СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЭСТРОГЕН- И ПРОГЕСТЕРОНЗАВИСИМОЙ ПАТОЛОГИИ ГЕНИТАЛИЙ Российский патент 2007 года по МПК G01N33/58 G01N33/74 

Изобретение относится к медицине, в частности к гинекологии.

Увеличение количества рецепторов эстрадиола и прогестерона в измененной ткани свидетельствует о гормональной зависимости патологического процесса.

Наиболее социально значимыми гормонозависимыми патологиями гениталий в настоящее время можно считать гиперплазии эндометрия, эндометриоз, миому матки (Серов В.Н. и соавт. Гинекологическая эндокринология. Москва: МЕД-прессинформ, 2004, 520 с.).

Современная диагностика гормонально-зависимых состояний гениталий включает в себя: ультразвуковое исследование (Манухин И.Б. и соавт. Клинические лекции по гинекологии. - М.: Мед. информационное агентство, 2001, 243 с.) регистрирует объемные образования, например, толщину эндометрия. По данным Манухина И.Б., нормальному эндометрию в фазе секреции соответствуют значения - 9,8±2,1 мм, гиперплазии эндометрия - 15,4±10,4 мм, аденокарциноме эндометрия - 20,12±2,04 мм. Этот метод определяет лишь объемные образования в ткани, но не позволяет судить об их гормональной зависимости.

Для подтверждения предварительного диагноза, основанного на данных М-ЭХО (УЗИ), используют:

- гистологическое исследование биоптата. Он позволяет поставить диагноз конкретной морфологической нозологии. Однако и этот метод не позволяет решить вопрос о гормональной зависимости патологического процесса.

- Определение гонадотропинов и половых стероидов в периферической крови (Сметник В.П., Тумилович Л.Г. Неоперативная гинекология. - М.: Мед. информационное агентство, 2000, 591 с.) необходимо для оценки гормонального фона заболевания, изменение которого зачастую инициирует и сопутствует патологическому процессу. Изменение гормонального фона (например, абсолютная или относительная гиперэстрогенемия) у пациентки служит косвенным подтверждением гормональной зависимости патологического процесса, но не отражает состояние рецепторного статуса самой патологически измененной ткани.

Наиболее близким к предлагаемому способу диагностики эстроген- и прогестеронозависимости патологии гениталий является определение уровня рецепторов эстрадиола и прогестерона в биоптате (Краснопольский В.И. и соавт. «Рецепция половых стероидов при гиперпластических процессах в эндометрии у женщин позднего репродуктивного возраста» / Ж. Росс. Вестник акушера-гинеколога. - М.: МедиаСфера, 2005, т.5, №2, стр.7-9). Недостатком метода является его инвазивность, а именно забор биоптата патологически измененной ткани.

Задача изобретения - неинвазивный способ диагностики эстроген- и прогестеронозависимости патологического процесса гениталий.

Поставленная задача решается способом диагностики эстроген- и прогестеронзависимой патологии гениталий, заключающимся в том, что определяют количество рецепторов эстрадиола и прогестерона в мононуклеарной фракции клеток периферической крови и при увеличении более 210 и 2050 рецепторов на клетку соответственно диагностируют эстроген- или прогестеронзависимую патологию.

Заявляемое изобретение не очевидно для специалистов, работающих в области эндокринологической гинекологии.

Методика. Мононуклеарные клетки периферической крови выделяют стандартным методом [Boyum A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow // Scand. J. Clin. Lab. Investig. - 1968. - Vol.21 - Suppl. 97. p.1-9] из гепаринизированной крови (7-10 ME гепарина/мл) с модификациями. Кровь разводят физиологическим раствором (рН 7,2) в соотношении 1:2. Разведенную физиологическим раствором кровь (5 мл) наслаивают на подогретый до комнатной температуры фиколл (Pharmacia Fine Chemicals, Швеция, плотность 1, 077 г/мл, 3 мл в центрифужной пробирке) и центрифугируют при 400g в течение 30 мин, 4°С [Хейфиц Л.Б., Абалкин В.А. Разделение форменных элементов крови человека //Ж. Лаб. дело, 1973. - 10. - с.579-581]. Интерфазу отбирают стерильной стеклянной пипеткой и полученную мононуклеарную фракцию трижды отмывают бесцветным раствором Хенкса (клетки ресуспендируют в десятикратном объеме раствора Хенкса и центрифугируют 5 минут при 250 g). Последний осадок поднимают в 1 мл среды и подсчитывают в камере Горяева. После подсчета разводят средой до концентрации клеток 500 млн/100 мкл. Жизнеспособность клеток, определяемая по методу окрашивания с трипановым синим (Ланг Н.Р. Стимуляция лимфоцитов // М.: Медицина, 1976. - 288 с.), составила 96%.

