ПРИМЕНЕНИЕ ЦИКЛОПАМИНА ПРИ ЛЕЧЕНИИ ПСОРИАЗА Российский патент 2007 года по МПК A61K31/4355 A61P17/06 

Предпосылки создания изобретения

Псориаз является хроническим заболеванием, поражающим около 2% всего населения и отдельного человека с детства и до старости. Его этиология и патогенез неясны. В семейных исследованиях (наследственность) и исследованиях близнецов предполагается полигенное влияние, но природа и механизмы действия участвующих генов неизвестны (Elder JT at al. (2001) Arch. Dermatol. 137:1447-1454). Внешние факторы, такие как стрептококковые инфекции и повреждение кожи, также связаны с образованием псориатических поражений. Каким образом факторы окружающей среды влияют на псориаз, опять же неясно. Однако связь со стрептококковыми инфекциями, иммуносупрессивное действие большинства современных антипсориатических лекарственных средств и другие открытия широко используются как аргументы в пользу аутоиммунной природы заболевания и стимуляции Т-лимфоцитами (Gottlieb S.L. et al (1995) Nat. Med. 1:442-447; Nickoloff B.J. (1999) Arch. Dennatol. 135:1104-1110; Krueger J.G. (2002) J. Am. Acad. Dennatol. 46:1-23).

Простой псориаз (psoriasis vulgaris), характеризующийся четко ограниченными чешуйчатыми эритематозными бляшками различных размеров на различных участках кожи, является наиболее обычной формой псориаза. Гистопатологические исследования псориатических кожных поражений выявляют типичные эпидермальные и кожные изменения, которые включают следующее.

Эпидермальную гиперплазию с элонгацией и утолщением выступов сети.

Истончение супрапапиллярного эпидермиса.

Местные утраты или уменьшение толщины гранулярного слоя эпидермиса.

Инфильтрацию субэпидермальной области кожи нейтрофилами и мононуклеарными воспалительными клетками.

Расширение и скрученность капилляров папиллярной кожи, часто сопровождаемые папиллярным отеком.

"Микроабсцессы Манро", определяемые как местные интракорнеальные скопления нейтрофилов.

Псориатические поражения кожи, как правило, включают большинство из вышеперечисленных гистопатологических изменений и все изменения можно обнаружить при хорошо развитом псориатическом поражении. Помимо этого иммуногистохимические и другие показатели пролиферирующих клеток выявляют присутствие пролиферирующих кератиноцитов в надбазальных слоях пораженной псориатической кожи (в здоровой коже пролиферирующие клетки обычно ограничиваются базальным слоем эпидермиса).

Неясность этиологии и патогенеза псориаза находит отражение в многочисленных стратегиях лечения, используемых при этом заболевании (Spuls P.I. et al. (1997) Br. J. Dermatol. 137:943-949; Ashcroft D.M. et al. (2000) J. Clin. Pharm. Ther. 25:1-10; Al-Suwaidan S.N. et al. (2000) J. Am. Acad. Dermatol. 42:796-802; Lebwohl M. et al. (2001) J. Am. Acad. Dermatol. 45:487-498; Lebwohl M. et al. (2001) J. Am. Acad. Dermatol. 45:649-661). Обычные современные лекарственные методы включают местные кортикостероиды, системное введение иммунодепрессантов (обычно циклоспорина), УФ - облучение пораженной кожи с псораленом или без него, системное лечение ретиноидами или метотрексатом (Spuls P.I. et al. (1997) Br. J. Dermatol. 137:943-949; Ashcroft D.M. et al. (2000) J. Clin. Pharm. Ther. 25:1-10; Lebwohl M. et al. (2001) J. Am. Acad. Dermatol. 45:487-498; Lebwohl M. et al. 15 (2001) J. Am. Acad. Dermatol. 45:649-661). В настоящее время не существует способа излечения псориаза и пациенты нуждаются в лечении в течение жизни. Поэтому сначала рассматривают более простые способы лечения (обычно местные кератолитики и кортикостероиды), а в случае неудачи применяют более эффективное системное лечение, дающее более серьезные побочные эффекты. Сообщают, что если целью терапии является очищение от поражений, то даже наиболее эффективные методы системной терапии были неудачны при лечении четвертой части больных (Spuls P.I. et al. (1997) Br. J. Dermatol. 137:943-949), и, вследствие серьезных побочных эффектов, больным и врачам говорили, что "в настоящее время полное очищение является нереальным" (Al-Suwaidan S.N. et al. (2000) J. Am. Acad. Dermatol. 42:796-802). На практике побочные эффекты обычно ограничивают применение более мощных лекарственных средств в течение более короткого времени [циклоспорин является нефротоксическим и сильным иммунодепрессивным средством, метотрексат обладает гепатотоксическими, ультрафиолетовое облучение - псорален - мутагенными/кардиогенными свойствами (Lebwohl M. et al. (2001) J. Am. Acad. Dermatol. 45:649-661)]. Однако, при длительном применении местные кортикостероиды также не лишены побочных эффектов (Lebwohl M. et al (2001) J. Am. Acad. Dermatol. 45:487-498).

Современные методы лечения, как правило, занимают несколько недель (обычно, 6-8 недель) от начала лечения до появления объективного клинического ослабления заболевания (Al-Suwaidan S.N. et al. (2000) J. Am. Acad. Dermatol. 42:796-802; Lebwohl M. et al. (2001) J. Am. Acad. Dermatol. 45:649-661).

Циклопамин является стероидным алкалоидом, который встречается в природе в чемерице (Veratrum). Тератогенное действие этих растений на беременных пастбищных животных привело к идентификации циклопамина как активного соединения (Keeler R.F. (1969) Phytochemistry 8:223-225).

