутрь клетки и увеличивают полупериод существования в клетке. Метод опосредованного рецепторами эндоцитоза описан, например, в публикациях Wu et al., J. Biol. Chem., 262:4429-4432 (1987); и Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3410-3414 (1990). Для ознакомления с известными в настоящее время методами мечения гена и генотерапии см. публикацию Anderson et al., Science, 256:808-813 (1992). См. также заявку WO 93/25673 и ссылки, приведенные в указанной заявке.

Изделия

В соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к изделию, содержащему вещества, необходимые для лечения вышеописанных нарушений.

Данное изделие включает емкость и наклейку или вкладыш, находящийся внутри упаковки или прилагаемый к указанной емкости. Приемлемые емкости включают, например, флаконы, пробирки, шприцы и т.д. Указанные емкости могут быть изготовлены из разных материалов, таких как стекло или пластик. В данной емкости находится композиция, предназначенная для лечения заболевания, и имеется отверстие для стерильного доступа (например, указанная емкость может представлять собой пузырек с раствором для внутривенного вливания или пробирку с пробкой, проницаемой для иглы для подкожных инъекций). По крайней мере один активный агент в композиции является антителом против ErbB2. На наклейке или вкладыше указано, что данная композиция предназначена для лечения определенного заболевания, такого как рак. В одном варианте осуществления изобретения на наклейке или вкладыше указано, что данную композицию, содержащую антитело, связывающееся с ErbB2, можно использовать для лечения субъекта, имеющего опухоль, в которой обнаружено наличие комплексов HER2/HER1, и/или HER2/HER3, и/или HER2/HER4, и/или фосфорилирование рецептора ErbB. Кроме того, данное изделие может включать (а) первую емкость с композицией, содержащей первое антитело, которое связывается с ErbB2 и ингибирует рост раковых клеток, сверхэкспрессирующих ErbB2; и (b) вторую емкость с композицией, содержащей второе антитело, которое связывается с ErbB2 и блокирует активацию лигандом рецептора ErbB. Изделие по данному варианту осуществления изобретения может далее включать вкладыш с указанием того, что композиции, содержащие первое и второе антитело, можно использовать для лечения рака, характеризующегося наличием гетеродимеров HER2/HER1, и/или HER2/HER3, и/или HER2/HER4, и/или фосфорилированием рецептора ErbB. Кроме того, вкладыш может инструктировать пользователя композицией (содержащей антитело, связывающееся с ErbB2 и блокирующее активацию лигандом рецептора ErbB) о возможности комбинированного лечения данным антителом и любым дополнительным лекарственным средством, описанным в предыдущем разделе (таким как химиотерапевтическое средство, лекарственное средство, направленно доставляемое к EGFR, антиангиогенное средство, антигормональное соединение, кардиозащитное средство и/или цитокин). Альтернативно или дополнительно данное изделие может включать вторую (или третью) емкость, содержащую фармацевтически приемлемый буфер, такой как бактериостатическая вода для инъекций (BWFI), физиологический раствор с фосфатным буфером, раствор Рингера и раствор декстрозы. Кроме того, данное изделие может далее включать другие материалы, желательные с коммерческой и потребительской точки зрения, в частности другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.

Указанные антитела можно также использовать при выполнении диагностических анализов. Такие антитела обычно метят описанными выше методами. Для удобства антитела по настоящему изобретению могут быть получены в виде набора, то есть комбинации реагентов, упакованных в заранее определенных количествах, с инструкциями о выполнении диагностического анализа. Если антитело мечено ферментом, данный набор может включать субстраты и кофакторы, необходимые для данного фермента (например, предшественник субстрата, содержащий детектируемый хромофор или флуорофор). Кроме того, в набор могут входить другие дополнительные вещества, такие как стабилизаторы, буферы (например, блокирующий или лизирующий буфер) и тому подобные. Относительные количества разных реагентов могут изменяться в широких пределах для достижения концентраций в растворе реагентов, которые оптимизируют чувствительность анализа. В частности, реагенты могут находиться в наборе в виде сухих порошков, обычно лиофилизованных, включая наполнители, которые при растворении позволяют получить раствор реагента, имеющего необходимую концентрацию.