Методика определения рецепторов прогестерона и эстрадиола в мононуклеарных клетках крови основана на известном методе определения указанных рецепторов в фракции плазматических мембран миоутероцитов [Бассалык. Рецепторы стероидных гормонов в опухолях человека. М., Медицина, 1987, стр.198-202]. Временные и концентрационные параметры насыщения связывания метки подобраны экспериментально. Для количественного определения рецепторов прогестерона и эстрадиола в мононуклеарных клетках готовят стерильный пластиковый планшет (96 круглодонных лунок): во все рабочие лунки вносят по 10 мкл спиртового раствора ³H-прогестерона или ³H-эстрадиола («Amersham» GB) из расчета получения в инкубационной среде конечных концентраций 20 и 5 нМ соответственно. С целью ингибирования специфического связывания стероидов используют двухсоткратный избыток немеченого прогестерона и диэтилстильбэстрола соотвественно («Merck», Германия), которые в спиртовом растворе вносят в лунки по стандартной схеме. 200-кратный избыток дексаметазона («Merck», Германия) добавляют в рабочие лунки с целью подавления перекрестного связывания глюкокортикоидов с рецепторами прогестерона. После внесения в лунки спиртовых растворов указанных стероидов спирт выпаривают в токе азота. За 30 минут до инкубации в лунки вносят по 50 мкл среды Хенкса. Во все подготовленные лунки планшета вносят по 50 мкл суспензии мононуклеарных клеток (500 млн клеток/100 мкл) и инкубируют 60 минут - для рецепторов прогестерона, 30 минут - для определения рецепторов эстрадиола при комнатной температуре. Для отделения несвязанной метки ресуспендированные клетки фильтруют через стеклянные фильтры (Whatman Glass Micro Fiber Filter GF/B - 25 mm dia.), которые отмывают 100-кратным избытком ледяного Хенкса и помещают в сцинтилляционные флаконы. После выпаривания фильтры заливают 5 мл сцинтилляционной жидкости и через 60 минут радиометрируют. Все исследования проводят в триплетах.

Подсчет специфического связывания производят по формуле:

[(T-NSB)·k/n]·N,

где Т - общее связывание, NSB - неспецифическое связывание, n -количество клеток в лунке, k - коэффициент пересчета cpm в фемтомоли ³H-стероида, N - число Авагадро.

Нижеследующие примеры иллюстрируют способ по изобретению.

Пример 1. Больная Б., 42 лет направлена в НКО МОНИИАГ 11.03.04 г. с диагнозом: рецидивирующая гиперплазия и полип эндометрия для определения дальнейшей тактики лечения. Гиперполименорея. В анамнезе 2 раздельных диагностических выскабливания (РДВ) в 05.03 г. и в 10.03 г. Данные гистологического заключения: железистая гиперплазия эндометрия и железисто-фиброзный полип эндометрия. Диагноз рецидивирующей гиперплазии эндометрия был подтвержден на основании клинических данных и результатов УЗИ на 7 день цикла: М-эхо 12 мм и в дне матки полип диаметром 10 мм. 13.04.04 г. произведена гистероскопия и РДВ. Эндометрий поздней стадии секреции с элементами базальной и микрожелезистой гиперплазии. Фрагменты фиброзно-железистого полипа эндометрия. Параметры рецепции женских половых стероидов в мононуклеарной фракции клеток периферической крови и биоптате эндометрия были проведены параллельно, при этом кровь забирали из локтевой вены у пациентки непосредственно перед выскабливанием.

При определении количества рецепторов эстрадиола и прогестерона в мононуклеарных клетках периферической крови получили следующие величины: для эстрадиола - 875 рец/клетке и для прогестерона - 2541 рец/клетке, что позволило нам диагностировать эстроген- и прогестеронзависимость патологического процесса. В биоптате эндометрия, полученном в ходе диагностического выскабливания, уровень цитозольных рецепторов эстрадиола и прогестерона составил 24,1 и 25,9 фмоль/мг белка цитозоля соответственно. Таким образом, результаты исследования рецепторного профиля и биоптата эндометрия подтвердили полученные нами, в ходе исследования МНК, данные о гормональной зависимости гиперплазии эндометрия у данной пациентки.

