СПОСОБ ПОДБОРА ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ ХИМИОТЕРАПИИ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА Российский патент 2007 года по МПК G01N33/15 C12N5/08 

Изобретение относится к медицине, а именно к нейрохирургии, и может быть использовано в комплексном лечении злокачественных опухолей головного мозга, в том числе с мультифокальным характером роста.

Глиальные опухоли головного мозга составляют 50-60% всех первичных опухолей центральной нервной системы. Из них более половины составляют злокачественные формы. Наряду с хирургическим лечением важнейшим компонентом терапии больных злокачественными глиомами является методы адъювантной терапии: лучевая терапия, химиотерапия, иммунотерапия.

Оптимизация результатов комбинированного лечения злокачественных глиом связана как с поиском новых эффективных цитостатических препаратов, так и с использованием рациональных способов определения индивидуальной чувствительности конкретного новообразования к противоопухолевым препаратам. Вышеизложенные соображения определяют актуальность разработки способа индивидуального подбора цитостатических препаратов для химиотерапии.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ подбора цитостатического препарата для химиотерапии при лечении злокачественных опухолей головного мозга (Орлов Ю.А., Семенова В.М., Стайно Л.П. Оценка чувствительности глиальных опухолей мозга к воздействию темодала в цитотоксическом тесте. Украинский нейрохирургический журнал, 2004, №2 с.50-54), принятый за прототип. Изучают чувствительность злокачественных глиом головного мозга к испытуемому цитостатическому препарату в различных терапевтических концентрациях на краткосрочных суспензионных культурах, полученных из биопсийного материала. При этом за одно наблюдение тестируют только один препарат в различных концентрациях. Оценку цитотоксичности исследуемых веществ в опытных культурах проводят путем количественного определения доли поврежденных действием препарата опухолевых клеток, включивших в цитоплазму краситель (трипановый синий), сопоставляя полученные данные с контрольными наблюдениями.

Однако прототип недостаточно точен, так как:

- окраска трипановым синим выявляет только метаболически погибшие клетки, у которых нарушена проницаемость цитоплазматической мембраны: в то же время многие цитостатические препараты в применяемых концентрациях не вызывают прямую метаболическую гибель клеток, а лишь подавляют их способность к делению. Собственно гибель клеток может наступать через несколько дней и не может быть зарегистрирована сразу после обработки, как это предлагается в прототипе;

- опухоль, полученная во время операции, содержит не только опухолевые клетки, но и значительное количество нормальных клеток различного гистогенеза, при этом доля собственно живых опухолевых клеток может быть как значительной, так и не очень большой. В этих условиях сложно отличить, какие именно клетки погибают и окрашиваются трипановым синим при обработке цитостатическим препаратом;

- за одно наблюдение исследуют только один цитостатический препарат, к которому культура клетки может быть изначально химиорезистентна.

Изобретение направлено на создание способа подбора цитостатического препарата для химиотерапии при лечении злокачественных опухолей головного мозга, обеспечивающего повышение точности способа.

Сущность способа заключается в оценке чувствительности клеток злокачественной опухоли головного мозга конкретного больного к цитостатическим препаратам в терапевтических концентрациях и выборе для химиотерапии препарата, к которому опухолевые клетки максимально химиочувствительны.

Заявляемый способ отличается от прототипа тем, что из биоптата опухоли выращивают перевиваемую устойчивую линию опухолевых клеток, которую после получения устойчивого роста пересевают и обрабатывают одновременно несколькими цитотоксическими препаратами в терапевтических концентрациях, затем оценивают число вновь выросших и выживших опухолевых клеток по отношению к числу посеянных и для проведения химиотерапии используют тот препарат, при обработке которым число выживших и вновь выросших клеток минимально.

Повышение точности способа достигается за счет того что:

- в процессе обработки культуры опухолевых клеток цитостатическими препаратами оценивают долю клеток, сохранивших способность к делению. Это крайне важно, так как именно этот параметр важен для оценки чувствительности опухоли к цитостатическим препаратам.

- при пересевах in vitro клеток опухолей центральной нервной системы, как правило, вырастают только злокачественно трансформированные клетки, что может быть подтверждено морфологическими наблюдениями, поэтому оценка результатов не осложняется наличием клеток нормальных тканей (лимфоциты, макрофаги, клетки соединительной ткани и т.д.).

- одновременно за одно наблюдение может быть исследована чувствительность клеток опухоли, находящихся в разных клеточных циклах, к нескольким цитостатическим препаратам в терапевтических концентрациях;

- определение устойчивости (химиорезистентности) культуры к воздействию цитотоксического препарата предостерегает от его нецелесообразного применения.

Таким образом, с целью получения максимального лечебного эффекта для оптимального подбора препарата выявляется индивидуальная чувствительность клеток глиом к конкретным цитотоксическим препаратам.

Способ осуществляется следующим образом.

Материал, полученный из различных участков новообразования в процессе хирургической операции, диспергируют на клеточные составляющие путем стандартно принятой процедуры получения клеточных культур, использующей механическое воздействие в сочетании с ферментативной обработкой трипсином (0,2%) и ЭДТА (0,05%).

