ЛЕЧЕНИЕ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ КОЖИ Российский патент 2018 года по МПК A61K38/48 A61P17/06 

Область техники

Настоящее изобретение относится к поражениям кожи, которые характеризуются гиперпролиферацией кератиноцитов, включая, но не ограничиваясь им, псориаз, а также к лечению указанных поражений.

Уровень техники

Ссылка на какой-либо источник из предшествующего уровня техники в настоящем описании не является подтверждением (и ее не следует воспринимать в данном качестве) или какой-либо другой формой указания на то, что данный источник из предшествующего уровня техники образует часть общего знания в Австралии или в любой другой юрисдикции, или что данный предшествующий уровень техники мог бы рассматриваться как доказанный, понятный и релевантный специалистом в данной области техники.

Псориаз, наиболее ярко выраженное аутоиммунное заболевание, является по своей природе хроническим и рецидивирующим. Псориаз характеризуется нарушением барьерной функции, гиперпролиферацией эпидермальных кератиноцитов и резко выраженной инфильтрацией воспалительных клеток.

Данные, полученные в последнее время, свидетельствуют, что несмотря на то, что воспалительные Т-клетки непосредственно связаны с данным заболеванием, ключевой движущей силой развития патогенного воспаления при псориазе являются кератиноциты, которые отвечают на совокупность интерлейкинов (ИЛ)-1, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-17, интерферона (ИФН)γ и ФНОα (1, 2) и в которых происходит активация ядерного фактора NF-кВ, сигнальной молекулы, которая поддерживает иммунный гомеостаз эпидермальных кератиноцитов (3,4).

Способ лечения псориаза отсутствует. Лекарственные средства для местного применения, светолечение, традиционные лекарственные средства системного действия и биологические препараты представляют собой средства исключительно для управления симптомами псориаза. Часто, для случаев псориаза средней и высокой степени тяжести и для достижения положительного долговременного результата, который требует приверженности лечению, необходимо применение комбинации лекарственных средств (5).

Как правило, локализованным заболеванием (которое охватывает 10% площади поверхности тела) управляют с помощью лекарственных средств для местного применения, тогда как большие площади поражения требуют применения светолечения или системной терапии. Заболевание, локализованное на ладонях и подошвах, часто лечат системным способом, поскольку кожа в данных областях утолщена и не восприимчива к средствам для местной терапии.

Средства для местного лечения включают кортикостероиды, такие как клобетазол, а также аналоги витамина D, такие как кальцитриол или кальципотриен (6, 7). Кортикостероиды действуют посредством уменьшения воспаления, подавления митотической активности и стимулирования вазоконстрикции в целевых областях. Механизм действия аналогов витамина D до конца не установлен, но предполагают, что данные средства регулируют пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов (6). Таким образом, оба способа лечения включают ингибирование пролиферации клеток, хотя данное ингибирование является неспецифическим.

Кортикостероиды для местного применения могут вызывать атрофию кожи, раздражение и сухость пораженной области. Аналоги витамина D, как правило, являются безопасными, но могут вызывать раздражение; помимо этого, при применении данных средств в очень высоких дозах существует риск развития гиперкальцемии (8).

При экстенсивном псориатическом заболевании применяют светолечение или средства для системного лечения. Первоочередное лечение экстенсивной формы псориаза осуществляют ультрафиолетовым светом, таким как УФВ и УФА. Однако данный тип лечения связан с высоким риском возникновения ожогов и рака кожи, особенно у пациентов с более светлым цветом кожи. Если терапия УФ-светом оказалась неэффективной, можно также применять низкие дозы метотрексата. Метотрексат является умеренно эффективным средством для контроля псориаза, однако применение метотрексата существенно ограничено в связи с его значительным токсическим действием.

По мере увеличения количества знаний об иммунной природе заболевания в случаях псориаза средней и высокой степени тяжести успешно применяли биологические лекарственные средства, мишенью которых являются Т-лимфоциты, ФНОα, ИЛ-12 и ИЛ-23, (8). Три широко используемых ингибитора ФНО включают препараты Энбрел (Enbrel) (этанерцепт; etanercept), Хумира (Humira) (адалимумаб; adalimumab) и Ремикейд (Remicade) (инфликсимаб; infliximab). Выход на рынок устекинумаба (ustekinumab), нового лекарственного средства, мишенью которого являются ИЛ-12 и ИЛ-23, был одобрен в 2009 году. Профили эффективности и безопасности данного препарата аналогичны профилям эффективности и безопасности средств против ФНО (9).

Биологические лекарственные средства обладают значительными преимуществами по сравнению со средствами для системной терапии, которые были доступны ранее, однако клинические исследования данных лекарственных средств продемонстрировали, что при долговременном применении активность таких соединений сопровождается некоторым количеством недостатков (10-11). Во-первых, у пациентов с латентной инфекцией, вызванной туберкулезной микобактерией (ТБ), вскоре после начала лечения инфликсимабом может развиться активная форма ТБ. Помимо этого, пациенты, которым вводят ингибитор ФНО, подвержены высокому риску возникновения оппортунистических грибковых инфекций, таких как легочный и диссеминированный гистоплазмоз, кокцидиоидомикоз и бластомикоз. Во-вторых, определенным вариантам лечения свойственен высокий дозозависимый риск возникновения злокачественных новообразований, в том числе лимфомы и рака кожи. В-третьих, часть пациентов не отвечает на данные лекарственные средства или не поддерживает первоначальный ответ. Доступность биологических лекарственных средств также ограничена в связи с их высокой стоимостью.

Активированный протеин С (АПС) вызывает экспрессию антиапоптотических генов bcl-2 и МШВ человека. На основании данной антиапоптотической функции АПС предлагали применять для уменьшения апоптоза при широком диапазоне состояний, при которых апоптоз является предметом беспокойства, в том числе при широком диапазоне орган-специфичных и неспецифичных воспалительных заболеваний, аутоиммунных заболеваний, новообразований и инфекционных заболеваний. Примечательно, что применение АПС при данных состояниях рекомендовано не для лечения всех симптомов заболевания, а лишь для уменьшения апоптоза (см. заявку WO 2001/072328).

Более того, многие специалисты в данной области техники считают, что антиапоптотическое действие, например, предложенное в заявке WO 2001/072328, делает АПС неприменимым для лечения поражений, при которых имеет место нарушение регуляции пролиферации клеток, в особенности поражений, в которые вовлечена гиперпролиферация кератиноцитов. В частности, известно, что АПС препятствует индуцируемой кальцием гибели клеток посредством предотвращения апоптоза клеток; помимо этого, АПС обладает мощным стимулирующим действием на пролиферацию кератиноцитов, а также способствует жизнеспособности, росту и миграции кератиноцитов аутокринным способом посредством ЭРПС (эндотелиального рецептора протеина С), рецептора эпидермального фактора роста и активации ERK1/2 (17, 20).

Таким образом, существует потребность в новых подходах и вариантах терапии для лечения или для уменьшения прогрессии или симптомов заболевания или поражения, которое характеризуется гиперпролиферацией кератиноцитов, например, псориаза.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение направлено на устранение одной или нескольких из вышеуказанных проблем и ограничений. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложены способы лечения поражения кожи, которое характеризуется присутствием гиперпролиферативных кератиноцитов, у индивидуума, которые включают:

обеспечение индивидуума, имеющего область кожи, которая характеризуется присутствием гиперпролиферативных кератиноцитов;

осуществление контакта указанной области кожи с терапевтически эффективным количеством активированного протеина С (АПС);

и в результате чего осуществляют лечение указанного поражения кожи у указанного индивидуума.

Согласно другим вариантам реализации в настоящем изобретении предложен способ лечения псориаза у индивидуума, причем указанный способ включает:

обеспечение индивидуума, имеющего псориатическую бляшку;

нанесение композиции, содержащей терапевтически эффективное количество активированного протеина С (АПС), на указанную бляшку;

и в результате чего осуществляют лечение псориаза у указанного индивидуума.

Согласно другим вариантам реализации в соответствии с настоящим изобретением предложен способ лечения акне у индивидуума, причем указанный способ включает:

обеспечение индивидуума, имеющего акне;

нанесение композиции, содержащей терапевтически эффективное количество активированного протеина С (АПС), на акне;

в результате чего осуществляют лечение акне у индивидуума.

Согласно другим вариантам реализации в соответствии с настоящим изобретением предложен способ лечения атопического дерматита у индивидуума, причем указанный способ включает:

обеспечение индивидуума, имеющего атопический дерматит;

нанесение композиции, содержащей терапевтически эффективное количество активированного протеина С (АПС), на атопический дерматит или на область тела, которая содержит атопический дерматит;

в результате чего осуществляют лечение атопического дерматита у указанного индивидуума.

Согласно другим вариантам реализации в соответствии с настоящим изобретением предложен способ лечения гангренозной пиодермии у индивидуума, причем указанный способ включает:

обеспечение индивидуума, имеющего гангренозную пиодермию;

нанесение композиции, содержащей терапевтически эффективное количество активированного протеина С (АПС), на гангренозную пиодермию или на область тела, которая содержит гангренозную пиодермию;

в результате чего осуществляют лечение гангренозной пиодермии у указанного индивидуума.

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен способ стимулирования ранозаживления или регенерации ткани в области кожи, имеющей поражение, которое характеризуется гиперпролиферацией кератиноцитов, причем указанный способ включает:

обеспечение индивидуума, у которого присутствует область кожи, имеющая поражение, которое характеризуется присутствием гиперпролиферативных кератиноцитов;

осуществление контакта указанной области кожи с терапевтически эффективным количеством активированного протеина С (АПС);

в результате чего осуществляют стимулирование ранозаживления или регенерации ткани в указанной области кожи.

Согласно следующим вариантам реализации в соответствии с настоящим изобретением предложена композиция, содержащая терапевтически эффективное количество АПС, для применения для уменьшения поражения кожи, которое характеризуется присутствием гиперпролиферативных кератиноцитов, или для лечения псориаза, акне или атопического дерматита у индивидуума.

Согласно следующим вариантам реализации в соответствии с настоящим изобретением предложено применение АПС для получения лекарственного средства для уменьшения поражения кожи, которое характеризуется присутствием гиперпролиферативных кератиноцитов, или для лечения псориаза, акне или атопического дерматита у индивидуума.

Согласно следующим вариантам реализации в настоящем изобретении предложено применение АПС для уменьшения поражения кожи, которое характеризуется присутствием гиперпролиферативных кератиноцитов, или для лечения псориаза, акне или атопического дерматита у индивидуума.