То, каким образом циклопамин выявляет свою тератогенность, было выяснено, когда обнаружили, что он является ингибитором пути сигнальной трансдукции hedgehog/smoothened белка (Incardona J.P. et al. (1998) Development 125:3553-3562; Cooper M.K. et al. (1998) Science 280:1603-1607). Найдено, что sonic hedgehog белок, член семейства белков Hedgehog, индуцирует дифференцировку клеток-мишеней, включая вентральные клетки-предшественники, в процессе развития центральной нервной системы (Goodrich LV. et al. (1998) Neuron 21:1243-1257). Ингибирование пути белка hedgehog/smoothened под действием циклопамина в процессе развития мозга цыпленка предупреждает образование вентральных клеток и вызывает нарушение дифференцировки переднего мозга в полушария и доли (Incardona J.P. et al. (1998) Development 125:3553-3562; Cooper M.K. et al. (1998) Sience 280:1603-1607), обычную мальформацию наблюдали у ягнят, родившихся у овец, пасущихся на полях, где растет Veratrum (Binns W. et al. (1963) Am. J. Vet. Res. 24:1164-1175). Сообщалось, что циклопамин также блокирует клеточную дифференцировку в других системах, включая дифференцировку клеток костного мозга в эритроидные клетки (Detmer К. et al. (2000) Dev. Biol. 222:242) и дифференцировку мочеполового синуса в простату (Berman D.M. et al. (2000) J. Urol. 163:204).

В WO 00/54545 появилось указание на возможность применения широкой группы соединений, в которую входит и циклопамин, для лечения самых разнообразных физиологических состояний, в число которых входит и псориаз, но никаких доказательств этого в указанной заявке не представлено.

Сущность изобретения

Данное изобретение относится к применению циклопамина, природного стероидного алкалоида, известного более тридцати лет, для лечения псориаза и быстрого удаления псориатических кожных поражений наряду с возвращением гистопатологических признаков заболевания к нормальному состоянию при отсутствии заметных побочных эффектов.

Краткое описание чертежей

На Фигуре 1A показано псориатическое поражение (˜11×13 мм) тыльной поверхности руки 57-летнего мужчины перед началом лечения.

На Фигуре 1В показано то же самое поражение, что и на фигуре 1А, крем циклопамина нанесен на ближнюю половину (на фигуре вверху) и прикрыт, чтобы избежать случайного смазывания и утраты.

На Фигуре 1C показано то же самое поражение, что и на Фигуре 1А, через 24 часа экспозиции с кремом циклопамина. Уменьшение псориатической бляшки на обработанной циклопамином ближней половине (на Фигуре вверху) очевидно.

На Фигуре 1D показано псориатическое поражение (˜7×9 мм) в области левой лопатки 54-летнего мужчины перед началом применения циклопамина.

На Фигуре 1Е показан тот же самый участок кожи, что и на Фигуре 1А, через 1 день применения и 7 дней врачебного наблюдения. Поражение более незаметно за возможным исключением слабой эритемы.

На Фигуре IF показан тот же самый участок кожи, что и на Фигуре 1Е, на 14-й день врачебного наблюдения, кожа выглядит нормальной.

На Фигурах 2А-2W показаны участки ткани непораженной ткани, необработанной псориатической пораженной кожи и обработанной циклопамином пораженной ткани у больного, показанного на Фигурах IA-IC.

На Фигуре 2А показан участок непораженной кожной ткани. Окрашивание гематоксиленом - эозином (Hematoxylene - Eosine, H&E), 200х увеличение (по сравнению с оригиналом).

На Фигуре 2В показан участок необработанной псориатической пораженной кожи. H&E, 100х увеличение (по сравнению с оригиналом).

На Фигуре 2С показан участок ткани обработанной циклопамином половины псориатического поражения через 24 часа. H&E, 200х увеличение (по сравнению с оригиналом).

На Фигуре 2D показан другой участок обработанной циклопамином половины псориатического поражения через 24 часа при 400х увеличении (по сравнению с оригиналом, H&E).

На Фигуре 2Е показан участок кожи обработанной и не обработанной циклопамином соединительной области псориатического поражения через 24 часа. H&E, 200х увеличение (по сравнению с оригиналом).

На Фигуре 2А показан другой участок обработанной и не обработанной циклопамином соединительной области псориатического поражения через 24 часа при 100х увеличении (по сравнению с оригиналом, H&E). Область псориатического поражения, покрытая под аппликатором кремом циклопамина, находится в левой части фигуры (левая часть отпечатка).

На Фигуре 2G показан непораженный участок ткани с иммуногистохимически обнаруживаемым антигеном Ki-67. 400х увеличение по сравнению с оригиналом. По-видимому, Ki-67 визуализирующие клетки в эпидермисе ограничены базальным слоем.

На Фигуре 2Н показана необработанная псориатическая пораженная кожа с иммуногистохимически обнаруживаемьм антигеном Ki-67. 200х увеличение по сравнению с оригиналом. Многочисленные Ki-67 визуализирующие клетки наблюдаются в супрабазальных слоях эпидермиса.

На Фигуре 2I показан участок ткани обработанной и не обработанной циклопамином соединительной области псориатического поражения через 24 часа с иммуногистохимическим окрашиванием для определения Ki-67 антигена. Увеличение 200х. Ткань, получающая циклопамин, показана слева.

На Фигуре 2К показан окрашенный Ki-67 участок соединительной области непораженной ткани с обработанной циклопамином долей псориатического поражения через 24 часа. Увеличение 100х. Непораженная ткань показана на Фигуре слева.