На основании приведенных данных была назначена и проведена противорецидивная гормональная терапия дюфастоном 20 мг/сутки с 5 по 25 день цикла 6 месяцев с положительным эффектом. В течение проводимой терапии и через 12 месяцев после ее окончания рецидива не было.

Пример 2. Пациентка К., 48 лет, обратилась в отделение гинекологической эндокринологии с жалобами на гиперполименорею и неоднократные дисфункциональные маточные кровотечения в течение 3-х лет. В анамнезе по поводу меноррагий по месту жительства произведено 2 РДВ. Гистологическое заключение: железистая гиперплазия с явлениями хронического эндометрита. По месту жительства получала гормональную терапию норколут и примолютнор в дозе 10 мг с 5 по 25 день цикла - без эффекта. За год до нашего исследования получала дюфастон 20 мг в сутки с 16 по 25 день цикла - без эффекта после отмены лечения повторные меноррагии, в связи с чем была направлена в МОНИИАГ. При УЗИ: толщина эндометрия (М-эхо) была 13 мм. В левом яичнике определена ретенционная киста диаметром 3,9 см. Заключение: гиперплазия эндометрия, аденомиоз, миома матки небольших размеров. Пациентке произведено раздельное диагностическое выскабливание под контролем гистероскопии. Гистологическое заключение: простая железистая гиперплазия эндометрия с признаками хронического воспаления. Проведены исследования: рецепторного профиля мононуклеарной фракции периферической крови и биоптатов эндометрия методами, описанными в примере 1. Результаты: рецепторы эстрадиола и прогестерона - 160 и 0 рец/клетке в МНК соотвественно; 7,6 и 0 фмоль/мг белка цитозоля биоптата эндометрия соответственно. Следовательно, патологический процесс в эндометрии не является гормонзависимым. Больной предложен и проведен альтернативный метод лечения - пангистерэктомия.

Нами показано, что параметры рецепторного профиля эстрадиола-17β и прогестерона в мононуклеарной фракции клеток (МНК) периферической крови соответствуют (тесно и положительно коррелируют r=0,77 и 0,9 соответственно) с аналогичными параметрами эндометрия пациенток с гиперплазиями (табл.1).

Таблица 1Уровень рецепторов эстрадиола и прогестерона в мононуклеарных клетках (МНК) периферической крови и цитозоле эндометрия пациенток с гиперплазиями эндометрия. Рецепторы эстрадиола 17βРецепторы прогестеронаМНК (рецептор/клетка)Цитозоль (фемтомоль/мг белка)МНК (рецептор/клетка)Цитозоль (фемтомоль/мг белка)Норма48215,75141812,9Железистый полип1187158,0480248,2Простая железистая гиперплазия72819,1286627,3Приведены средние данные исследованных параметров.

Учитывая тесную положительную корреляцию между уровнем рецепторов половых стероидов в МНК и цитозоле биоптата эндометрия пациенток с гиперплазиями, считаем правомерным использование параметров рецепции эстрадиола и прогестерона в мононуклеарной фракции клеток периферической крови для оценки гормональной зависимости патологического процесса в эндометрии.

Сравнительный анализ уровня рецепторов половых стероидов в МНК и цитозоле эндометрия при гиперплазии показал, что пороговыми значениями гормональной зависимости можно считать количество рецепторов эстрадиола и прогестерона в МНК 210 и 2050 рец/кл (что соответствует ≈10 фмоль рецепторов эстрадиола и прогестерона в цитозоле эндометрия соответственно).

При проведении диагностики эстроген- и прогестеронзависимой патологии у 59 больных была подтверждена его возможность использования для целей диагностики и его высокая точность.

Изобретение относится к медицине, в частности к диагностическим методам в гинекологии. Для осуществления способа определяют содержание рецепторов эстрадиола и прогестерона в мононуклеарной фракции клеток периферической крови. При величине более 210 и 2050 рецепторов на клетку соответственно диагностируют эстроген- и прогестеронзависимую патологию гениталий. Использование способа позволяет диагностировать эстроген- и прогестеронзависимую патологию гениталий без взятия биоптата измененной ткани. 1 табл.

Способ диагностики эстроген- и прогестеронзависимой патологии гениталий путем исследования содержания рецепторов эстрадиола и прогестерона в биологическом материале, отличающийся тем, что определяют содержание рецепторов в мононуклеарной фракции клеток периферической крови и при величине более 210 и 2050 рецепторов на клетку соответственно диагностируют эстроген- и прогестеронзависимую патологию гениталий.