Согласно следующим вариантам реализации в соответствии с настоящим изобретением предложен набор, включающий композицию, содержащую терапевтически эффективное количество АПС и письменную инструкцию для применения АПС в способе лечения поражения, которое характеризуется присутствием гиперпролиферативных кератиноцитов, или для лечения псориаза, акне или атопического дерматита у индивидуума, в указанном способе, который описан в настоящей заявке.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. (А) Неонатальные кератиноциты крайней плоти человека предварительно обрабатывали АПС в течение 4 ч, затем клетки инкубировали с ФНОα в течение 72 часов. Степень пролиферации клеток определяли с применением анализа МТТ. *Р<0,05, **Р<0,01 по сравнению с соответствующим контролем. (В) Действие АПС на рост нормальных дермальных фибробластов мыши (ДФМ), нормальных дермальных фибробластов человека (ДФЧ) и синовиальных фибробластов человека, страдающего от ревматоидного артрита (РСФ, красным цветом), анализировали с применением анализа на основе кристаллического фиолетового (среднее значение ± стандартное отклонение, N=4, отдельные эксперименты *, , # р<0,01 по сравнению с соответствующим контролем, дисперсионный анализ ANOVA. (С) РФС обрабатывали АПС в течение 24 ч. р21 и р27 определяли методом вестерн-блоттинга.

Фигура 2. Экзогенный или эндогенный АПС стимулирует пролиферацию и предотвращает апоптоз культивируемых кератиноцитов. А) Степень пролиферации определяли с применением анализа МТТ, данные выражали в виде процента пролиферации клеток по сравнению с контролем. В) Степень пролиферации кератиноцитов, которую определяли с применением анализа МТТ, через 72 ч после обработки миРНК ПСи АПС. Степень пролиферации клеток выражали в виде процента от контроля. С и D) Кератиноциты обрабатывали миРНК ПС (0,5 мкМоль). Через 48 ч клетки анализировали методом TUNEL (терминальное дезоксиуридиновое мечение концов) для обнаружения апоптотических клеток (черные стрелки обозначают апоптотические клетки) (С) и количественно определяли в ходе подсчета апоптотических клеток с помощью микроскопии высокого увеличения (х20) (D). Данные представляли в виде среднего количества апоптотических клеток на поле (общее число полей - 15) (среднее значение ± стандартная ошибка, n=3). На графиках представлены результаты одного из трех независимых экспериментов. На изображениях представлены результаты одного из трех независимых экспериментов. *р<0,05, ** р<0,01. Масштабная линейка: 40 мкм.

Фигура 3: Обработка миРНК ПС или миРНК ЭРПС ингибирует рост и способствует апоптозу клеток HUVEC. А) Степень пролиферации клеток HUVEC, которую определяли с применением анализа МТТ, после обработки контролем, миРНК ПС или миРНК ЭРПС (500 нМоль) в присутствии или при отсутствии экзогенного АПС или ПС. Степень пролиферации клеток выражали в виде процента от контроля (среднее значение ± стандартное отклонение) в течение 72 ч. **Р<0,01 по сравнению с контролем (1-й столбец), ^≠≠Р<0,01 по сравнению с миРНК ПС (2-й столбец). В) Степень пролиферации клеток HUVEC в ответ на обработку блокирующим антителом против ЭРПС (RCR252) в присутствии или при отсутствии рекомбинантного АПС. Степень пролиферации клеток выражали в виде процента от контроля (среднее значение±стандартное отклонение) в течение 72 ч. *Р<0,05 по сравнению с контролем (1-й столбец), ^≠Р<0,05 по сравнению с АПС самим по себе (5-й столбец). С-Е) Клетки HUVEC обрабатывали контролем, миРНК ПС или миРНК ЭРПС (обе в концентрации 500 нМоль). Через 36 ч трансфицированные клетки обрабатывали рекомбинантным АПС (1 мкг/мл) в течение 12 ч. Через 48 ч клетки собирали. Активную каспазу-3 определяли посредством иммунофлуоресцентного окрашивания (белые стрелки обозначают клетки, положительные к активной каспазе-3) (С); апоптотические клетки определяли с помощью набора для определения гибели клеток in situ (белые стрелки обозначают апоптотические клетки) (D). На изображениях представлены результаты одного из трех независимых экспериментов. Масштаб: 40 мкм. Е) Апоптотические клетки (из анализа D) количественно определяли в ходе подсчета количества клеток, окрашенных DAPI, с применением микроскопического анализа. Данные представлены в виде среднего количества апоптотических клеток, определенного под большим увеличением (40 х) (среднее значение ± стандартная ошибка среднего, n=3). *Р<0,05, **Р<0,01 по сравнению с контролем (1-й столбец), ^#Р<0,05 по сравнению с введением миРНК ПС (2-й столбец)

Подробное описание изобретения

Как было указано выше, в тот период времени, когда было предложено настоящее изобретение, считали, что кератиноциты вовлечены в патологию ряда воспалительных поражений кожи, в том числе псориаза. Предполагают, что варианты противовоспалительной терапии, которые применяют в течение долгого времени, эффективно минимизируют репликацию воспалительных клеток, поскольку данное ингибирование роста и/или репликации воспалительных клеток является предпочтительным, соединения, которые, как предполагают, являются антиапоптотическими, не рассматриваются в качестве средств для клинического применения при лечении данных заболеваний. Вследствие данных и некоторых других причин АПС, несмотря на свою противовоспалительную функцию, до появления настоящего изобретения никогда не рассматривали в качестве средства, способного минимизировать или устранить поражения кожи, которые характеризуются гиперпролиферацией, гиперплазией или каким-либо иным способом нарушенной регуляцией пролиферации кератиноцитов. Более того, до настоящего изобретения в опубликованных данных о стимулирующем действии АПС на пролиферацию кератиноцитов высказывалось мнение, что терапия АПС пагубно воздействует для воспалительных заболевания кожи, такие как псориаз, акне и другие поражения кожи, которые характеризуются гиперпролиферацией кератиноцитов.

Как описано в настоящей заявке, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что АПС ингибирует апоптоз в медленнорастущих или нормальных кератиноцитах или клетках человека, но не оказывает действия на ингибирование пролиферации аномальных или быстрорастущих кератиноцитов или клеток, которые являются медиаторами широкого диапазона воспалительных поражений кожи.

Исходя из этого, авторы настоящего изобретения установили, что в поражениях кожи, ассоциированных с гиперпролиферацией кератиноцитов, существует две популяции кератиноцитов, ответ которых на антиапоптотические сигналы, опосредованные АПС, отличается. Более конкретно, кератиноциты, которые отвечают на АПС (т.е. кератиноциты, которые не подвергаются апоптозу в ответ на базальные концентрации АПС) представляют собой медленнорастущие нормальные не воспалительные клетки. Кератиноциты, которые отвечают на АПС (т.е. кератиноциты, которые подвергаются апоптозу в ответ на базальные концентрации АПС) представляют собой быстрорастущие аномальные воспалительные клетки.

Важно подчеркнуть, что авторы настоящего изобретения обнаружили, что в то время как АПС способен стимулировать пролиферацию медленнорастущих нормальных клеток, данный белок обладает уникальной селективной способностью ингибировать пролиферацию быстрорастущих клеток. В настоящей заявке представлены данные, подтверждающие, что АПС увеличивает пролиферацию и ингибирует апоптоз медленнорастущих или нормальных клеток человека, в том числе эндотелиальных клеток и кератиноцитов, в нормальных условиях. Однако согласно настоящему изобретению АПС дифференциально регулирует пролиферацию клеток в зависимости от воспалительного состояния клеток - а именно, АПС ингибирует рост кератиноцитов, стимулированных ФНОα, и быстрорастущих синовиальных фибробластов из синовиальной оболочки ревматоидного артрита.

В работе, описанной в настоящей заявке, авторы настоящего изобретения установили, что вопреки представлению, существовавшему в литературе до появления настоящего изобретения, противовоспалительные преимущества АПС можно реализовать у пациентов, которые нуждаются в лечении поражений кожи, которые характеризуются гиперпролиферацией кератиноцитов, в данном случае, несмотря на то, что противовоспалительное действие АПС будет направлено на воспалительные клетки, антиапоптотическое действие АПС будет направлено селективно или специфично на кератиноциты, которые не являются воспалительными, но не будет направлено на воспалительные кератиноциты.

Далее, результатом данного лечения должно стать продолжение нормальной пролиферации не воспалительных кератиноцитов (что является следствием антиапоптотической функции АПС). При этом следствием введения АПС станет обеспечение противодействия воспалению, а также создание условий, при которых воспалительные гиперпролиферативные кератиноциты становятся апоптотическими.

А. Определения

В настоящей заявке за исключением случаев, когда иное следует из контекста, термины «содержать» и «включать», а также варианты данных терминов, такие как «содержащий», «включающий» и «содержит», «включает» призваны включить приведенные после данных терминов добавки, компоненты, числа или этапы.

Термин «кератиноцит», как правило, относится к эпидермальной клетке, которая синтезирует кератин, а также другие белки и стеролы. Данные клетки составляют 95% эпидермиса, который образован из недифференцированных, или базальных клеток в дермоэпидермальном соединении. Характерным белком промежуточных филаментов эпидермиса является цитокератин. В ходе различных последовательных стадий жизненного цикла кератин образует шиповатый слой клеток и гранулярный слой клеток, в котором клетки уплощаются и медленно гибнут для образования последнего слоя, рогового слоя, который постепенно слущивается.

Термин «гиперпролиферация», как правило, относится к аномально высокой степени пролиферации клеток, которая достигается в результате быстрого деления. Гиперпролиферация в некоторых случаях может являться следствием того, что клетка продолжительное время находится в фазах G₁, S или G₂ клеточного цикла. Гиперпролиферацию можно также называть гиперплазией, а гиперпролиферативные клетки могут называться гиперплазированными клетками или тканями.

«Гиперпролиферативные кератиноциты», как правило, представляют собой кератиноциты, которые имеют тенденцию существовать в стадии интерфазы клеточного цикла, такой как G₁, S или G₂. Данные клетки отличаются от нормальных кератиноцитов тем, что нормальные кератиноциты, как правило, существуют в фазе G₀ (нулевой, или фазе покоя), которую рассматривают либо как отдельную стадию, независимую от интерфазы, либо как удлиненную фазу G₁, в ходе которой клетка проходит точку рестрикции, контрольную точку клеточного цикла, находящуюся в конце фазы G₁. Гиперпролиферативные кератиноциты, как правило, также характеризуются тем, что в данных клетках экспрессируются воспалительные гены и, в частности, гены, вовлеченные в сигнальный путь NF-kB.