Депонирование материалов

Нижеследующие линии клеток гибридомы были депонированы в Американскую коллекцию типовых культур по адресу 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC):

Обозначение антитела№ АТССДата депонирования7С2АТСС НВ-1221517 октября 1996 г.7F3АТСС НВ-1221617 октября 1996 г.4D5АТСС CRL 1046324 мая 1990 г.2C4ATCC HB-126978 апреля 1999 г.

Приведенное выше описание изобретения считается достаточным для осуществления изобретения специалистом в данной области. Объем настоящего изобретения не ограничен депонированными конструкциями, так как приведенные варианты депонированных антител служат только для иллюстрации определенных объектов изобретения, и в объем данного изобретения входят все функционально эквивалентные конструкции. Указанное депонирование материалов не является признанием того, что приведенное описание изобретения является недостаточным для осуществления какого-либо объекта изобретения, включая предпочтительный вариант его осуществления, а также того, что оно ограничивает объем формулы изобретения. Несомненно, что специалисту в данной области должны быть очевидны разные модификации данного изобретения помимо рассмотренных в данном описании изобретения, которые входят в объем прилагаемой формулы изобретения.

Вполне понятно, что специалист в данной области может использовать настоящее изобретение для решения любой конкретной проблемы или в любой ситуации на основании приведенного описания изобретения.

Данное изобретение далее будет проиллюстрировано нижеследующими неограничивающими примерами. Все научные публикации, приведенные в описании изобретения, включены в данную заявку в качестве ссылки.

Пример 1

Блокирование моноклональным антителом 2С4 HRG-зависимого связывания рецептора ErbB2 с рецептором ErbB3

Моноклональное антитело мыши 2С4, которое специфически связывается с внеклеточным доменом рецептора ErbB2, описано в заявке WO 01/89566, которая полностью включена в данное описание изобретения в качестве ссылки.

Способность рецептора ErbB3 связываться с рецептором ErbB2 исследовали в эксперименте по коиммунопреципитации. 1,0×10⁶ клеток MCF7 или SK-BR-3 высевали на шестилуночные планшеты для культуры ткани в смеси среды DMEM/среды F12 Гама с соотношением 50:50, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS) и 10 мМ HEPES, рН 7,2 (питательная среда), и оставляли для прикрепления на ночь. Клетки выращивали на питательной среде без сыворотки в течение двух часов до начала эксперимента.

Клетки быстро промывали физиологическим раствором с фосфатным буфером (PBS) и инкубировали с 100 нМ указанного антитела, разведенного в 0,2% мас./об. бычьего сывороточного альбумина (BSA), в среде RPMI, с 10 мМ HEPES, рН 7,2 (связывающий буфер) или только со связывающим буфером (контрольный образец). Культуры инкубировали в течение одного часа при комнатной температуре и добавляли HRG до конечной концентрации, равной 5 нМ, в половину лунок (+). В другие лунки (-) добавляли такой же объем связывающего буфера. Культуры продолжали инкубировать в течение примерно 10 минут.

Супернатанты удаляли отсасыванием и клетки лизировалия в среде RPMI, 10 мМ HEPES, рН 7,2, 1,0% об./об. TRITON X-100™, 1,0% мас./об. CHAPS (лизирующий буфер), содержащей 0,2 мМ PMSF, 10 мкг/мл лейпептина и 10 TU/мл апротинина. Лизаты очищали от нерастворимых веществ центрифугированием.