На Фигуре 2L показан непораженная кожная ткань, окрашенная иммуногистохимически на эпителиальный антиген антителом Ber-ЕР4. Увеличение 100х. По-видимому, что эпидермальные клетки базального слоя визуализируют эпителиальный антиген.

На Фигуре 2М показана необработанная псориатическая пораженная кожная ткань, окрашенная иммуногистохимически на эпителиальный антиген с помощью антитела Ber-ЕР4. Увеличение 100х. По-видимому, в псориатическом пораженном эпидермисе обнаруживаемый с помощью Ber-ЕР4 эпителиальный антиген резко уменьшается до исчезновения.

На Фигуре 2N показан участок ткани обработанной циклопамином части псориатического поражения через 24 часа, окрашенный иммуногистохимически на эпителиальный антиген с помощью антитела Ber-ЕР4. Увеличение 400х. Очевидно, что эпидермальные клетки базального слоя визуализируют антиген.

На Фигуре 2O показан участок ткани обработанной и не обработанной циклопамином соединительной области псориатического поражения через 24 часа, окрашенный иммуногистохимически на эпителиальный антиген с помощью антитела Ber-ЕР4. Увеличение 100х. Область псориатического поражения, скрытая под аппликатором с кремом циклопамина, в левой части Фигуры (левая часть отпечатка).

На Фигуре 2Р показан участок соединительной области непораженной кожи с обработанной циклопамином долей псориатического поражения через 24 часа. Иммуногистохимическое окрашивание на эпителиальный антиген с помощью Ber-ЕР4 показано при 100х увеличении. Непораженная кожа находится на Фигуре слева.

На Фигуре 2R показана непораженная кожная ткань, окрашенная иммуногистохимически с помощью антитела С8/144В, который связывает человеческий антиген CD8 и цитокератин 15. Увеличение 400х.

На Фигуре 2S показан участок соединительной области непораженной кожи с необработанной пораженной кожей. Иммуногистохимическое окрашивание с помощью антитела С8/144В показано при увеличении 100х. Непораженная ткань показана на Фигуре слева.

На Фигуре 2Т показан участок ткани обработанной циклопамином доли псориатического поражения через 24 часа, окрашенный иммуногистохимически при использовании антитела С8/144В. Увеличение 400х.

На Фигуре 2U показан участок ткани соединительной области непораженной кожи с обработанной циклопамином пораженной кожей через 24 часа, окрашенный иммуногистохимически с помощью антитела С8/144В. Увеличение 100х. Непораженная кожа расположена слева на Фигуре.

На Фигуре 2V показан участок ткани необработанной псориатической пораженной кожи, окрашенный иммуногистохимически с помощью антитела МТ310, которое связывает человеческий антиген CD4. Увеличение 100х. По-видимому, происходит инфильтрация кожи большим количеством CD4 позитивных лимфоцитов.

На Фигуре 2W показан участок соединительной области обработанной и необработанной пораженной ткани через 24 часа, окрашенный иммуногистохимически с помощью антитела МТ310. Увеличение 40х. Видно исчезновение CD4 позитивных лимфоцитов из обработанной области кожи (на Фигуре слева).

На Фигурах 3А-3L показаны участки непораженной кожной ткани, необработанной пораженной кожной ткани и обработанной циклопамином пораженной кожной ткани различных пациентов (в возрасте от 29 до 57 лет и с продолжительностью болезни от 1,5 до 6 лет) с обычным псориазом.

На Фигуре 3А показана непораженная кожная ткань больного псориазом. Н&Е, 200х увеличение (по сравнению с оригиналом).

На Фигуре 3В показан участок ткани необработанной псориатической пораженной кожи того же больного, что и на Фигуре 3А. Н&Е, 200х увеличение (по сравнению с оригиналом).

На Фигуре 3С показан участок обработанного циклопамином псориатического поражения того же больного, что и на Фигуре 3А, через 24 часа после обработки Н&Е, 200х увеличение (по сравнению с оригиналом).

На Фигуре 3D показано иммуногистохимическое окрашивание на антиген Ki-67 непораженного участка кожной ткани больного обычным псориазом. Увеличение 400х.

На Фигуре 3Е показано иммуногистохимическое окрашивание на антиген Ki-67 участка ткани необработанного псориатического поражения того же больного, что и на Фигуре 3D. Увеличение 400х. Обильные Ki-67 визуализирующие клетки видны в супрабазальных слоях эпидермиса.

На Фигуре 3F показано иммуногистохимическое окрашивание на антиген Ki-67 участка ткани обработанного циклопамином псориатического поражения того же самого больного, что и на Фигуре 3D, через 24 часа обработки. Увеличение 400х. Наблюдается возвращение Ki-67 визуализирующих клеток в базальный слой эпидермиса.

На Фигуре 3G показана непораженная кожная ткань больного псориаза, окрашенная иммуногистохимически на эпителиальный антиген с помощью антитела Ber-ЕР4. Увеличение 100х.

На Фигуре 3Н показан участок необработанной псориатической пораженной кожи того же больного, что и на Фигуре 3G, окрашенный иммуногистохимически на эпителиальный антиген с использованием антигена Ber-ЕР4. Увеличение 100х.

На Фигуре 3I показан участок ткани обработанного циклопамином псориатического поражения того же больного, что и на Фигуре 3G, через 24 часа обработки, окрашенный иммуногистохимически на эпителиальный антиген с применением антитела Ber-ЕР4. Увеличение 100х.

На Фигуре 3J показана непораженная кожная ткань больного псориазом, окрашенная иммуногистохимически с помощью антитела С8/144В, которое связывает человеческий антиген CD8 и цитокератин 15. Увеличение 100х.