«Нормальные кератиноциты», как правило, представляют собой кератиноциты, которые имеют тенденцию существовать в фазе G₀ или в удлиненной фазе G₁. Как правило, данные кератиноциты представляют собой такие кератиноциты, которые не были стимулированы ФНОα и которые, как правило, не экспрессируют гены сигнального пути NF-kB.

Термин «активированный протеин С или АПС», как правило, относится к сериновой протеазе, которая функционирует в качестве антикоагулянта в результате связывания с белком S и протеолитической инактивации факторов Va и VIIIa и посредством стимулирования фибринолиза в результате нейтрализации ингибитора активатора плазминогена. Walker et al, FASEB J. 6, 2561-2567 (1992); Esmon, Arterioscler. Thromb. 12, 135-145 (1992); van Hinsbergh et al., Blood 65, 444-451 (1985). Предшественник протеина С первично образуется в печени. Активация предшественника осуществляется в результате удаления додекапептида с N-конца тяжелой цепи протеина С. Активация протеина С запускается, когда тромбин связывается с белком поверхности эндотелиальных клеток, тромбомодулином, и протеин С связывается с эндотелиальным рецептором протеина С. АПС посредством инактивации факторов Va и VIIIa ограничивает количество образующегося тромбина. Esmon, Arterioscler. Thromb. 12, 135-145 (1992).

Термин «лечение», как правило, относится к воздействию на пациента с целью противодействия заболеванию, состоянию или поражению, будь то устранение заболевания, состояния или поражения либо предотвращение проявления симптомов или осложнений заболевания, патологического состояния или поражения с профилактической целью.

Термин «поражение кожи, которое характеризуется присутствием гиперпролиферативных кератиноцитов», как правило, относится к заболеванию, состоянию, синдрому и т.п., при котором наблюдается доминирование гиперпролиферативных кератиноцитов и, в частности, избыток гиперпролиферативных кератиноцитов по сравнению с нормальной тканью. Указанное поражение может представлять собой воспалительное поражение и, как правило, может вовлекать один или несколько слоев кожи из базального слоя (stratum germinativum), шиповатого слоя, зернистого слоя, блестящего слоя и рогового слоя. Примеры поражений кожи включают пустулезный (гнойный) и не пустулезный (не гнойный) псориаз, в том числе формы, описанные в настоящей заявке, а также акне, в том числе обыкновенные угри или кистозные угри.

Термин «терапевтически эффективное количество», как правило, относится к количеству фармацевтического соединения, которое обеспечивает желаемый клинический результат. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения терапевтически эффективное количество АПС, как правило, обеспечивает антиапоптотическое действие на нормальные кератиноциты и может обеспечивать или может не обеспечивать апоптотическое действие на гиперпролиферативные кератиноциты. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения терапевтически эффективное количество АПС способно остановить пролиферацию гиперпролиферативных кератиноцитов и/или обеспечить противовоспалительное действие. Соответствующие количества могут быть установлены или определены в соответствии со способами согласно настоящему изобретению, раскрытыми в настоящей заявке.

Термин «количество, вызывающее апоптоз», как правило, относится к количеству АПС, которое обеспечивает индукцию апоптоза в гиперпролиферативных кератиноцитах.

Термин «количество, стимулирующее рост», как правило, относится к количеству АПС, которое обеспечивает индукцию пролиферации не гиперпролиферативных кератиноцитов и, в частности, медленнорастущих нормальных не воспалительных кератиноцитов.

Термин «противовоспалительное количество», как правило, относится к количеству АПС, обеспечивающему минимизацию воспалительного поражения кожи, которое характеризуется наличием гиперпролиферативных кератиноцитов.

В. Способы лечения

Исходя из предположения, что АПС не предотвращает апоптоз воспалительных гиперпролиферативных кератиноцитов, авторы настоящего изобретения установили, что АПС можно применять для обеспечения противовоспалительного действия на поражения, такие как псориаз и акне, без усугубления или ухудшения данных состояний, что, как правило, возникает при предотвращении апоптоза воспалительных кератиноцитов или при стимуляции пролиферации или роста воспалительных кератиноцитов каким-либо иным способом, как считали ранее, до появления настоящего изобретения. Таким образом, согласно определенным вариантам реализации в настоящем изобретении предложен способ лечения поражения кожи, которое характеризуется присутствием гиперпролиферативных кератиноцитов, у индивидуума. Указанный способ включает:

- обеспечение индивидуума, имеющего область кожи, которая характеризуется присутствием гиперпролиферативных кератиноцитов;

- осуществление контакта указанной области кожи с терапевтически эффективным количеством активированного протеина С (АПС);

в результате чего осуществляют лечение поражения кожи у указанного индивидуума.

Согласно указанному способу АПС доставляют непосредственно в участок или в область кожи, которая характеризуется присутствием гиперпролиферативных кератиноцитов, посредством осуществления контакта АПС или состава, содержащего АПС, с соответствующей областью. Указанные участок или область могут представлять собой открытую рану или поврежденную поверхность кожи, что имеет место при акне или пустулезном псориазе, или указанные участок или область могут являться по существу не поврежденными, т.е. могут представлять собой бляшку или другую выпуклую затвердевшую или фиброзную ткань. В том случае если участок или область являются открытыми в том смысле, что они повреждены и т.п., АПС можно наносить на поверхность, окружающую повреждение, и/или на ткани, подверженные воздействию, которые в норме лежат под поверхностью кожи (например, на базальный слой кожи (stratum germinativum), шиповатый слой, зернистый слой, блестящий слой).

В связи с этим, важным достижением авторов настоящего изобретения является обнаружение того, что АПС можно доставить в необходимый участок, в котором кожа по существу не повреждена, например, в область, окружающую разорванную пустулу, или на какую-либо другую по существу неповрежденную поверхность кожи. Данное открытие делает возможной местную доставку посредством осуществления прямого контакта АПС или соответствующего состава с участком, и данный вариант применения АПС значительно отличается от распространенного ранее клинического системного применения АПС при лечении диссеминированных заболеваний или состояний, таких как сепсис. Местное введение АПС согласно настоящему изобретению обеспечивает ряд преимуществ и применимо для лечения заболеваний, которые являются скорее местными, чем диссеминированными или системными, поскольку местное введение ограничивает риски, связанные с доставкой АПС в локальную область, и по существу минимизирует риски, связанные с системной доставкой АПС, например, посредством длительной инфузии.

Местная доставка АПС в целевой участок по существу отличается от способа введения АПС, известного в данной области техники, для лечения других заболеваний и состояний. Согласно способам, известным в данной области техники на момент появления настоящего изобретения, АПС предпочтительно вводят парентеральным способом, наиболее предпочтительно внутривенным способом, в дозе от приблизительно 1 мкг/сутки до приблизительно 500 мг/сутки или от приблизительно 1 МЕ/кг/сутки до приблизительно 6000 МЕ/кг/сутки в случае пациентов людей. См., например, патенты США №№5151268 и 5571786. В случае острого сепсиса препарат Зигрис™ (Xigris™) вводят посредством длительной инфузии в дозе от приблизительно 12 мкг/кг/час до приблизительно 30 мкг/кг/час для достижения равновесной концентрации АПС в плазме приблизительно 45 нг/мл после приблизительно двух часов инфузии. Введение согласно настоящему изобретению, как правило, не основано на длительной инфузии посредством системного введения. Введение согласно настоящему изобретению основано на местном введении АПС посредством осуществления контакта области кожи с терапевтически эффективным количеством АПС, как описано в настоящей заявке.

Область кожи, которая контактирует с терапевтически эффективным количеством АПС, может являться воспаленной либо воспаление может находиться в рецессии. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения поражение кожи характеризуется одним или несколькими или всеми из следующих процессов: апоптозом, воспалением, нарушением барьерной функции.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения область кожи является воспаленной. Конкретный пример представляет собой область кожи, связанную с хроническим воспалением. Данная кожа может иметь вид псориатической бляшки, которая может образовываться в сочетании с пустулами, хотя бляшка может являться по существу не пустулезной.

Поражение кожи выбрано из группы, состоящей из: псориаза, герпетиформного дерматоза, обыкновенной пузырчатки, витилиго и обыкновенных угрей или кистозных угрей.

Поражение кожи может представлять собой не пустулезный псориаз, например, обыкновенный псориаз или эритродермический псориаз.

Поражение кожи могут представлять собой пустулезный псориаз, например, генерализованный пустулезный псориаз, ладонно-подошвенный пустулез, кольцевидный пустулезный псориаз, пустулезный акродерматит или герпетиформное импетиго.

Как правило, в том случае, когда состояние представляет собой псориаз, область кожи, которая контактирует с АПС, представляет собой псориатическую бляшку. Таким образом, согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен способ лечения псориаза у индивидуума. Указанный способ включает:

- обеспечение индивидуума, имеющего псориатическую бляшку;

- нанесение композиции, содержащей терапевтически эффективное количество активированного протеина С (АПС), на бляшку;

- в результате чего осуществляют лечение псориаза у указанного индивидуума.

В том случае если состояние представляет собой обыкновенные угри, область кожи, которая контактирует с АПС, может содержать поврежденную и неповрежденную кожу. Таким образом, согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен способ лечения акне у индивидуума. Указанный способ включает:

- обеспечение индивидуума, имеющего акне;

- нанесение композиции, содержащей терапевтически эффективное количество активированного протеина С (АПС), на акне;

в результате чего осуществляют лечение акне у указанного индивидуума.

В том случае если состояние представляет собой атопический дерматит, область кожи, которая контактирует с АПС, может содержать поврежденную и неповрежденную кожу. Таким образом, согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен способ лечения атопического дерматита у индивидуума. Указанный способ включает:

- обеспечение индивидуума, имеющего атопический дерматит;

- нанесение композиции, содержащей терапевтически эффективное количество активированного протеина С (АПС), на атопический дерматит;

и в результате чего осуществляют лечение атопического дерматита у указанного индивидуума.

Атопический дерматит может иметь форму экземы, которую выбирают из группы, состоящей из эндогенной экземы, гнойной экземы, детской экземы; указанная экзема также может быть известна как «почесуха Бенье», «нейродермит» или «почесуха диатезическая».