ErbB2 подвергали иммунопреципитации с использованием моноклонального антитела, ковалентно связанного с гелем (Affi-Prep 10, Bio-Rad). Указанное антитело (Ab-3, Oncogene Sciences, USA) узнает эпитоп цитоплазматического домена. Иммунопреципитацию выполняли, добавляя к каждому лизату 10 мкл суспензии геля, содержащей примерно 8,5 мкг иммобилизованного антитела, и образцы оставляли для смешивания при комнатной температуре в течение двух часов. Затем гели собирали центрифугированием. Порции геля трижды промывали лизирующим буфером для удаления несвязанного вещества. Затем добавляли буфер для образца с додецилсульфатом натрия (SDS) и образцы недолго нагревали на бане с кипящей водой.

Супернатанты разделяли в 4-12% полиакриламидных гелях и электроблоттировали на нитроцеллюлозных мембранах. Наличие ErbB3 определяли зондированием блотов поликлональным антителом против эпитопа цитоплазматического домена (с-17, Santa Cruz Biotech). Блоты визуализировали, используя хемилюминесцетный субстрат (ECL, Amersham).

Как показано в виде контрольных полос на фиг.2А и 2В для клеток MCF7 и SK-BR-3, рецептор ErbB3 присутствовал в иммунопреципитате ErbB2 только тогда, когда клетки стимулировали HRG. Если клетки сначала инкубировали с моноклональным антителом 2С4, сигнал ErbB3 подавлялся в клетках MCF7 (фиг.5А, полоса 2С4+) или значительно ослаблялся в клетках SK-BR-3 (фиг.5В, полоса 2С4+). Как показано на фиг.2А-В, моноклональное антитело 2С4 блокирует герегулин-зависимое связывание рецептора ErbB3 с рецептором ErbB2 как в клетках MCF7, так и в клетках SK-BR-3 гораздо эффективнее, чем HERCEPTIN®. Предварительная инкубация с препаратом HERCEPTIN® ослабляла сигнал ErbB3 в лизатах клеток MCF7 и незначительно влияла или вообще не влияла на количество ErbB3, соосажденного из лизатов SK-BR-3. Предварительная инкубация с антителом против рецептора EGF (Ab-1, Oncogene Sciences, USA) не влияла на коиммунопреципитацию ErbB3 с рецептором ErbB2 во всех линиях клеток.

Пример 2

Чувствительность линии клеток и моделей ксенотрансплантатов опухоли человека к антителу 2С4

На чувствительность к антителу 2С4 было исследовано примерно 40 моделей опухолей. Указанные модели представляют собой основные раковые опухоли, такие как рак молочной железы, легкого, предстательной железы и ободочной кишки. 50-60% Моделей реагировали на воздействие антитела 2С4. В приведенной ниже таблице 1 представлены отобранные модели опухолей, испытанные на чувствительность к антителу 2С4. Фрагменты ксенотрансплантатов опухоли человека размером около 3 мм трансплантировали под кожу бестимусным "голым" мышам. Альтернативно опухолевые клетки человека, выращенные in vitro, отделяли от чашек для культивирования, вторично суспендировали в физиологическом растворе с фосфатным буфером и инъецировали подкожно в бок мышам с ослабленным иммунитетом. Рост опухолей контролировали каждые 2-3 дня с помощью электрического микрометра. Когда опухоли достигли размера, равного примерно 30-100 мм, животных произвольно распределяли в разные экспериментальные и контрольные группы. Антитело 2С4 вводили в виде внутрибрюшинной инъекции один раз в неделю. Контрольным животным вводили аналогичный объем раствора носителя, не содержащего антитела, в соответствии с такой же схемой введения, что и экспериментальным животным. Исследование завершали примерно через 3-6 недель, когда опухоли в контрольной группе достигали размера около 1000-1500 мм³. Чувствительность к указанному воздействию определяли в виде ≥50% у меньшения объема опухоли.