На Фигуре 3K показан участок ткани необработанной псориатической бляшки того же больного, что и на Фигуре 3J, окрашенный иммуногистохимически с использованием антитела С8/144В, которое связывается с человеческим CD8 антигеном и цитокератином 15. Увеличение 200х.

На Фигуре 3L показан участок ткани обработанного циклопамином псориатического поражения того же больного, что и на Фигуре 3J, после 24 часов обработки, окрашенный иммуногистохимически с помощью антитела С8/144В, которое связывается с человеческим CD8 антигеном и цитокератином 15. Увеличение 200х.

На Фигуре 4А показан внешний вид псориатического поражения (˜7×8 мм) в антекубитальной области 29-летнего мужчины перед лечением.

На Фигуре 4В показано то же самое поражение, что и на Фигуре 4А, после обработки кремом циклопамина в течение 24 часов и последующего врачебного наблюдения без обработки в течение 44 часов (через 68 часов после начала лечения).

На Фигуре 4С показано псориатическое поражение (˜9×11 мм) в дельтовидной области 29-летнего мужчины перед обработкой.

На Фигуре 4D показано то же самое поражение, что и на Фигуре 4С, через 68 часов обработки предварительно смешанным кремом, содержащим равные объемы крема циклопамина и крема препарата клобетазол-17-пропионата (0.5 мг/г).

На Фигуре 4Е показано псориатическое поражение (˜11×12 мм) в подреберной области 29-летнего мужчины после 48-часовой обработки кремом препарата клобетазол-17-пропионат (0.5 мг/г).

На фигуре 4F показано то же самое поражение, что и на Фигуре 4Е, через 24 часа после замены лечения клобетазол-17-пропионатом (0.5 мг/г) на лечение кремом циклопамина.

На Фигуре 4G показана непораженная кожная ткань с обнаруживаемым иммуногистохимическими методами EGFR. Видно, что EGFR визуализирующие клетки в эпидермисе ограничены базальным слоем. Увеличение 200х.

На Фигуре 4Н показана необработанная псориатическая пораженная кожная ткань с обнаруживаемым иммуногистохимически EGFR. Видно, что супрабазальные клетки в пораженном эпидермисе заметно повышают экспрессию EGFR. Увеличение 200х.

На Фигуре 4I показана псориатическая пораженная кожная ткань, которую перед эксцизией в течение 24 часов обрабатывали кремом циклопамина, а затем окрашивали иммуногистохимически на EGFR. Видно, что выявляющие EGFR клетки в эпидермисе ограничены базальным слоем. Увеличение 200х.

Описание изобретения

Настоящее изобретение относится к применению циклопамина, природного стероидного алкалоида, известного в течение тридцати лет, для лечения псориаза и достижения быстрого очищения кожи больного от псориатических поражений в течение дня без заметных побочных эффектов. Исчезновение клинических признаков псориаза, включая эритему и чешуйки, с кожи пациентов сопровождается возвращением гистопатологических признаков псориаза к нормальным и достигается местной обработкой. Последующее врачебное наблюдение за обработанными участками кожи показывает, что кожа выглядит здоровой, имеет нормальный вид в течение месяцев. Эти особенности делают циклопамин в высшей степени желательным для лечения псориаза и обеспечивает решение стоящей в течение длительного времени задачи лечения псориаза.

Для местного применения циклопамин можно растворять в этаноле или в другом подходящем растворителе и смешивать с соответствующей основой крема, мази или геля. Циклопамин может также входить в состав гидрогелей или других фармацевтических форм, допускающих контролируемое высвобождение, и может абсорбироваться на кожных пластырях. Результаты, изображенные на Фигурах 1A-1F (клиническая картина) и на Фиг.2А-2W, 3A-3L (гистопатологические и иммуногистохимические результаты), достигнуты в результате применения препарата, полученного при смешении раствора циклопамина в этаноле с основой крема таким образом, чтобы достичь конечной концентрации 18 мМ циклопамина в креме. Используемая кремовая основа состоит, главным образом, из тяжелого парафинового масла (10 вес. части), вазелина (10 вес. части), стеарилового спирта (8 вес. частей), полиоксистеарата-40 (3 вес. части) и воды (68 вес. части), но возможна также кремовая основа, приготовленная другим подходящим способом. На оптимальную концентрацию циклопамина в фармацевтической форме, а также оптимальные дозы и схемы применения, очевидно, могут влиять такие факторы, как конкретная фармацевтическая форма и локализация и характеристики кожного поражения; однако, их можно определить следующими хорошо известными опубликованными методами оптимизации. Дозировка и схемы применения для лечения поражения, показанного на Фиг.1А (псориатическая бляшка на тыльной поверхности руки) следующие: ˜30 мл крема наносят непосредственно на поражение с помощью стального шпателя каждые четыре часа в течение 24 часов. Поверхность с нанесенным кремом защищают от случайного смазывания и утраты крема, накрывая алюминиевым аппликатором (Фиг.1В). Дозировка и схемы применения для лечения поражения, показанного на Фиг.1D (псориатическая бляшка в лопаточной области), следующие: ˜30 мл крема наносят непосредственно на поражение каждые четыре часа в течение 24 часов. Поверхность с нанесенным кремом аналогичным образом накрывают от случайного смазывания и утраты крема. Другие проходящие лечение пациенты и подвергаемые лечению поражения получают ˜30-35 мл крема на каждое поражение каждые 3-5 часов, когда это удобно. Нанесение крема плацебо (кремовая основа, смешанная с этанолом без добавления циклопамина) на псориатические бляшки, сравнимые по площади с обрабатываемыми циклопамином псориатическими бляшками, проводят при тех же дозах, по той же схеме и с накрыванием поражений; в случае обрабатываемых плацебо псориатических бляшек не видно заметного эффекта или регрессии (данные не показаны). Сохранение недифференцированных клеток в нормальном эпидермисе и в волосяных фолликулах после экспозиции с циклопамином, как описано нами в более ранней патентной заявке (Tas S. et al (2001), заявка РСТ/TR 01/00027), а также в данном изобретении, дает информацию о переносимых дозах при других возможных способах применения циклопамина; например, при инъекциях внутрь поражения или наложении подходящих кожных пластырей и препаратов пролонгированного действия.