Безотносительно указанного выше специалисту в данной области техники очевидно, что размер дозы АПС, протеина С, агента, который увеличивает синтез протеина С, и/или активатора протеина С будет варьировать в зависимости от конкретного соединения или комбинации соединений, которые применяют, заболевания или состояния, которое подвергают лечению, тяжести заболевания или состояния, типа или типов местного введения, интенсивности экскреции соединения, длительности лечения, свойств каких-либо других лекарственных средств, которые вводят животному, возраста, размера и вида животного и подобных факторов, известных специалисту в медицинской области техники. Как правило, подходящая суточная доза соединения или комбинации соединений составляет такое количество, которое представляет собой наименьшую дозу, способную оказать терапевтическое действие. Размер дозы, лекарственная форма и способ введения должны быть определены лечащим врачом в результате медицинской оценки. Эффективные размеры доз, лекарственные формы и способы введения различных соединений и комбинации (комбинаций) соединений могут быть определены эмпирическим способом; проведение данного определения находится в компетенции специалиста в данной области техники.

Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения важным является тот факт, что АПС обеспечивают в форме, которая делает возможным осуществление контакта АПС с кератиноцитами кожи, поскольку, без связи с какой-либо гипотезой, считают, что в результате осуществления данного контакта АПС оказывает селективное антиапоптотическое действие (т.е. селективное по отношению к не воспалительным не гиперпролиферативным клеткам) согласно настоящему изобретению, а также противовоспалительное действие. Как правило, клетки, которые контактировали с АПС, можно распознать по следующим характеристикам: более высокое содержание активированной металлопротеиназы матрикса (ММР)-2 и эндотелиального рецептора протеина С (ЭРПС) и более низкая активность активированной МАР-киназы ERK. Таким образом, осуществление контакта клеток с АПС и, следовательно, терапевтическую эффективность лечения, можно установить посредством оценки данных клеточных фенотипов.

Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения терапевтически эффективное количество АПС, как правило, оказывает антиапоптотическое действие на нормальные кератиноциты и апоптотическое действие на гиперпролиферативные кератиноциты. Данный результат можно оценить следующим образом: в результате анализа жизнеспособности/пролиферации клеток методом МТТ и в результате анализа апоптоза клеток методом TUNEL. В ходе данных вариантов анализа можно установить, было ли предоставлено терапевтически эффективное количество АПС. Типичные способы анализа описаны в настоящей заявке ниже.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения терапевтически эффективное количество АПС способно остановить пролиферацию гиперпролиферативных кератиноцитов и/или оказать противовоспалительные действие. Данный результат можно оценить посредством:

- анализа жизнеспособности/пролиферации клеток (анализ МТТ);

- анализа воспалительных цитокинов - ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-21/23 или ФНОα - методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) или

- анализа ЭРПС методом ELISA (R&D Systems, Inc., MN);

- анализа апоптоза методом FACS с пропидиум йодидом (ПИ) или с ПИ и аннексином;

- анализа методом вестерн-блоттинга для обнаружения воспалительных сигнальных молекул, таких KaKNF-кВ;

в результате чего можно установить, было ли обеспечено терапевтически эффективное количество АПС.

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения вышеуказанный результат получают посредством определения местной концентрации АПС в области кожи, которая составляет от 1 мкг до 100 мг АПС на грамм тканей кожи. Данную концентрацию можно определить путем отбора образцов пункционной биопсии кожи под местным обезболиванием из одной и той же хронической бляшки. Затем количество АПС можно определить способами, известными в данной области техники. В одном примере образцы ткани биопсии измельчают и лизируют на льду. После центрифугирования чистые супернатанты применяют для измерения концентрации ПС методом ELISA и определения активности АПС посредством анализа с хромогенным субстратом Spectrozyme РСа (American Diagnostica). Ферментативную активность определяют посредством измерения увеличения поглощения свободного хромофора, образовавшегося в единицу времени, при λ=450 нм.

Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения терапевтически эффективное количество АПС составляет от 0,1 мкг до 5000 мкг АПС на см² области кожи, на которую наносят АПС, или от 1 мкг до 2000 мкг АПС на см² области кожи, на которую наносят АПС, или от 10 мкг до 1000 мкг АПС на см² области кожи, на которую наносят АПС, или от 10 мкг до 200 мкг, или от 10 мкг до 400 мкг, или от 10 мкг до 800 мкг АПС на см² области кожи, на которую наносят АПС.

АПС можно вводить с частотой от одного раза в неделю до двух раз в день, в зависимости от природы состояния. АПС, как правило, вводят в течение не более 20 календарных недель или в течение от не более 6 календарных недель.

В.1. Способы лечения - местное введение

Способы местного лечения, например, с применением пасты, геля, крема, масла, лосьона, пены, мази или подобных веществ, являются особенно подходящими в том случае, когда соответствующая область кожи содержит поврежденную поверхность кожи, поскольку местное лечение обеспечивает проникновение АПС в соответствующий слой ткани кожи, в котором находятся воспалительные кератиноциты. Однако данные варианты лечения можно также применять в том случае, когда поверхность кожи является по существу неповрежденной, например, в случае псориатической бляшки.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения терапевтически эффективное количество АПС может составлять от 0,1 до 2000 мкг, предпочтительно от 20 до 200 мкг АПС на см области кожи. Большее количество, как правило, предпочтительно в том случае, когда поражение кожи является более селективным и, как правило, предпочтительно представляет собой острый хронический бляшечный псориаз [индекс площади и тяжести псориаза (PASI) больше или равен 12, площадь поверхности тела (ППТ) больше или равна 10], при котором поражения сопровождаются язвами, поскольку АПС может способствовать заживлению язв. Меньшие количества могут быть предпочтительны в тех случаях, когда поражения кожи не являются серьезными, например, в том случае, когда присутствуют поражения, не сопровождающиеся язвами.

Концентрация АПС в составе может составлять от приблизительно 10 мкг/мл до 1 мг/мл, и объем композиции, применяемой к области кожи, составляет приблизительно от 100 мкл до 10 мл.

Как правило, в случае если указанное состояние представляет собой псориаз, композицию наносят на кожу, как правило, с помощью стерильной поверхности, такой как палец или лопаточка, слоем толщиной не более приблизительно 10 мм, предпочтительно толщиной приблизительно 3 мм. Композицию затем можно втереть или распределить массирующими движениями по области кожи и прилежащей поверхности. Частота применения составляет, как правило, от одного раза в день до одного раза в неделю. Применение, как правило, длится не более 20 недель или длится не более 12 недель.

Подобные процедуры нанесения и режим введения доз можно применять для лечения акне или атопического дерматита.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения композицию, содержащую АПС, можно наносить на твердую основу, т.е. жгут, повязку и тому подобное, и затем фиксировать указанную основу на соответствующей области кожи.

В.2. Способы лечения - внутрикожная инъекция

Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения вышеуказанный результат получают посредством установления местной концентрации АПС по меньшей мере в 2 раза большей, чем базальный уровень. Данное количество АПС можно измерить посредством определения активности АПС в образце биопсии кожи методом ELISA и в результате анализа с хромогенным субстратом Spectrozyme РСа, как упоминается выше. Внутрикожная или подкожная инъекция является, как правило, предпочтительным способом введения в том случае если роговой слой является интактным и природа рогового слоя такова, что проникновение АПС через верхний слой кожи ограничено. Как правило, для введения можно применять иглу размером (~28-34 G) и шприц объемом 1 мл. Для того, чтобы покрыть необходимую площадь поверхности кожи, можно вводить множественные инъекции, примерно по 1 инъекции на см². Объем инъекции может варьировать от 10 мкл до 1 мл, типичный объем инъекции составляет 50 мкл. Как правило, введение осуществляют с частотой от одного раза в день до одного раза в неделю. Введение, как правило, длится не более 20 недель. Внутрикожную или подкожную инъекцию можно применять одновременно с местным применением АПС. Предпочтительными показаниями к применению являются псориаз или атопический дерматит, хотя другие состояния, которые характеризуются гиперпролиферацией кератиноцитов, также могут являться субъектами данного типа лечения.

Типичный вариант реализации подкожного/внутрикожного введения может также быть подходящим при лечении острого хронического бляшечного псориаза [индекс площади и тяжести псориаза (PASI)≥12, площадь поверхности тела (ППТ)≥10], при котором поражения сопровождаются или не сопровождаются язвами. АПС вводят подкожно в дозе от 200 до 2000 мкг в зависимости от размера бляшки или поражения, два раза в неделю в течение 12 недель, после чего следует период наблюдения длительностью 4 недели. Инъекцию осуществляют иглой размером 30, общий объем инъекции составляет от 500 мкл до 5 мл, предпочтительно 1 мл. АПС вводят несколько раз (внутрикожно или подкожно) в участки, окружающие поражение, расположенные на одинаковом расстоянии друг от друга, - если размер поражения составляет <10 см², АПС вводят в 4 участка, и количество участков и доз пропорционально увеличивают по мере увеличения поражения. АПС растворяют в воде для получения изотонического буферного солевого раствора. При необходимости данный тип лечения можно объединить с местным лечением. АПС в жидкой форме можно наносить на поражения ежедневно в течение того же периода времени, что и подкожное лечение. При обоих вариантах исследования (с применением местного лечения или без него) можно определять PASI, статическую общую оценку врача (sPGA), дерматологический индекс качества жизни (DLQI), побочные действия, а также общепринятые гематологические и лабораторные показатели (например, содержание цитокинов, гистологическое исследование, активность ПС/АПС). Ожидаемые результаты: к неделе 12 ожидается улучшение PASI>30% у всех пациентов и улучшение PASI>60% у 50% пациентов.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения вышеописанный способ включает этап осуществления контакта области кожи с противовоспалительным количеством АПС.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения вышеописанный способ включает этап осуществления контакта области кожи с количеством АПС, стимулирующим рост.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения вышеописанный способ включает этап осуществления контакта области кожи с количеством АПС, вызывающим апоптоз.

С. АПС и составы АПС

АПС для применения в способе, описанном выше, может быть приготовлен в форме композиции или может быть иным способом получен в результате процесса, описанного ниже.

АПС можно приготовить в результате активации in vitro протеина С, выделенного из плазмы или полученного с применением технологии рекомбинантной ДНК способами, хорошо известными в данной области техники. См., например, патенты США №№4,981,952, 5,151,268, 5,831,025, 6,156,734, 6,268,344 и 6,395,270.

В качестве альтернативы, АПС можно приготовить непосредственно с применением технологии рекомбинантной ДНК. См., например, патенты США №№4,981,952, 5,151,268, 6,156,734, 6,268,344 и 6,395,270. Рекомбинантный активированный протеин С можно получить в результате активации in vitro профермента рекомбинантного протеина С человека или посредством прямой секреции из клеток активированной формы протеина С. Протеин С можно получить в трансгенных животных, трансгенных растениях или в различных эукариотических клетках, в том числе, например, в результате секреции из клеток печени человека 293 в виде профермента, который затем очищают и активируют с помощью методик, известных специалисту в данной области техники.