Таблица 1
Модели ксенотрансплантатов№ моделиМодель опухолиЧувствительность к антителу 2С4Ссылка1LXFA 289Нет(Fiebig et al., 1999)2LXFA 297Да 3LXFA 526Нет(Fiebig et al., 1999)4LXFA 629Да(Fiebig and Burger, 2002)5LXFA 1041Нет 6LXFE 211Нет(Fiebig et al., 1999)7LXFE 397Нет(Fiebig et al., 1999)8LXFL 529Нет(Burger et al., 2001)9LXFL 1072Да(Fiebig et al., 1999)10Calu-3Да(Stein et al., 2001)11NCI-H522Да(Yamori et al., 1997)12NCI-H322Нет(Zou et al., 2001)13NCI-H441 (KAM)Да(Gridley et al., 1996)14MAXF MX1Нет 15MAXF 401Нет(Fiebig et al., 1999)16MAXF 449Да(Burger et al., 2001)17MAXF 713Нет(Berger et al., 1992)18MAXF 857Нет(Fiebig et al., 1999)

Указанные модели относятся к двум основным типам опухолей, а именно к немелкоклеточному раку легкого (NSCLC, модели № 1-13) и раку молочной железы (модели № 14-18). Девять моделей NSCLC (№ 1-9) и все модели рака молочной железы были получены путем последовательного пассирования in vivo фрагментов опухоли человека у мышей с иммунодефицитом. Остальные модели NSCLC (№ 10-13) являются моделями, созданными на основе клеток, в которых рост опухоли in vivo индуцирован имплантацией выращенных in vitro клеток мышам с ослабленным иммунитетом. Berger, D.P., Winterhalter, B.R., and Fiebig, H.H. (1992). Establishment and Characterization of Human Tumor Xenografts in Thymus-Aplastic Nude Mice. In Immunodeficient Mice in Oncology, H. H. Fiebig and D.P. Berger, eds. (Basel: Karger), pp.23-46.

Burger, A.M., Hartung, G., Stehle, G., Sinn, H., and Fiebig, Y.Y. (2001). Pre-clinical evaluation of a methotrexate-albumin conjugate (MTX-HAS) in human tumor xenografts in vivo. Int. J. Cancer, 92:718-24.

Fiebig, H.H., and Burger, A.M. (2002). Human Tumor Xenografts and Explants. In Tumor Models in Cancer Research, B.A. Teicher, ed. (Totowa, New Jersey: Humana Press), pp.113-137.

Fiebig, H.H., Dengler, W.A., and Roth, T. (1999). Human Tumor Xenografts: Predictivity, Characterization and Discovery of New Anticancer Agents. In Contributions to Oncology: Relevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development, H.H. Fiebig and A.M. Burger, eds. (Basel: Karger), pp.29-50.

Gridley, D.S., Andres, M.L., Garner, C., Mao, X.W., and Slater, J.M. (1996). Evaluation of TNF-alpha effects on radiation efficacy in a human lung adenocarcinoma model. Oncol Res., 8:485-95.

Stein, R., Govindan, S.V., Chen, S., Reed, L., Spiegelman, H., Griffiths, G.L., Hansen, H.J., and Goldenberg, D.M. (2001). Successful therapy of a human lung cancer xenograft using MAb RS7 labeled with residualizing radioiodine. Crit. Rev. Oncol. Hematol., 39:173-80.

Yamori, T., Sato, S., Chikazawa, H., and Kadota, T. (1997). Anti-tumor efficacy of paclitaxel against human lung cancer xenografts. Jpn. J. Cancer Res., 88:1205-10.

Zou, Y., Wu, Q.P., Tansey, W., Chow, D., Hung, M.C., Charnsangavej, C., Wallace, S., and Li, C. (2001). Effectiveness of water soluble poly(L-glutamic acid)-camptothecin conjugate against resistant human lung cancer xenografted in nude mice. Int. J. Oncol., 18:331-6.