На Фиг.1А и 1C показана псориатическая бляшка до и после экспозиции с циклопамином и быстрая клиническая регрессия. Крем циклопамина наносят на проксимальную часть этого поражения на тыльной стороне правой руки 57-летнего больного, страдающего бляшечным псориазом. С интервалам 4 часа наносят ˜30 мкл крема непосредственно на область поражения и покрытый кремом участок закрывают от случайного смазывания и утраты крема (Фиг.1В). Уже после 4-часовой обработки на покрытом кремом участке псориатической бляшки видно небольшое уменьшение эритемы. Через 12 часов эритема более не видна на участке поражения с нанесенным циклопамином, а через 24 часа, когда эритема и чешуйки исчезают с обработанного циклопамином участка (Фиг.1C), поверхность кожи, соответствующую всей области поражения (как обработанную, так и необработанную половины), иссекают вместе с пограничным участком окружающей непораженной кожи размером ˜5 мм.

На Фигурах 2A-2W показаны результаты гистопатологического и иммуногистохимического исследования участков ткани непораженной кожи, обработанной циклопамином пораженной кожи и необработанной пораженной кожи. Видно, что по сравнению с непораженной кожей (Фиг.2А) необработанная пораженная кожа (Фиг.2В) проявляет типичные гистопатологические признаки псориатического кожного поражения, указанные выше в разделе "Предпосылки создания изобретения". Однако участки ткани обработанной циклопамином половины первоначального поражения показывают резкое улучшение и возвращение к нормальному состоянию. Эти гистопатологические признаки возвращения к нормальному состоянию, примеры которых показаны на Фиг.2С и 2D (примеры других обрабатываемых циклопамином поражений приведены ниже), включают следующее:

Возвращение утолщенных и удлиненных выступов сети до нормального уровня и заметное уменьшение эпидермальной гиперплазии (Фиг.2С в сравнении с Фиг.2В).

Возвращение истонченного супрапапиллярного эпидермиса в нормальное состояние и исчезновение папиллярного отека (Фиг.2С в сравнении с Фиг.2В).

Интенсивное восстановление гранулярного слоя эпидермиса в эпидермисе, обработанном циклопамином (Фиг.2С и 2D), контрастирует с локально уменьшенным или утраченным гранулярным слоем в необработанном пораженном эпидермисе (Фиг.2В).

Исчезновение на обработанной циклопамином пораженной коже большей части воспалительных клеток, которые вызывают инфильтрацию субэпидермальной дермы необработанной кожи (Фиг.2С в сравнении с Фиг.2В).

Гиперкератоз и паракератоз, наблюдаемый в stratum corneum (роговом слое) необработанной пораженной кожи (Фиг.2В), понижен, но полная нормализация этого самого старого эпидермального слоя не происходит через 24 часа обработки циклопамином (Фиг.2С, Фиг.2D).

Участки ткани соединительной области обработанной и не обработанной циклопамином пораженной кожи показывают, что области пораженной кожи, которые получали сравнительно более низкие концентрации циклопамина (за счет диффузии из рядом расположенной обработанной области), все же проявляют признаки возвращения к нормальному состоянию, но менее явные (Фиг.2Е и Фиг.2F).

Описанные выше релевантные иммуногистохимические результаты изучения тканей суммированы ниже и приведены в качестве примеров на Фигурах 2G-2W. Все антитела и реагенты для этих иммуногистохимических исследований получают от DAKO (Glostrup. Denmark); человеческий Ki-67 антиген обнаруживают с помощью моноклонального антитела М7187, человеческий эпителиальный антиген обнаруживают с помощью моноклонального антитела Ber-ЕР4, человеческий антиген CD4 обнаруживают при использовании моноклонального антитела М0716, человеческий антиген CD8 с помощью моноклонального антитела С8/144В. Известно, что, помимо антигена CD8, моноклональное антитело С8/144В распознает и связывает цитокератин 15, экспрессируемый стволовыми клетками волос (Kanitakis J. et al. (1999) Eur. J. Dermatol. 9:363-365). Для визуализации реакций используют "универсальный набор для визуализации" DAKO (LSAB2), использующий биотинилированное вторичное антитело и стрептавидин, конъюгированный с пероксидазой (предварительно разбавленный, чтобы соответствовать разбавлению поставляемых DAKO первичных антител). Соблюдаются все условия реакции, рекомендованные производителем.

Антиген Ki-67 является маркером пролиферирующих клеток. Как показано на Фиг.2G, Ki-67 выявляющие клетки ограничены в основном базальным слоем эпидермиса непораженной кожи. С другой стороны, на участках необработанной пораженной кожи наблюдается повышенное количество Ki-67 позитивных клеток в эпидермисе и множество Ki-67 позитивных клеток в супрабазальных слоях эпидермиса (Фиг.2Н), что хорошо известно для псориаза. На Фиг.2I показан возврат до нормального состояния как частоты, так и положения в эпидермисе антиген Ki-67-позитивных клеток на обработанном циклопамином пораженном участке. На участках ткани соединительных областей обработанной циклопамином пораженной кожи с необработанной пораженной кожей (Фиг.2J) и с непораженной кожей (Фиг.2K) также видно действие циклопамина, нормализующее частоту и эпидермальное положение Ki-67 - позитивных клеток, а также очевидна зависимость действия циклопамина от концентрации.