АПС может быть получен от любого вида животных, однако предпочтительным является АПС человека.

Фрагменты и производные АПС можно применять для реализации настоящего изобретения на практике при условии, что указанные фрагменты и производные демонстрируют активность, описанную в настоящей заявке. См., например, патенты США №№5,151,268, 5,453,373 и 5,516,650 и заявки РСТ WO 89/12685, WO 01/56532, WO 01/59084 и WO 01/72328.

АПС может представлять собой производное АПС человека, обладающее протеолитической, амидолитической, эфиролитической и биологической (антикоагулянтной, противовоспалительной или фибринолитической) активностью, характерной для АПС человека. Примеры производных протеина С описаны в следующих патентах: Gerlitz, et al., патент США №5,453,373, и Foster, et al., патент США №5,516,650, которые включены в настоящее изобретение посредством ссылки во всей своей полноте.

Подходящие фармацевтические композиции АПС содержат АПС и фармацевтически приемлемый носитель. См., например, патенты США №№6,395,270 и 6,159,468 и заявки РСТ WO 98/48818, WO 01/56532 и WO 01/72328. Композиция, содержащая АПС, может, как правило, являться композицией, которая представляет собой стабильный лиофилизированный препарат высокой степени чистоты, содержащий объемообразующий агент (такой как сахароза, маннитол, трегалоза и рафиноза), соль (такую как хлорид натрия и хлорид калия), буфер (такой как цитрат натрия, Трис-ацетат и фосфат натрия) и АПС. Например, стабильная лиофилизированная композиция может содержать в весовом соотношении приблизительно 1 часть АПС, от приблизительно 7 до 8 частей соли и от приблизительно 5 до 7 частей объемообразующего агента. Примером такой стабильной лиофилизированной композиции является композиция, содержащая: 5,0 мг АПС, 30 мг сахарозы, 38 мг NaCl и 7,56 мг цитрата, рН 6,0, на один флакон.

С.1. Составы для местного введения

Согласно одному особенно предпочтительному варианту реализации АПС предложен в форме композиции или состава, адаптированного для местного введения на соответствующее поражение кожи, бляшку или на другую поверхность кожи, подверженную соответствующему поражению, согласно способу, описанному в разделе В выше. Примеры подобных составов включают такие составы, которые можно наносить непосредственно на соответствующую поверхность, что делает возможным местное введение АПС на соответствующем участке. Данные составы включают гели, масла, спреи, составы в упаковке с шариковым аппликатором, мази, лосьоны, пены и тому подобное. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения АПС предложен в форме метил-целлюлозного геля и может содержать стабилизаторы, такие как углеводы и соли.

Мази для кожи могут представлять собой комбинацию органических соединений, компонентов, способствующих здоровью и красоте, или медицинских компонентов, как правило, на основе минерального масла. Данные компоненты придают мазям для кожи более густую, менее водорастворимую консистенцию, которая остается на поверхности тела дольше, так что компоненты могут действовать более эффективно для лечения широкого диапазона проблем. Существует ряд натуральных и органических мазей для кожи, которые можно заказать у различных компаний (таких как Therapex).

Также можно применять пену (0,05%) клобетазола пропионата (КП). КП представляет собой эмульсионную аэрозольную пену, которую в Соединенных Штатах применяют для лечения воспалительных и зудящих манифестаций дерматозов, восприимчивых к кортикостероидам, а в Канаде применяют для лечения воспалительных и зудящих манифестаций атопического дерматита от средней до сильной степени тяжести (Olux-E (клобетазола пропионат), пена, 0,05% Stiefel Laboratories Inc, Research Triangle Park, Северная Каролина (2011)).

В том случае если состав представляет собой гель, указанный состав может содержать АПС в количестве от 10 до 5000 мкг/г геля.

С.2. Инъецируемые составы

Особенно предпочтительный состав АПС представляет собой препарат, который продается компанией Eli Lilly and Co., Индианаполис, Индиана, под торговой маркой Зигрис™ (Xigris™). Препарат Зигрис™ поставляется в форме стерильного лиофилизированного порошка для внутривенной инфузии. Флакон препарата Зигрис™ в дозировке 5 мг содержит 5,3 мг/флакон рекомбинантного АПС человека, 31,8 мг/флакон сахарозы, 40,3 мг/флакон NaCl и 10,9 мг/флакон цитрата натрия; флакон препарата Зигрис™ в дозировке 20 мг содержит 20,8 мг/флакон рекомбинантного АПС человека, 124,9 мг/флакон сахарозы, 158,1 мг/флакон NaCl и 42,9 мг/флакон цитрата натрия. Содержимое флаконов восстанавливают стерильной водой для инъекций, качество которой соответствует Фармакопее США, до концентрации АПС приблизительно 2 мг/мл, и данный разведенный АПС затем прибавляют к 0,9% раствору хлорида натрия для инъекций до концентрации АПС от приблизительно 100 до приблизительно 5000 мкг/мл для введения пациенту. Данный раствор представляет собой особенно предпочтительный состав для введения АПС посредством методики подкожной инъекции, как описано в разделе В выше.

Независимо от того, вводят ли препарат местно или посредством подкожной инъекции, согласно определенным вариантам реализации в настоящем изобретении соответствующий состав может в качестве альтернативы или помимо АПС содержать протеин С. Например, можно вводить эффективное количество протеина С, который будет активирован in vivo по эндогенному пути активации протеина C с образованием АПС. См., например, патент США №5151268 и заявку РСТ WO 93/09807. Как отмечалось выше, протеин С можно выделить из плазмы и очистить, либо протеин С можно получить с применением технологии рекомбинантной ДНК. См., например, патенты США №№4959318, 4981952, 5093117, 5,151,268, 5571786, 6156734, 6268344 и 6395270. Подходящие фармацевтические композиции, содержащие протеин С, хорошо известны (см., например, патенты США №№5151268 и 5571786).

Эндогенное образование АПС также можно увеличить посредством введения определенного количества агента, который увеличивает синтез протеина С у животного. См., например, заявку РСТ WO 93/09807. Подходящие агенты включают анаболические стероиды (например, даназолол). См., например, заявку РСТ WO 93/09807.

Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения эндогенное образование АПС можно увеличить посредством введения определенного количества активатора протеина С, способного эффективно стимулировать продукцию АПС из эндогенно синтезированного протеина С и/или из совместно вводимого протеина С in vivo. См., например, заявку РСТ WO 93/09807. Активатор протеина С представляет собой любое соединение, которое стимулирует или увеличивает образование АПС. Подходящие активаторы протеина С включают тромбин, α-тромбин, тромбин, ацилированный в активном сайте, аналоги и мутантые формы тромбина (например, тромбин E192Q и тромбин K52E), растворимые комплексы тромбина-тромбомодулина, агенты, которые предотвращают клиренс или разрушение комплексов тромбина-тромбомодулина, агенты, которые увеличивают синтез или замедляют клиренс тромбомодулина, яды (такие как яды Protac или Russel Viper), фактор Ха, плазмин, трипсин и любой другой яд, фермент или соединение, способное стимулировать или увеличивать образование АПС из протеина С. См., например, заявку РСТ WO 93/09807. Предпочтительные активаторы протеина С представляют собой тромбин и тромбин, ацилированный в активном сайте.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения АПС можно вводить совместно с другим агентом для контроля одного или нескольких процессов, которые выбирают из воспаления, пролиферации клеток и апоптоза. Один особенно предпочтительный агент представляет собой антитело против ИЛ-17, в частности, иксекизумаб (Ixekizumab), который значительно облегчает степень тяжести кожных заболеваний по сравнению с плацебо, что было установлено в исследовании II фазы у пациентов с хроническим бляшечным псориазом (NEJM, 2012). Другие примеры агентов для контроля воспаления включают ингибиторы ФНОα и противовоспалительные цитокины, а также биофармацевтические средства.

Следует понимать, что настоящее изобретение, раскрытое и определенное в настоящем описании, распространяется на все альтернативные комбинации из двух или более отдельных элементов, упомянутых в тексте или рисунках или очевидно вытекающих из них. Все данные различные комбинации составляют различные альтернативные аспекты настоящего изобретения.

Дополнительные аспекты настоящего изобретения и дополнительные варианты реализации аспектов, описанных в предшествующих параграфах, будут очевидными из следующего описания, которое дано в качестве примера и со ссылкой на прилагаемые рисунки.

Примеры

Пример 1. Доклиническое исследование, в котором была определена селективная антиапоптотическая активность АПС по отношению к медленнорастущим не воспалительным кератиноцитам и кератиноцитам псориаза кожи

В исследовании участвовали шесть пациентов с активным хроническим бляшечным псориазом и 6 нормальных индивидуумов. Участники исследования не получали какого-либо лечения в течение по меньшей мере 4 недель до введения исследуемых средств. Под местным обезболиванием отбирали два образца пункционной биопсии диаметром 6 мм из одной и той же хронической бляшки. Кератиноциты выделяли, как описано выше (20).

Нормальные кератиноциты обрабатывали смесью цитокинов [ИЛ-1а (10 нг/мл), ИЛ-6 (5 нг/мл), ФНОα (5 нг/мл), ИЛ-17А (10 нг/мл)] для индукции псориатического фенотипа. К кератиноцитам добавляли АПС в концентрации 1,10 мкг/мл и инкубировали в течение 24, 48 и 72 ч. Пролиферацию/жизнеспособность клеток оценивали в ходе анализа МТТ и в ходе анализа пролиферации с применением БДУ (5-бромдезоксиуридина). Апоптоз клеток исследовали в ходе анализа TUNEL и анализа методом проточной цитометрии (с пропидиум иодидом (ПИ) или с ПИ и аннексином V). Продукцию цитокинов и четыре избранных ассоциированных с псориазом гена TNF, DEFB4, CAMP, PI3 детектировали методом ПЦР в режиме реального времени с обратной транскрипцией и методом ELISA. Активацию и экспрессию апоптотических сигнальных молекул каспазы-3, 8 и 9 и МАК-киназы ERK определяли методом вестерн-блоттинга.