Пример 3

Обнаружение методом иммунопреципитации гетеродимеров в опухолях, чувствительных к антителу 2С4

Опухоли, чувствительные и не чувствительные к антителу 2С4, подвергали иммунопреципитации с использованием антител против ErbB2 для анализа наличия гетеродимеров ErbB2-ErbB3 и EGFR-ErbB2. За исключением особо оговоренных случаев указанный анализ выполняли методами, описанными в публикации Maniatis T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, USA, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1982.

Отбирали антитела против HER2, HER3 и HER1, которые не вступали в перекрестное взаимодействие друг с другом. Для определения перекрестного взаимодействия между антителами рецепторы HER1, HER2, HER3 и HER4 экспрессировали в эмбриональных клетках почки человека (HEK) 299. Указанные клетки лизировали, используя Тритон™ Х100 (1% массы к объему), содержащий буфер HEPES (рН 7,5). Примерно 20 мкг общего клеточного белка из контрольных клеток и клеток, экспрессирующих HER1, HER2, HER3 и HER4, разделяли в геле с додецилсульфатом натрия и переносили на нитроцеллюлозную мембрану методом "полусухого" блоттинга. Разные антитела против HER1, HER2 и HER3 блокировали желатином и испытывали в отношении перекрестной реактивности против других рецепторов ErbB. Антитела, отобранные для использования в описанных ниже экспериментах, не характеризовались какой-либо значительной перекрестной реактивностью.

Только что полученные образцы опухоли механически измельчали на льду и лизировали в буфере, содержащем 50 мМ HEPES, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 1,5 мМ MgCl₂, 1 мМ EDTA, 10% (мас./об.) глицерина, 1% (мас./об.) Тритона™ Х-100, 1 мМ PMSF, 10 мкг/мл апротинина и 0,4 мМ ортованадата. Полностью лизированные опухоли несколько раз центрифугировали, пока супернатанты не становились совершенно прозрачными. Иммунопреципитацию осуществляли путем объединения очищенных лизатов опухоли (5-7 мг белка/лизат), 5 мкг антитела против ErbB2 (Ab-3, моноклональное антитело мыши, № по каталогу ОР15, Oncogene Inc., USA) и 50 мкл агарозы, связанной с белком G, в 1,5 мл реакционных пробирках Эппендорфа. Затем добавляли одно-двукратный объем 50 мМ буфера HEPES, рН 7,5, содержащего 0,1% (мас./об.) Тритона™ Х-100, и содержимое пробирок центрифугировали в течение 3-4 часов при 4°С. Осадок два-три раза промывали 500 мкл 50 мМ буфера HEPES, рН 7,5, содержащего 0,1% (мас./об.) Тритона™ Х-100. К промытому иммунопреципитату добавляли такой же объем двукратного буфера для образца Lämmli и образцы нагревали в течение 5 минут при 95°С. Образцы разделяли методом SDS-PAGE и переносили на нитроцеллюлозу. Присутствие гетеродимеров EGFR-ErbB2 и ErbB2-ErbB3 определяли зондированием блотов антителами против EGFR (поликлональное антитело кролика против EGFR, Upstate Inc., USA; № по каталогу 06-847) и ErbB3 (поликлональное антитело против ErbB3; Santa Cruz Inc., USA; № по каталогу SC-285). Меченное пероксидазой (POD) антитело против Fc-фрагмента кролика (BioRad Laboratories Inc., USA) использовали в качестве вторичного антитела. Блоты визуализировали, используя хемилюминесцентный субстрат (ECL plus, Amersham).

На фиг.3 показаны результаты указанных экспериментов. На данной фигуре можно наблюдать присутствие гетеродимеров ErbB2-ErbB3 и/или EGFR-ErbB2. Была обнаружена корреляция между чувствительностью к антителу 2С4, показанной в таблице 1, и наличием гетеродимеров ErbB2-ErbB3 и/или EGFR-ErbB2.