Известно, что моноклональное антитело Ber-ЕР4 метит клетки базального слоя в нормальном эпидермисе. Также известно, что Ber-ЕР4 метит внешнюю оболочку корней волосяных фолликул, в которой, как полагают, расположены стволовые клетки волос. На Фиг.2b видно, что непораженная кожа показывает нормальный характер мечения с помощью Ber-ЕР4 (т.е. Ber-ЕР4 метит клетки базального слоя). С другой стороны, в необработанном псориатическом пораженном эпидермисе наблюдается отсутствие мечения базального слоя с помощью Ber-ЕР4 в тех же условиях (Фиг.2М). Эта выявляемая с помощью Ber-ЕР4 аномальность клеток базального слоя в псориатическом пораженном эпидермисе, насколько нам известно, ранее не была описана, превращается в нормальное состояние при обработке поражения циклопамином (Фиг.2N).

На Фиг.2O показан окрашенный Ber-ЕР4 участок ткани обработанной и не обработанной циклопамином соединительной области псориатического поражения. Нормализующее действие циклопамина на псориатическое поражение на расстоянии предполагает чувствительность аномальности, обнаруживаемой с помощью Ber-ЕР4, к циклопамину. Ранее было найдено, что экспозиция базальных клеток карциномы с циклопамином вызывает их дифференцировку и исчезновение их окрашивания с помощью Ber-ЕР4 (Tas S. et al (2001), заявка РСТ/TR 01/00027). Однако базальные клетки нормального эпидермиса, экспонированные с циклопамином в тех же условиях, продолжают оставаться Ber-ЕР4-позитивными (Tas S. et al (2001), заявка PCT/TR 01/00027). На Фиг.2Р показано, что базальные клетки непораженной кожи при псориазе также остаются Ber-ЕР4-позитивными после экспозиции с циклопамином; характеристики базальных клеток сохраняются.

Цитокератин 15, распознаваемый антителом С8/114В, обычно обнаруживают как в волосяных фолликулах, так и в клетках базального слоя в нормальном эпидермисе (Kanitakis J. et al. (1999) Eur. J. Dermatol. 9:363-365). На Фиг.2R показано мечение клеток базального слоя с помощью С8/144В на непораженном участке коже. Напротив, клетки базального слоя необработанной псориатической пораженной кожи окрашиваются очень слабо или совсем не окрашиваются антителом С8/144В (Фиг.2S). С другой стороны, клетки базального слоя эпидермиса на обработанной циклопамином половине пораженной кожи нормализуются и становятся восприимчивыми к мечению с помощью антитела С8/144В (Фиг.2Т). И С8/144В, и Ber-ЕР4 обнаруживают клетки внешней оболочки корней и нормальные клетки базального слоя эпидермиса, поэтому аномальность базальных клеток, выявляемая с помощью этих двух антител в псориатическом пораженном эпидермисе, может быть близкой или идентичной. Циклопамин не оказывает вредного действия на непораженную кожу и, так же, как в случае с Ber-ЕР4, базальные клетки непораженного эпидермиса, которые были экспонированы с циклопамином, остаются позитивными в отношении цитокератина 15 (Фиг.2U).

Инфильтрацию дермы CD4 - позитивными лимфоцитами, общеизвестную особенность псориатических бляшек, визуализируется на необработанной псориатической пораженной коже (Фиг.2V). С другой стороны, обработанная циклопамином половина пораженной кожи в значительной степени очищена от СD4-позитивных лимфоцитов, вызывающих инфильтрацию псориатической пораженной кожи (Фиг.2W).

Генетическая гетерогенность и различный возраст больных псориазом, а также гетерогенность локализации псориатических поражений на поверхности тела побуждает оценить применение циклопамина для лечения различных пациентов и поражений. В данном изобретении лечение различных больных в возрасте от 29 до 57 лет и псориатических поражений, локализованных на различных участках поверхности тела, от конечностей до туловища, показывает, что циклопамин высокоэффективен в отношении каждого псориатического поражения, для лечения которого он используется, и вызывает регрессию и очищение (7 отдельных поражений различных пациентов прошли лечение во время написания этой заявки (изобретения)). На Фиг.1D, 1Е и 1F показано, что даже когда циклопамин применяют в течение дня, а затем применение его прекращают, псориатические бляшки, которые подвергались лечению, продолжают регрессировать и полностью очищаются. В данном конкретном случае псориатическая бляшка визуализирует уменьшенную эритему через 12 часов обработки. Несмотря на заметную регрессию, она все еще заметна на четвертый день последующего врачебного наблюдения. Поражение очищается после 8 дня, и через месяц последующего наблюдения, во время написания этой заявки (изобретения) место обработанного поражения выглядит как нормальная кожа. Циклопамин, наносимый местно на здоровую кожу, как описано в данном изобретении и ранее (Tas S. et al (2001), заявка РСТ/TR 01/00027), не оказывает заметного вредного действия. Самое продолжительное время последующего врачебного наблюдения на предмет возможного побочного (вредного) действия циклопамина на здоровую кожу составляет 14 месяцев, во время написания этой заявки, и не было замечено никакого вредного эффекта.

На Фигурах 3С-3L показаны участки ткани непораженной кожи, необработанной псориатической пораженной кожи и обработанной циклопамином пораженной кожи различных пациентов (иных пациентов, нежели описанных с помощью Фиг.2A-2W), эти Фигуры иллюстрируют дополнительные примеры применения и результаты применения настоящего изобретения.