Результаты эксперимента продемонстрировали, что АПС вызывает апоптоз и замедляет рост псориатических кератиноцитов и вместе с тем стимулирует рост и жизнеспособность нормальных кератиноцитов. Также АПС вызывает уменьшение содержания воспалительных цитокинов ИЛ-1, ФНОα, ИЛ-17 и ИЛ-6, а также молекул, ассоциированных с псориазом, - ФНО, DEFB4, CAMP, PI3. В нормальных контрольных клетках, которые обрабатывали медиаторами воспаления, рост клеток был увеличен, и добавление АПС вызывало обратное развитие данного действия медиаторов воспаления. В целом, полученные результаты однозначно свидетельствуют о том, что АПС способен не только ингибировать воспаление, ассоциированное с псориатическими кератиноцитами, но также вызывает уменьшение характерной чрезмерной пролиферации, ассоциированной с данными клетками.

Пример 2. Пилотное исследование 2 фазы подкожного введения АПС в течение 12 недель

Отбор пациентов: в исследование включали 5 пациентов с тяжелым хроническим бляшечным псориазом [индекс площади и тяжести псориаза (PASI)≥12, площадь поверхности тела (ПИТ)≥10]. Первичные критерии включения охватывали пациентов в возрасте от 18 до 70 лет, у которых наблюдался стабильный бляшечный псориаз в течение по меньшей мере 6 месяцев. Первичные критерии исключения охватывали: i) пациентов с не бляшечным или обусловленным действием лекарственных средств псориазом; ii) пациентов, которые применяли биологические лекарственные средства, такие как ритуксимаб, абатасепт, инфликсимаб, адалимумаб, циклоспорин или микофеноловую кислоту, а также этанерцепт или анакинра в течение 28 дней до начала исследования iii) пациентов, которые получали лечение псориаза, в том числе светолечение любого типа, в течение 8 недель, предшествующих лечению, и лечение каким-либо стандартным вариантом местной терапии псориаза, отличным от применения смягчающих средств, в течение 4 недель, предшествующих лечению; iv) применение местной терапии в течение исследования было ограничено применением глюкокортикоидов класса с III по VII исключительно на волосистой коже головы, в подмышечных впадинах и паховой области; v) пациенты, имеющие признаки каких-либо активных или недавно появившихся инфекций или в истории болезни которых присутствуют данные о злокачественном образовании или другом аутоиммунном заболевании, и беременные женщины также не включались в данное исследование.

Лечение: Пациентам вводили 400 мкг АПС/бляшку подкожно два раза в неделю в течение до 12 недель или до исчезновения бляшек. АПС инъецировали примерно равными дозами в течение всего исследования (как описано выше) по краю псориатических бляшек и под бляшки. Наполнитель сам по себе (плацебо) инъецировали аналогичным образом в контрольные бляшки, расположенные симметрично на другой стороне тела. Наблюдение за пациентами продолжали в течение дополнительных 4 недель после окончания лечения.

Измерения: анализировали PASI, статическую общую оценку врача (sPGA), дерматологический индекс качества жизни (DLQI), побочные действия, а также общепринятые гематологические и лабораторные показатели (например, содержание цитокинов, гистологическое исследование, активность ПС/АПС). Соображения безопасности включали риск возникновения кровотечения, головной боли, утомляемости, инфекции и аллергии. Определение соответствующих клеточных и биохимических показателей включало подсчет белых кровяных клеток, нейтрофилов и тромбоцитов; определение коагуляционной активности, содержания ПС/АПС и образования антител против АПС в сыворотке. Для проведения гистологического исследования ПС/АПС и ЭРПС отбирали образец биопсии диаметром 4 мм и проводили оценку основных псориатических параметров, таких как акантоз, гиперкератоз и паракератоз, митотическая активность эпидермиса, сосочковый отек, дилатация и извитость капилляров, а также содержание нейтрофилов в дерме, шиповатом слое и роговом слое, соответственно.

Статистический анализ: Исходное значение и значения для каждой недели в ходе лечения, а также через 4 недели лечения сравнивали при уровне значимости 0,05 с применением одностороннего f-критерия, основанного на двойной выборке.

Результаты и обсуждение: Было показано, что лечение АПС является безопасным и хорошо переносимым. Пациенты демонстрировали по меньшей мере 60% регрессии поражения, вызванного псориазом, причем у 3 из 5 пациентов наблюдалась полная регрессия бляшки. Действие АПС сохранялось в течение 4-недельного периода наблюдения. У всех пациентов наблюдалось улучшение показателей PASI, sPGA, DLQI и отсутствие побочных действий, а также отсутствие образования антител против АПС в ответ на лечение. Наблюдалось значительное уменьшение толщины эпидермиса и содержания воспалительных клеток в коже, а также увеличение экспрессии кератиноцитами ЭРПС, которое, однако, не повлияло на содержание циркулирующих ПС/АПС. В целом, полученные результаты демонстрируют, что АПС является безопасным, хорошо переносимым и высокоэффективным средством для лечения псориатических бляшек.

Пример 3. Пилотное исследование 2 фазы подкожного введения АПС на 10 пациентах с обыкновенными угрями

Отбор пациентов: в исследование включали 10 пациентов с обыкновенными угрями. Первичные критерии включения охватывали: пациентов возрастом от 18 до 30 лет, у которых наблюдается двустороннее акне на лице в течение по меньшей мере 6 месяцев. Первичные критерии исключения охватывали пациентов, которые имели признаки каких-либо активных или недавно появившихся инфекций или в истории болезни которых присутствовали данные о злокачественном образовании или другом аутоиммунном заболевании, беременные женщины.

Лечение: Пациентов обеспечивали 200 мкг АПС в форме геля один раз в день в течение 12 недель или до исчезновения акне. Пациенты получали два тюбика геля, подписанные L и R. Пациентам рекомендовали наносить 2 см геля, выжатого из тюбика, на определенный пораженный участок (L - на левой стороне лица и R - на правой стороне лица) и равномерно втирать. Наблюдение за пациентами продолжали в течение дополнительных 4 недель после окончания лечения.

Измерения: Получали фотографии до начала лечения и каждые 4 недели, рассчитывали площадь поражения акне с применением компьютерного анализа изображений. Анализировали побочные действия, а также общепринятые гематологические и лабораторные показатели (например, содержание цитокинов, гистологическое исследование, активность ПС/АПС). Наблюдали за параметрами безопасности, в том числе за риском возникновения кровотечения, головной боли, утомляемости, инфекции и аллергии. Соответствующие клеточные и биохимические показатели включали подсчет белых кровяных клеток, нейтрофилов и тромбоцитов; анализ коагуляционной активности, содержания ПС/АПС и образования антител против АПС в сыворотке.

Статистический анализ: Исходное значение и значения для каждой недели в ходе лечения, а также через 4 недели лечения сравнивали при уровне значимости 0,05 с применением одностороннего f-критерия, основанного на двойной выборке.

Результаты и обсуждение: Было показано, что лечение АПС является безопасным и хорошо переносимым. Пациенты демонстрировали по меньшей мере 50% регрессии акне. Действие АПС сохранялось в течение 4-недельного периода наблюдения. Наблюдалось отсутствие побочных действий, а также отсутствие образования антител против АПС в ответ на лечение. Наблюдалось значительное уменьшение толщины эпидермиса и содержания воспалительных клеток в коже, а также увеличение экспрессии кератиноцитами ЭРПС, которое, однако, не повлияло на содержание циркулирующих ПС/АПС. В целом, результаты данного исследования показали, что АПС является безопасным, хорошо переносимым и высокоэффективным средством для лечения обыкновенных угрей.

Пример 4. Состав в форме геля для терапевтического применения

В данном примере предложен нестерильный гель для местного применения с низким количеством микроорганизмов, содержащий консерванты. Данный гель на основе карбоксиметилцеллюлозы натрия содержит в качестве действующего вещества активированный протеин С и следующие неактивные компоненты: карбоксиметилцеллюлозу натрия, ледяную уксусную кислоту, L-лизина гидрохлорид, м-крезол, метилпарабен, пропилпарабен, натрия ацетата тригидрат, хлорид натрия и воду для инъекций. Один грамм геля содержит 100 мкг активированного протеина С.

Пример 5. Состав в форме геля для терапевтического применения

В данном составе с рН 4, который получают без нагревания, полимер Carbopol®*Ultrez 30 polymer (Lubrizol Advanced Materials, Inc) обеспечивает хорошую вязкость в комбинации с ксантановой камедью в присутствии 1% салициловой кислоты и 5% раствора электролита. Увлажняющее вещество Glucam™* Е20 Humectant вместе с глицерином придает составу влагоудерживающую способность. Ниже приведен указанный состав.

Процедура:

1. Объединяют компоненты Части D и перемешивают до полного растворения кристаллов салициловой кислоты. Раствор откладывают для последующего добавления в состав.

2. Растворяют динатрий EDTA в воде. После полного растворения динатрия EDTA устанавливают скорость перемешивания 400-500 об./мин. и медленно диспергируют полимер Carbopol®* Ultrez 30 polymer в воде. Продолжают перемешивание до полной гидратации полимера.

3. Перемешивают компоненты Части В до образования однородного раствора. Присоединяют компоненты Части А. Увеличивают скорость перемешивания, если это необходимо для поддержания однородности консистенции.

4. Добавляют компоненты Части С к Частям А/В и увеличивают скорость перемешивания, если это необходимо для поддержания однородности консистенции. Продолжают перемешивание в течение 10 минут.

5. Добавляют к смеси компоненты Части D и корректируют скорость перемешивания, если это необходимо для уменьшения разбрызгивания в связи с изменением вязкости. Перемешивают до получения однородной консистенции.

6. Смешивают компоненты Части Е и добавляют к смеси. Перемешивают до получения однородной консистенции.

7. По одному добавляют компоненты Части F, тщательно перемешивают после добавления каждого компонента. Добавляют АПС до концентрации 10-5000 мкг/г геля или 0,01-0,05% объем/объем

Данный гель можно применять непосредственно на участках поражения.

Пример 6. Спрей: составы и терапевтическое применение

АПС растворяли в изотоническом стерильном растворе, описанном выше для введения АПС посредством инъекции. Доставку спрея осуществляли посредством переноса содержимого флакона в шприц объемом 2,5 мл с помощью иглы для отбора проб. К концу шприца (вместо иглы) присоединяли стерилизованное распыляющее устройство, и равномерно распыляли образец (АПС или солевой раствор) на бляшку для полного охвата всей пораженной поверхности. Таким образом, для достижения атомизации не требовалось какое-либо распыляющее вещество (пропеллент), на шприц воздействовали исключительно давлением. Нанесение при необходимости повторяли предпочтительно один раз в день. Данные манипуляции являются легкоосуществимыми, и их повторяют последовательно для обеспечения равномерного действия лечения.