Пример 4

Корреляция между чувствительностью к антителу rhuMAb 2C4 и фосфорилированием HER2

Воздействие антитела rhuMAb 2C4 на рост опухоли исследовали, используя 14 опухолей человека, эксплантированных мышам (9 раковых опухолей легкого и 5 раковых опухолей молочной железы). Эксплантацию опухоли и лечение выполняли способом, описанным в примере 2. Гетеродимеры HER2 были обнаружены способом, описанным в примере 3.

Фосфорилирование HER2 выявляли методом иммунопреципитации HER2 и вестерн-блоттинга. Положительный результат определяли по наличию в геле полосы фосфо-HER2. Отрицательный результат определяли по отсутствию указанной полосы. Фосфорилирование HER2 было подтверждено иммуногистохимическим анализом с использованием фосфоспецифического антитела против HER2 (клон PN2A, Thor et al., J. Clin. Oncol., 18:3230-9 (2000).

В 5 исследованных опухолях (3 опухоли легкого и 2 опухоли молочной железы) наблюдалось значительное ингибирование роста опухоли, что согласуется с присутствием детектируемых гетеродимеров HER2 с HER1 или HER3 и сильным фосфорилированием HER2 во всех случаях. В 9 опухолях, в которых не наблюдалась существенная чувствительность к антителу rhuMAb 2C4, не были обнаружены гетеродимеры и отсутствовало фосфорилирование HER2. Гетеродимеризация HER2 или значительное фосфорилирование HER2 являются четко выраженными прогностическими факторами, позволяющими определить реакцию на воздействие антитела rhuMAb 2C2 в неклинических моделях. Аналогичные наблюдения были сделаны при использовании ксенотрансплантатов, полученных из линий опухолевых клеток.

Пример 5

Обнаружение фосфорилирования HER2 в опухолях, чувствительных к антителу 2С4

Эффективность антитела rhuMAb 2C4 оценивали в девяти моделях ксенотрансплантированных опухолей (LXFE 211, LXFA 289, LXFA 297, LXFE 397, LXFA 526, LXFL 529, LXFA 629, LXFA 1041, LXFL 1071, Oncotest GmbH, Freiberg, Germany) индуцированной немелкоклеточной карциномы легкого (NSCLC). Ксенотрансплантаты опухоли человека считаются наиболее пригодными моделями для создания противораковых средств, так как указанные опухоли растут у субъекта в виде солидной опухоли, образуют стромальные клетки, сосудистую сеть, вызывают некроз центральных клеток и характеризуются дифференцировкой купола. Кроме того, модели ксенотрансплантированных опухолей очень близко напоминают первоначальные опухоли в отношении гистологии и чувствительности к химиотерапии.

Ингибирование роста определяли способом, описанным в примере 2. Значительную ингибирующую рост активность определяли как >50% ингибирование роста в экспериментальной группе по сравнению с контрольной группой. В трех моделях NSCLC (LXFA 297, LXFA 629 и LXFL 1072) наблюдалась значительная ингибирующая рост восприимчивость к лечению антителом rhuMAb 2C4. На белковом уровне было также обнаружено несколько признаков лиганд-активированного HER2. Как показано на фиг.4, HER2 мог образовывать иммунопреципитат из опухолевых экстрактов в восьми из девяти опухолей NSCLC. Для определения состояния активации HER2 указанные блоты зондирования антителом против фосфотирозина (против PY). Как показано в нижнем блоке на фиг.4, в трех чувствительных опухолях (LXFA 297, LXFA 629 и 1072) имела место сильная активация НER2.

Пример 6

Клиническое исследование по выявлению субъектов с раком легкого, восприимчивых к лечению антителом rhuMAb 2C4, путем обнаружения гетеродимеров HER2

Считается, что субъект страдает немелкоклеточным раком легкого (NSCLC), восприимчивым к лечению антителом rhuMAb 2C4, если в опухоли такого субъекта обнаружены комплексы HER2/HER3, и/или HER2/HER1, и/или HER2/HER4.