На Фиг.3А, 3В и 3С показаны гистопатологические результаты, полученные в случае непораженной кожной ткани, необработанной псориатической пораженной ткани и обработанной циклопамином псориатической пораженной ткани через 24 часа обработки; эти фигуры являются примером вызванной циклопамином регрессии псориатической бляшки у больного.

На Фиг.3D, 3Е и 3F показано иммуногистохимическое окрашивание на антиген Ki-67 непораженной кожной ткани, необработанной псориатической пораженной ткани и обработанной циклопамином псориатической пораженной ткани через 24 часа обработки; эти фигуры иллюстрируют пример вызванной циклопамином регрессии другой псориатической бляшки.

На Фиг.3G, 3Н и 3I показано иммуногистохимическое окрашивание с применением антитела Ber-ЕР4 непораженной кожной ткани, необработанной псориатической пораженной ткани и обработанной циклопамином псориатической пораженной ткани через 24 часа обработки; эти фигуры на примере другого больного иллюстрируют обнаруживаемую с помощью Ber-ЕР4 аномальность клеток базального слоя в псориатической пораженной коже, а также стимулированное циклопамином возвращение к нормальному состоянию.

На Фиг.3J, 3K и 3L показано иммуногистохимическое окрашивание при использовании антитела С8/144В непораженной кожной ткани, необработанной псориатической пораженной ткани и обработанной циклопамином псориатической пораженной ткани через 24 часа обработки; эти фигуры иллюстрируют пример обнаруженной с помощью С8/144В аномальности клеток базального слоя псориатической пораженной кожи, а также стимулированное циклопамином возвращение к нормальному состоянию.

В исследованиях, опубликованных ранее данного изобретения, сообщается о блокировании клеточной дифференцировки циклопамином и предполагается, что циклопамин можно использовать для предупреждения дифференцировки (Detmer К. et al. (2000) Dev. Biol. 222:242; Berman D.M. et al. (2000) J. Urol. 163:240). Однако мы нашли, что экспозиция псориатических пораженных клеток с циклопамином скорее индуцирует дифференцировку эпидермальных клеток. Восстановление гранулярного слоя эпидермиса обработанной циклопамином псориатической пораженной кожи показывает, что блокирование дифференцировки в псориатической бляшке ослабляется (преодолевается) при обработке циклопамином. Не желая связывать себя какой-либо конкретной теорией, мы полагаем, что результаты данного изобретения по экспрессии Ki-67 антигена эпидермальными клетками в обработанной циклопамином псориатической пораженной коже могут быть также связаны с индукцией дифференцировки циклопамином. Исчезновение пролиферирующих клеток из супрабазальных слоев псориатического пораженного эпидермиса после экспозиции с циклопамином (Фиг.2Н по сравнению с Фиг.2I и Фиг.3Е по сравнению с Фиг.3.F) может быть важным (логически вытекающим) для возвращения возможности конечной дифференцировки. Вне зависимости от точного механизма, возвращение сверхпролиферативной активности псориатического пораженного эпидермиса до нормального уровня после экспозиции с циклопамином само по себе является полезным (имеет терапевтическую ценность).

Быстрое очищение псориатических бляшек, как описано в данном изобретении (в течение дня) можно сравнить с (в среднем) 6-8 неделями, требующимися для лечения обычными лекарственными средствами для достижения эффекта (Al-Suwaidan S.N. et al. (2000) J. Am. Acad. Dermatol. 42:796-802; Lebwohl M. et al. (2001) J. Am. Acad. Dermatol. 45:649-661). Следовательно, способ лечения, представленный в данном описании, представляет собой значительное усовершенствование и дает решение задачи, стоявшей длительное время. Кроме того, быстрота реакции на циклопамин предполагает вмешательство в первичное или ближайшее вызывающее болезнь событие, включенное в образование псориатической бляшки.

Так как существует доказательство включения пути сигнальной трансдукции белка hedgehog/smoothened в сохранение эпидермальных стволовых клеток, неблагоприятное побочное действие циклопамина на кожу, возможное a priori, должно быть исключено. Как указано ранее в данном описании (Tas S. et al (2001), заявка PCT/TR 01/00027), при описанных условиях (концентрациях и дозировках) не отмечено никаких побочных эффектов. Отсутствие обнаруживаемых побочных эффектов в описываемом лечении в сочетании с недостижимой до настоящего времени высокой (местной) эффективностью при местном применении дает решение терапевтической дилеммы, а именно: активное применение обычных лекарственных средств часто приводит к неприемлемым побочным эффектам, но их менее активное применение может привести к тому, что у больного останутся его/ее псориатические поражения (Al-Suwaidan S.N. et al. (2000) J. Am. Acad. Dennatol. 42:796-802).

Дополнительные примеры

На Фиг.4А показана псориатическая бляшка в антекубитальной области у 29-летнего мужчины перед лечением. Крем циклопамина (˜20 мкл циклопамина, 18 мМ на кремовой основе, описанной выше) наносят на это поражение каждые четыре часа в течение 24 часов. Затем лечение прерывают и за поражением продолжают наблюдать. Через восемь часов обработки замечают уменьшение эритемы, а далее, также при наблюдении без обработки, продолжающаяся регрессия на третий день приводит к состоянию, показанному на Фиг.4 В, и на четвертый день поражение не обнаруживается.