Пример 7. Методики оценки антиапоптотического действия на нормальные кератиноциты и апоптотического действия на гиперпролиферативные кератиноциты

Согласно настоящему изобретению терапевтически эффективное количество АПС, как правило, оказывает антиапоптотическое действие на нормальные кератиноциты и апоптотическое действие на гиперпролиферативные кератиноциты. Данный результат можно оценить in vitro или in situ следующим образом: Способ in vitro №1.

Необработанную кожу с активным псориазом выделяли с помощью пункционной биопсии и выделяли из кожи кератиноциты. Вкратце, клетки (3000 клеток/лунку) выращивали в 96-луночных планшетах до конечного объема 200 мкл, затем инкубировали в течение 4 часов, чтобы дать возможность клеткам прикрепиться к поверхности. Клетки затем обрабатывали АПС в концентрации 0,1, 1 и 10 мкг/мл в течение 72 ч.

1) Степень жизнеспособности/роста клеток оценивали посредством анализа МТТ: В ходе данного анализа митохондриальные дегидрогеназы жизнеспособных клеток расщепляли тетразольное кольцо, в результате чего образовывались кристаллы чистого формазана МТТ, нерастворимые в водных растворах. Данные кристаллы были растворимы в подкисленном изопропаноле. Полученный в результате раствор пурпурного цвета анализировали спектрофотометрически. Увеличение количества клеток приводило к увеличению количества образовавшегося формазана МТТ и к увеличению поглощения. За три часа до завершения обработки к клеткам добавляли 10 мкл МТТ с концентрацией 5 мг/мл. После следующей инкубации в течение 3 часов раствор МТТ удаляли и заменяли на 100 мкл ДМСО (диметилсульфоксида). Оптическую плотность в каждой лунке определяли при длине волны 570 нм и при длине волны сравнения 630 нм. Жизнеспособность клеток непосредственно связана с ОП. АПС уменьшает жизнеспособность дозозависимым образом.

2) Определение степени апоптоза проводили с помощью анализа методом TUNEL, анализа методом FACS с пропидиум иодидом (ПИ) или с ПИ и аннексином V и анализа активности каспаз.

Анализ методом TUNEL проводили с применением набора для определения гибели клеток in situ согласно инструкции производителя (Roche Diagnostics Australia Pty. Ltd., NSW, Австралия). Вкратце, клетки пермебеализовали 0,1% Тритоном Х-100 в свежеприготовленном 0,1% цитрате натрия и инкубировали с терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой в присутствии дУТФ, меченного флуоресцеином (60 мин. при температуре 37°С). TUNEL-положительные клетки визуализировали в результате реакции антитела против флуоресцеина, конъюгированного с пероксидазой (ПОД), и субстрата ПОД. Клетки окрашивали ДАФИ. Количество апоптотических клеток определяли в слепом для исследователя режиме путем подсчета TUNEL-положительных клеток и суммарного количества клеток под большим увеличением (40 х) и подсчитывали процентное содержание TUNEL-положительных клеток.

Анализ методом FACS: Кератиноциты обрабатывали трипсином и промывали буфером для промывки FACS (ФСБ, содержащий 5% эмбриональной телячьей сыворотки). Суспензию клеток объемом 200 мкл инкубировали с пропидиум иодидом (ПИ) или с ПИ и аннексином V или с конъюгированными антителами и последовательно обнаруживали с помощью проточного питометра для анализа клеточных циклов/апоптоза клеток и экспрессии белка. Данные анализировали с применением программного обеспечения FlowJo.

Активность активных каспаз определяли методом вестерн-блоттинга. После обработки кератиноциты трижды промывали ФСБ и лизирующим буфером (0,15 М NaCl, 0,01 мМ фенилметилсульфонил фторид, 1% NP-40, 0,02 М Трис, 6 М мочевина/Н₂О) с добавлением ингибитора протеазы и ингибитора фосфатазы (Roche, Индианаполис, Индиана, США). Лизаты клеток центрифугировали при 10000g в течение 15 минут, супернатанты отделяли методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия 10% (ДСН-ПААГ) и переносили на мембрану PDVF. Определяли антитела против каспазы человека-3, 8 и 9. Иммуноактивность определяли с применением детектирующей системы ECL (Amersham, Пискатауэй, Нью-Джерси). Анализ антител против β-актина человека проводили для нормирования неэквивалентной нагрузки.

Во всех анализах апоптоза АПС способствовал апоптозу быстрорастущих кератиноцитов.

Способ in vitro №2

Целью эксперимента было определение того, являются ли кератиноциты из бляшек, обработанных АПС, более подверженными апоптозу, чем клетки, обработанные плацебо. АПС доставляли к псориатическим бляшкам (размером ~5-50 см²) с применением двух способов: i) местной инъекции (100 нг - 1 мг); и) распыления раствора (10 нг - 1 мг) с помощью стерилизованного распыляющего устройства, присоединенного к концу шприца объемом 0,5 мл). Кожу с активным псориазом, которую обрабатывали АПС или плацебо, выделяли с помощью пункционной биопсии и выделяли из кожи кератиноциты. Немедленно оценивали клетки для выявления апоптоза с применением анализа методом FACS, как описано выше. Полученные результаты свидетельствуют, что содержание апоптотических клеток в обработанной АПС коже значительно выше, чем в коже, обработанной плацебо.

Способ in situ

Апоптоз клеток in situ: Целью эксперимента было определение того, являются ли кератиноциты из бляшек, обработанных АПС, более подверженными апоптозу, чем клетки, обработанные плацебо. АПС доставляли к псориатическим бляшкам (размером ~5-50 см²) с применением двух способов: i) местной инъекции (100 нг - 1 мг); И) распыления раствора (10 нг - 1 мг), с помощью стерилизованного распыляющего устройства, присоединенного к концу шприца объемом 0,5 мл). Кожу с активным псориазом, которую обрабатывали АПС или плацебо, выделяли с помощью пункционной биопсии. Кожу фиксировали и клетки, которые подверглись апоптозу, определяли с применением набора для определения гибели клеток in situ согласно инструкции производителя (Roche Diagnostics Australia Pty. Ltd., NSW, Австралия). Вкратце, клетки пермеабил изо вали 0,1% Тритоном Х-100 в свежеприготовленном 0,1% цитрате натрия и инкубировали с терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой в присутствии дУТФ, меченного флуоресцеином (60 мин. при температуре 37°С). TUNEL-положительные клетки визуализировали в результате реакции антитела против флуоресцеина, конъюгированного с пероксидазой (ПОД), и субстрата ПОД. Клетки окрашивали ДАФИ. Количество апоптотических клеток определяли в слепом для исследователя режиме путем подсчета TUNEL-положительных клеток и суммарного количества клеток под большим увеличением (40 х) и подсчитывали процентное содержание TUNEL-положительных клеток. Содержание TUNEL-положительных апоптотических клеток в обработанной АПС коже было значительно выше, чем в коже, обработанной плацебо.

Модель псориаза на мышах

Была создана модель псориаза на мышах с тяжелой комбинированной иммунной недостаточностью (ТКИН) (использовали 82 мыши) с ксенотрансплантатами, как было описано ранее (Raychaudhuri, 2001 Br. J. Dermatol). Вкратце, псориатические бляшки человека (1 см²) трансплантировали на спину мыши ТКИН возрастом ~ 8 недель после удаления образца кожи на всю толщу кожи. Псориатические трансплантаты приживались через 3-4 недели, псориаз-подобное заболевание сохранялось в течение по меньшей мере 10 недель. После развития псориаза вводили АПС с применением двух способов: i) внутрикожной инъекции (10 нг - 100 мкг); и) распыления раствора (10 нг - 100 мкг) с помощью стерилизованного распыляющего устройства, присоединенного к концу шприца объемом 0,5 мл), на пораженную кожу (8 мышей в группе) 3 раза в неделю в течение до 8 недель. Физиологический солевой раствор применяли в качестве плацебо (контроля). Образцы пункционной биопсии диаметром 2 мм отбирали в день 0 (перед началом лечения) и в день 28 (по окончании лечения), быстро замораживали и подвергали иммунному окрашиванию и гистологическому анализу для определения толщины эпидермиса, длины ветвящихся эпидермальных тяжей (показатель толщины эпидермиса) и воспалительных клеточных инфильтратов. В день 28 кожу отбирали для определения содержания медиаторов воспаления, маркеров дифференциации и белков межклеточных контактов. Введение АПС вызывало уменьшение толщины кожи и количества воспалительных клеток, в частности, нейтрофилов и Т-клеток. Содержание воспалительных цитокинов в коже, обработанной АПС, уменьшалось, а содержание фактора некроза опухоли а и белков, ассоциированных с клеточными контактами, в особенности содержание белков запирающей зоны-1 клаудинов, окклюдинов и белка JAM-A, увеличилось по сравнению с плацебо.

Пролиферация клеток с применением встраивания БДУ: для мечения клеток, в которых происходит синтез ДНК, взрослым мышам вводили одну инъекцию БДУ (100 мг/кг) за 2 ч до эвтаназии. Кожу мышей отбирали и фиксировали в 10% формалине. Пролиферирующие клетки определяли посредством иммуноокрашивания антителами против БДУ. Клетки, обработанные АПС, демонстрировали значительно меньшую степень встраивания БДУ, что свидетельствует о более низкой пролиферативной активности.

Пример 8. Пилотное исследование 2 фазы подкожного введения АПС в течение одного месяца на пяти пациентах

Пациенты

Пациенты возрастом от 18 до 70 лет, у которых наблюдался стабильный бляшечный псориаз в течение по меньшей мере 6 месяцев и которые получали или были кандидатами на получение светолечения или системной терапии псориаза.

Критерии исключения

Пациенты с не бляшечным или обусловленным действием лекарственных средств псориазом.

Пациенты, которые получали лечение псориаза, в том числе светолечение любого типа, в течение 8 недель, предшествующих лечению, и лечение каким-либо стандартным вариантом местной терапии псориаза, отличным от применения смягчающих средств, в течение 4 недель, предшествующих лечению. Применение местной терапии в течение исследования было ограничено применением глюкокортикоидов класса с III по VII исключительно на волосистой коже головы, в подмышечных впадинах и паховой области.

Пациенты, у которых наблюдались клинические признаки инфекций в течение 3 недель до начала исследования или в истории болезни которых присутствуют данные о раке.

Дизайн исследования

Пилотное исследование 2 фазы еженедельного подкожного введения АПС (100 мкг) у пяти пациентов в течение одного месяца.