Образец опухоли получают с помощью биопсии или во время хирургического удаления опухоли. Затем полученный образец анализируют на наличие гетеродимеров HER2/HER3, и/или HER2/HER1, и/или HER2/HER4.

Опухолевые клетки или клеточные лизаты вводят в соприкосновение с меткой eTag™, которая специфически связывается с HER2. Метка eTag™ содержит детектируемую часть и первую связывающую часть, специфичную к HER2. Детектируемая часть связана с первой связывающей частью расщепляемым линкером. Через некоторое время после связывания избыток метки eTag™ удаляют.

Опухолевые клетки или клеточные лизаты вводят в соприкосновение со вторым связывающим соединением, которое специфически связывается с HER1, или HER3, или HER4. Несвязанное соединение удаляют промыванием. Второе связывающее соединение затем активируют. Если первое связывающее соединение и второе связывающее соединение находятся в непосредственной близости друг от друга, активированное второе связывающее соединение расщепляет расщепляемый линкер в метке eTag™ с образованием свободной детектируемой части. Обнаружение свободной детектируемой части в образце свидетельствует о том, что опухоль содержит гетеродимеры HER2/HER1, или HER2/HER3, или HER2/HER4.

После обнаружения у субъекта опухоли, содержащей гетеродимеры HER2/HER1, и/или HER2/HER3, и/или HER2/HER4, указанному субъекту внутривенно (IV) вводят антитело rhuMAb 2C4 в количестве 2 или 4 мг/кг еженедельно или через каждые три недели до прогрессирования болезни. Данное антитело вводят в виде нескольких доз жидкого препарата (20 мл наполнение при концентрации 20 мг/мл или более высокой концентрации). Главными показателями эффективности являются скорость реакции и безопасность. Вторичными показателями эффективности являются общее выживание, время до прогрессирования болезни, качество жизни и/или продолжительность реакции.

Пример 7

Клиническое исследование по выявлению субъектов, страдающих раком, восприимчивых к лечению антителом rhuMAb 2C4

У предполагаемых субъектов, подлежащих лечению, получают биологический образец, содержащий раковые клетки, например, путем биопсии опухолевой ткани, аспирации опухолевых клеток из асцитической жидкости или любым другим методом, известным в клинической практике. Полученный биологический образец анализируют в отношении фосфорилирования HER2 методом иммунопреципитации и вестерн-блоттинга и/или на наличие гетеродимеров HER2/HER3, и/или HER2/HER1, и/или HER2/HER4 любыми вышеописанными методами. Субъекты, у которых биологический образец дал положительный результат на фосфорилирование HER2 и/или наличие гетеродимеров HER2/HER3, и/или HER2/HER1, и/или HER2/HER4, по-видимому, будут лучше реагировать на лечение антителом rhuMAb 2C4, чем субъекты, у которых в образце опухоли не было обнаружено фосфорилирование HER2 или гетеродимеры.

Например, субъектов, у которых был диагностирован рак яичника, подвергают биопсии опухолевой ткани или аспирации опухолевых клеток из асцитической жидкости. Полученную ткань анализируют в отношении фосфорилирования HER2 методом иммунопреципитации и вестерн-блоттинга. Для указанной цели необходимо как минимум около 250 мг опухолевой ткани.

Субъекту, у которого обнаружена форма рака (в частности, раковая опухоль предстательной железы, не подлежащая удалению, (CRPC) или рак яичника) с положительным результатом в отношении фосфорилирования HER2, вводят ударную дозу, равную 840 мг антитела rhuMAb 2C4, в 1-й день 1-го цикла (первый день 21-дневного цикла лечения), затем 420 мг в 1-й день каждого последующего 21-дневного цикла лечения в виде непрерывного внутривенного вливания. Лечение продолжают, производя внутривенное вливание через каждые 3 недели в течение одного года (17 циклов), если у субъекта отсутствуют признаки прогрессирования болезни. Лечение может быть прекращено по решению лечащего врача в любое время раньше установленного срока из-за отсутствия реакции, вредного воздействия или по другим причинам.