На Фиг.4С показана другая псориатическая бляшка, локализованная на коже дельтовидной области того же самого пациента, перед началом лечения. Крем циклопамина наносят на это поражение вместе с кортикостероидным кремом (клобетазол-17-пропионат, 0.5 мг/г). С этой целью два крема предварительно смешивают в пропорциях по ¹/₂ объема каждый и ˜20 мкл смеси наносят на поражение каждые четыре часа. Это поражение также показывает уменьшение эритемы через восемь часов и становится невидимым на третий день (на Фиг.4D показан внешний вид этого поражения через 68 часов). Другие псориатические поражения у того же больного, которые покрывают одним кортикостероидным кремом, не показывают заметного изменения за тот же самый период. Быстрая реакция на циклопамин, даже при половинной концентрации, в сочетании с кортикостероидом побуждает проверить (оценить) эту комбинацию в применении к дополнительным псориатическим поражениям кожи. На Фиг.4Е показана псориатическая бляшка в подреберной области того же самого больного перед нанесением циклопамина. Это поражение обрабатывают одним кортикостероидным кремом в течение 48 часов, затем применение кортикостероида прекращают и заменяют на аппликации ˜20 мкл крема циклопамина (18 мМ циклопамина на кремовой основе) каждые четыре часа. На Фиг.4F показано поражение через 24 часа после начала нанесения крема циклопамина, видно почти полное ичезновение поражения к этому времени.

Следовательно, хотя один крем циклопамина вызывает регрессию и очищение кожи от псориатических поражений со скоростью, значительно более высокой, чем обычные лекарственные средства, возможно дополнительное ускорение терапевтического ответа, когда циклопамин применяют вместе с местными кортикостероидами или после кратковременного применения местных кортикостероидов. Эта особенность повышает клиническую полезность терапии циклопамином и может, частично, быть связана с противовоспалительными свойствами кортикостероидов. Вклад воспалительных клеток и цитокинов в развитие псориатических поражений хорошо известен (Krueger J.G. et al. (1990) J. Invest. Dermatol. 94:1358-1408), и они могут поддерживать патологический цикл при псориазе. Известно, что экспрессия как рецептора фактора роста эпидермальных клеток (EGFR), так и одного или более его лигандов (например, трансформирующегося фактора роста Альфа) заметно возрастает в псориатическом пораженном эпидермисе. Это может восстановить петлю аутокринной стимуляции, на что дополнительно влияет вызванное болезнью увеличение эпидермального EGFR за счет воспаления (Krueger J.G. et al. (1990) J. Invest. Dermatol. 94:1358-1408). Однако необычайно быстрая терапевтическая реакция на один крем циклопамина (но не на один кортикостероид) и действительно продолжительная регрессия псориатических поражений после прекращения аппликаций циклопамина согласуются с эффективным вмешательством циклопамина (но не кортикостероидов) в важные (ключевые)/ближайшие патогенные события. Так как сверхэкспрессия EGFR в супрабазальных слоях псориатического пораженного эпидермиса может восстановить петлю аутокринной стимуляции и так как возвращение экспрессии EGFR в базальный слой рассматриваемого эпидермиса является одним из первых признаков эффективного лечения псориаза различными методами (King L.E. Jr. et al. (1990), J. Invest. Dermatol. 95:108-128), то предпринята оценка реакции экспрессии EGFR на лечение циклопамином по отпечаткам (снимкам). Для этой цели в качестве первичного антитела используют мышиное моноклональное антитело EGFR. 113 (Novocastra Labs. Ltd. U.K.) против человеческого EGFR и иммуногистохимический анализ проводят в соответствии с рекомендациями производителя. На Фиг.4I показано, что нанесение крема циклопамина на псориатические поражения вызывает быструю нормализацию экспрессии EGFR и что обнаруживаемый иммуногистохимическим методом EGFR снова ограничивается, в основном, базальным слоем эпидермиса через 24 часа обработки (Фиг.4I). Отпечаток с экспрессией EGFR после обработки поражения циклопамином (Фиг.4I) неотличим от отпечатка с экспрессией EGFR, наблюдаемой на непораженной коже (Фиг.4G). С другой стороны, отпечаток с псориатической пораженной кожей, обработанной кремом плацебо (на кремовой основе, не содержащей циклопамина), продолжает оставаться заметно контрастирующим патологическим отпечатком и показывает наличие сверхэкспрессии EGFR в супрабазальных слоях эпидермиса (Фиг.4Н). Следовательно, лечение оказывает быстрый терапевтический эффект на псориатические поражения также по критерию экспрессии EGFR (King L.E. Jr. et al. (1990), J. Invest. Dermatol. 95:108-128).

Данное изобретение относится к применению циклопамина для лечения псориаза и для изготовления лекарственного препарата с концентрацией циклопамина 18 мМ для индуцирования дифференциации псориатически пораженных эпидермальных клеток кожи. Изобретение отличает достижение быстрой очистки кожи больных от псориатических повреждений без заметных побочных эффектов. Исчезновение клинических признаков псориаза, включая эритему и чешуйки, с кожи больных сопровождается возвращением гистопатологических признаков в нормальное состояние и достижимо при местном применении в течение дня. Другой особенностью применения циклопамина является отсутствие вредного эффекта на здоровую кожу на протяжении 14 месяцев врачебного наблюдения. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 4 ил.

1. Применение циклопамина или его фармацевтически приемлемой соли для изготовления лекарственного препарата для лечения псориаза.2. Применение циклопамина или его фармацевтически приемлемой соли для изготовления лекарственного препарата с концентрацией циклопамина 18 мМ для индуцирования дифференциации псориатически пораженных эпидермальных клеток кожи.3. Применение по любому из п.1 или 2, отличающееся тем, что указанный препарат готовят в виде фармацевтической формы пролонгированного действия.4. Применение по любому из п.1 или 2, отличающееся тем, что указанный препарат готовят в виде крема, или мази, или геля, или гидрогеля.5. Применение по любому из п.1 или 2, отличающееся тем, что указанный препарат готовят в виде крема.