Протокол введения АПС

Для лечения АПС отбирают пять не имеющих других заболеваний пациентов мужского пола с хроническим бляшечным псориазом. Лекарственное средство вводят еженедельно в течение периода времени длительностью 4 недели в дозе 100 мкг.

АПС инъецируют подкожно непосредственно под псориатические бляшки. Наполнитель сам по себе (плацебо) инъецируют под контрольную бляшку, расположенную симметрично на другой стороне тела. Контрольную бляшку, сравнимую с двумя другими, отбирают для исследования без введения какой-либо инъекции.

Анализ результатов

Описательный анализ (основные данные)

Основные демографические характеристики (возраст, вес, индекс массы тела, этническую принадлежность) и характеристики заболевания (длительность псориаза, процент площади тела, пораженной псориазом, среднее значение PASI, присутствие выраженного или тяжелого псориаза), которые оценивают посредством определения статической общей оценки врача, предшествующего местного лечения, предшествующего светолечения, предшествующей системной терапии, предшествующей терапии биологическими лекарственными средствами.

Оценка эффективности и безопасности

Эффективность в течение периода от дня 1 (перед началом терапии) до 3 дней после окончания терапии (день 31) оценивают посредством фото документирования и/или ультразвукового исследования с частотой 20 мГц.

У каждого пациента тщательному наблюдению подвергают три различные бляшки (в том числе участок введения АПС и наполнителя) для определения уменьшения эхо-прозрачной полосы (которая представляет собой эпидермальный акантоз и инфильтрат в вышележащей дерме), процент улучшения фиксируют в виде индекса площади и тяжести псориаза (PASI) для каждого пациента.

Отбирают образцы биопсии кожи (образцы пункционной биопсии диаметром 4 мм) за 4 дня до начала введения АПС, через одну неделю и в день 24 (окончание терапии) для гистологического и иммуногистохимического исследования, а также анализа мРНК.

Гистология и иммуногистохимия

Гистологические исследования включают оценку основных псориатических параметров, таких как акантоз, гиперкератоз и паракератоз, митотическая активность эпидермиса, сосочковый отек, дилатация и извитость капилляров, а также содержание нейтрофилов в дерме, шиповатом слое и роговом слое, соответственно

Иммуногистохимическое исследование

Безопасность

Побочные действия, серьезные побочные действия, общепринятые гематологические и лабораторные показатели, образование антител против АПС.

Побочные действия и зуд

Реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЧЗТ).

Источники информации

1. Chiricozzi, A., Guttman-Yassky, E., Suarez-Farinas, M., Nograles, K.E., Tian, S., Cardinale, I., Chimenti, S., and Krueger, J.G. (2011) J Invest Dermatol 131, 677-687.

2. Nestle, F.O., Di Meglio, P., Qin, J.Z., and Nickoloff, B.J. (2009) Nat Rev Immunol 9, 679-691.

3. Pasparakis, M. (2009) Nat Rev Immunol 9, 778-788.

4. Pasparakis, M. (2012) Immunol Rev 246, 346-358.

5. Zanni, G.R. (2012) Consult Pharm 27, 86-88, 90, 93-86.

6. Berth-Jones, J., and Hutchinson, P.E. (1992) Br J Dermatol 127, 71-78.

7. Kurian, A., and Barankin, B. (2011) Skin Therapy Lett 16, 4-7.

8. Tran, В., and Feldman, S.R. (2011) J Dermatolog Treat 22, 18-26.

9. Herrier, R.N. (2011) American Journal of Health-System Pharmacy 68, 795-806.

10. Montesu, M.A., Addis, G.M., Satta, R., and Cottoni, F. (2011) G Ital Dermatol Venereol 146, 273-281.

11. Wallis, R.S. (2011) Infect Dis Clin North Am 25, 895-910.

12. Esmon, С.T. (2004) Crit Care Med. 32, S298-S301.

13. Xue, M., Campbell, D., and Jackson, C.J. (2007) Journal of Biological Chemistry 282, 13610-13616.

14. Xue, M., Campbell, D., Sambrook, P.N., Fukudome, K., and Jackson, C.J. (2005) J Invest Dermatol. 125, 1279-1285.

15. Esmon, С.T. (2004) Maturitas 47, 305-314.

16. Yuksel, M., Okajima, K., Uchiba, M., Horiuchi, S., and Okabe, H. (2002) Thromb. Haemost. 88, 267-273.

17. Xue, M., March, L., Sambrook, P.N., Fukudome, F., and Jackson, C.J. (2007) Ann. Rheum. Dis.

18. Xue, M., March, L., Sambrook, P.N., and Jackson, C.J. (2007) Arthritis Rheum. 56, 2864-2874.

19. Lay, A.J., Donahue, D., Tsai, M.J., and Castellino, F.J. (2007) Blood 109, 1984-1991

20. Xue, M., Thompson, P., Kelso, I., and Jackson, C. (2004) Exp Cell Res 299, 119-127.

21. van Zonneveld, A.J., de Boer, H.C, van der Veer, E.P., and Rabelink, T.J. 10 (2010) Annals of the Rheumatic Diseases 69, i57-i60.

22. Feistritzer, C, and Riewald, M. (2005) Blood 105, 3178-3184.

23. Finigan, J.H., Dudek, S.M., Singleton, P.A., Chiang, E.Т., Jacobson, J.R., Camp, S.M., Ye, S.Q., and Garcia, J.G. (2005) J. Biol. Chem.

24. Xue, M., Chow, S.O., Dervish, S., Chan, Y.K., Julovi, S.M., and Jackson, C.J. 15

(2011) Journal of Biological Chemistry 286, 6742-6750.

25. Vetrano, S., Ploplis, V.A., Sala, E., Sandoval-Cooper, M., Donahue, D.L., Correale, C, Arena, V., Spinelli, A., Repici, A., Malesci, A., Castellino, F.J., and Danese, S. (2011) Proc Natl Acad Sci USA 108, 19830-19835.

26. Uchiba, M., Okajima, K., Oike, Y., Ito, Y., Fukudome, K., Isobe, H., and Suda, T. (2004) CircRes 95, 34-41.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к дерматологии, и может быть использована для лечения поражения кожи, которое характеризуется присутствием гиперпролиферативных кератиноцитов, у индивидуума путем осуществления контакта указанной области кожи с терапевтически эффективным количеством активированного протеина С (АПС) или введения АПС в форме композиции, адаптированной для подкожного введения. Кроме того, композицию, содержащую терапевтически эффективное количество АПС, используют для лечения псориаза, акне и атопического дерматита. Также предложена композиция, содержащая терапевтически эффективное количество АПС, для применения для уменьшения выраженности поражения кожи, характеризующегося присутствием гиперпролиферативных кератиноцитов у субъекта. Группа изобретений позволяет обеспечить ингибирование воспаления, ассоциированное с псориатическими кератиноцитами, а также уменьшить чрезмерную пролиферацию. 5 н. и 13 з.п. ф-лы, 3 ил., 8 пр.

1. Способ лечения поражения кожи, которое характеризуется присутствием гиперпролиферативных кератиноцитов, у индивидуума, включающий:

обеспечение индивидуума, имеющего область кожи, которая характеризуется присутствием гиперпролиферативных кератиноцитов;

осуществление контакта указанной области кожи с терапевтически эффективным количеством активированного протеина С (АПС) или введение АПС в форме композиции, адаптированной для подкожной инъекции;

в результате чего осуществляют лечение поражения кожи у указанного индивидуума.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанное терапевтически эффективное количество АПС уменьшает воспаление в указанной области кожи.

3. Способ по п. 1 или п. 2, отличающийся тем, что указанное терапевтически эффективное количество АПС уменьшает апоптоз в указанной области кожи.

4. Способ по п. 1 или п. 2, отличающийся тем, что указанное терапевтически эффективное количество АПС не ингибирует рост нормальных кератиноцитов или вызывает пролиферацию нормальных кератиноцитов.

5. Способ по п. 1 или п. 2, отличающийся тем, что указанное терапевтически эффективное количество АПС составляет от 1 мкг до 5 мг АПС на см² области кожи.

6. Способ по п. 1 или п. 2, отличающийся тем, что АПС для осуществления контакта с указанной областью кожи обеспечивают в форме геля, крема, мази, спрея, лосьона или подобного состава, адаптированного для осуществления контакта с поверхностью кожи.

7. Способ по п. 1 или п. 2, отличающийся тем, что указанное поражение кожи характеризуется одним или несколькими из следующих процессов: апоптозом, воспалением, нарушением барьерной функции.

8. Способ по п. 1 или п. 2, отличающийся тем, что указанное поражение кожи выбрано из группы, состоящей из псориаза, герпетиформного дерматоза, обыкновенной пузырчатки и витилиго.

9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что указанное поражение кожи представляет собой не пустулезный псориаз.

10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что псориаз представляет собой обыкновенный псориаз или эритродермический псориаз.

11. Способ по п. 8, отличающийся тем, что указанное поражение кожи представляет собой пустулезный псориаз.

12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что псориаз представляет собой генерализованный пустулезный псориаз, ладонно-подошвенный пустулез, кольцевидный пустулезный псориаз, пустулезный акродерматит или герпетиформное импетиго.

13. Способ по п. 1 или п. 2, отличающийся тем, что указанная область кожи, контакт которой осуществляют с АПС, представляет собой псориатическую бляшку.

14. Способ по п. 1 или п. 2, включающий дополнительный этап обеспечения противовоспалительного агента указанному индивидууму.

15. Способ лечения псориаза у индивидуума, включающий:

обеспечение индивидуума, имеющего псориатическую бляшку;

нанесение композиции, содержащей терапевтически эффективное количество активированного протеина C (АПС), на указанную бляшку;

в результате чего осуществляют лечение псориаза у указанного индивидуума.

16. Способ лечения акне у индивидуума, включающий:

обеспечение индивидуума, имеющего акне;

нанесение композиции, содержащей терапевтически эффективное количество активированного протеина C (АПС), на акне;

в результате чего осуществляют лечение акне у указанного индивидуума.

17. Способ лечения атопического дерматита у индивидуума, включающий:

обеспечение индивидуума, имеющего атопический дерматит;

нанесение композиции, содержащей терапевтически эффективное количество активированного протеина С (АПС), на атопический дерматит;

в результате чего осуществляют лечение атопического дерматита у указанного индивидуума.

18. Композиция, содержащая терапевтически эффективное количество АПС, для применения для уменьшения выраженности поражения кожи, которое характеризуется присутствием гиперпролиферативных кератиноцитов, у индивидуума.