Все публикации, приведенные в описании изобретения и примерах, включены в данную заявку в качестве ссылки.

Хотя настоящее изобретение описано со ссылкой на определенные варианты его осуществления, они не ограничивают объем изобретения. Специалисту в данной области должно быть понятно, что возможны разные модификации, не меняющие сущность изобретения. Все такие модификации, которые могут быть выполнены без излишнего экспериментирования, входят в объем данного изобретения.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Описан способ идентификации опухолей, восприимчивой к лечению моноклональным антителом 2С4, или его функциональным фрагментом, или моноклональным антителом, обладающим биологическими характеристиками моноклонального антитела 2С4 или его функционального фрагмента. Выявляют наличие белкового комплекса HER2/HER3 и/или HER2/HER1 в образце опухоли. Затем определяют восприимчивость опухоли к лечению указанным антителом или его фрагментом после обнаружения наличия комплекса. Настоящее изобретение позволяет просто идентифицировать опухоль, восприимчивую к лечению антителом 2С4. 21 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл.

1. Способ идентификации опухоли, восприимчивой к лечению моноклональным антителом 2С4 или его функциональным фрагментом или моноклональным антителом, обладающим биологическими характеристиками моноклонального антитела 2С4 или его функционального фрагмента, предусматривающий

a) обнаружение наличия белкового комплекса HER2/HER3 и/или HER2/HER1 в образце указанной опухоли; и

b) определение восприимчивости опухоли к лечению указанным антителом или его фрагментом после обнаружения наличия комплекса.

a) иммунопреципитации любых белковых комплексов, содержащих HER2, с помощью антитела против HER2;

b) контактирования образующих иммунопреципитат комплексов с антителом, выбранным из группы, состоящей из антител против HER3 и антител против HER1; и

с) выявления того, связываются ли антитела против HER3 и/или HER1 с образующими иммунопреципитат комплексами;

при этом комплекс HER2/HER3 и/или HER2/HER1 считается обнаруженным, если антитела против HER3 и/или HER1 связываются с образующими иммунопреципитат комплексами.

a) контактирования образца опухоли с антителом против HER2, содержащим флуорофор;

b) контактирования образца опухоли с антителом, выбранным из группы, состоящей из антител против HER3 и HER1, причем указанное антитело содержит второй флуорофор;

c) выявления непосредственной пространственной близости первого флуорофора и второго флуорофора путем измерения переноса резонансной энергии флуоресценции;

при этом белковый комплекс HER2/HER3 и/или HER2/HER1 считается обнаруженным, если первый и второй флуорофоры находятся в непосредственной близости друг от друга.

a) контактирования образца опухоли с первым связывающим соединением, причем указанное первое связывающее соединение содержит часть, связывающуюся с первой мишенью, которая специфически связывается с HER2, и дополнительно содержит детектируемую часть, связанную при помощи расщепляемого линкера с частью, связывающейся с первой мишенью;

b) контактирования образца опухоли со вторым связывающим соединением, причем указанное второе связывающее соединение содержит часть, связывающуюся со второй мишенью, которая специфически связывается с HER3 или HER1, и активируемый расщепляющий агент;

c) активации расщепляющего агента, в результате которой при нахождении первого связывающего соединения и второго связывающего соединения в непосредственной близости друг от друга второе связывающее соединение расщепляет расщепляемый линкер в первом связывающем соединении, с образованием свободной детектируемой части;и

d) идентификации свободной детектируемой части;

при этом белковый комплекс HER2/HER3 или HER2/HER1 считается обнаруженным, если идентифицирована свободная детектируемая часть.