Полученную суспензию клеток высевают в пластиковые флаконы для культивирования клеток, содержащие культуральную среду с добавкой 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Культуральная среда представляет собой равную смесь стандартных сред ДМЕМ и F12, к которым добавлены: инсулин (5 мкг на мл), трансферин (20 мкг на мл), эпидермальный ростовой фактор (0,1 нг на мл), основной фактор роста фибробластов (0,1 нг на мл), путресцин (1 мк/моль), прогестерон (5 мкг на мл), бета меркаптоэтанол (50 мк/моль).

Клетки культивируют в течение недели, чтобы произошло эффективное прикрепление клеток к поверхности флакона и возникли очаги роста клеток. Затем среду меняют и клетки выращивают до заполнения флакона.

Полученную культуру выращивают и пересевают несколько раз с тем, чтобы убедится, что получилась устойчивая перевиваемая культура опухолевых клеток без примеси нормальных клеток.

Полученную культуру рассевают в стандартные 32 луночные планшеты для культур клеток по 20-50 тысяч клеток на лунку. Через сутки в среду добавляют тестируемые химиопрепараты в терапевтических концентрациях. После определенного времени обработки их удаляют и клетки тщательно промывают питательной средой.

Клеткам после обработки позволяют расти в полной питательной среде в течение 1,5-2 недель. Затем их число в обработанных и необработанных лунках подсчитывают и сопоставляют с числом изначально посеянных клеток. Таким образом, определяют способность данного цитостатического препарата убивать клетки данной опухоли и подавить их размножение.

Если количество клеток не возрастает или уменьшается в обработанных вариантах, в то время как в необработанных устойчиво растет, то считают, что цитостатический препарат эффективен в данной терапевтической концентрации.

Заявляемый способ разработан в ФГУ РНХИ им. проф. А.Л.Поленова и прошел клинические испытания при лечении 10 больных злокачественными опухолями головного мозга.

Приводим пример - выписку из истории болезни № 4213-04: Больной Р., 55 лет, поступил в отделение хирургии опухолей головного и спинного мозга с диагнозом: объемное образование передних отделов мозолистого тела с двусторонним распространением в лобные доли. 24.10.2004 г. была выполнена операция: костно-пластическая трепанация черепа в правой лобной области, частичное удаление опухоли. Послеоперационный период протекал гладко, заживление раны первичным натяжением. Гистологический диагноз: анапластическая астрацитома. Согласно заявленному способу во время операции был взят биоптат опухолевой ткани для выращивания культуры. Выращенная культура была обработана цитостатическими препаратами (нидран, темодал, цисплатин, винкристин, цитозар, гидреа). После достижения устойчивого роста в различные чаши посеяно по 40 тысяч клеток. Через две недели после обработки оценивали число выросших и выживших клеток по отношению к числу посеянных. Результаты тестирования чувствительности культуры опухоли к цитостатическим препаратам представлены в таблице.

ТаблицаЦитостатический препаратКонцентрация (мкг /мл)Время (час)Посеянные клетки (тысячи)Выросшие клетки (тысячи)Нидран60240390Темодал60240720Цисплатин10240100Винкристин30240420Цитозар + Гидреа0,1/0,52409Контроль--401100

В результате пробы выявлена высокая чувствительность культуры к комбинации препаратов цитозар+гидреа и относительная устойчивость к препаратам цисплатины, нитрозомочевины, темозоламиду. В послеоперационном периоде больному был проведен курс лучевой терапии СОД 60 Гр, после окончания которого проведен курс химиотерапии по схеме: цитозар 500 мг + Natrii Cloridi 0,9%-400,0 мл внутривенно в течение 24 часов, гидреа по 2 капсуле каждые 4 часа внутрь в течение суток. Побочных эффектов от проводимой терапии не отмечено. В течение 2-х месяцев после лечения отмечен полный регресс общемозговой и очаговой симптоматики. В настоящее время больной жив, состояние его удовлетворительное, по шкале Karaofsci 80 баллов, на контрольных МРТ томограммах признаков продолженного роста опухоли нет. Продолжается наблюдение за состоянием больного.

Использование данного способа позволило:

- определить точный индивидуальный подбор эффективного цитостатического препарата для химиотерапии;

- получить хороший результат лечения при невозможности радикального удаления объемного образования не повреждая функционально важных зон;

- сохранить хорошее качество жизни пациенту;

- добиться увеличения продолжительности жизни без рецидива в течение 18 месяцев.

Изобретение относится к области медицины, а именно к нейрохирургии, и может быть использовано при выборе цитотоксических препаратов в комплексном лечении злокачественных опухолей головного мозга. Для осуществления способа во время оперативного вмешательства из различных участков опухоли забирают материал, из которого выращивают перевиваемую устойчивую линию опухолевых клеток. После получения устойчивого роста культуру пересевают и подвергают обработке цитостатическими препаратами в терапевтических концентрациях. После обработки клеткам позволяют расти в течение 1,5-2 недель. Затем оценивают число вновь выросших и выживших опухолевых клеток по отношению к числу посеянных клеток. Для проведения химиотерапии используют тот препарат, при обработке которым число выросших и выживших клеток минимально. Способ обеспечивает повышение точности подбора цитостатического препарата. 1 табл.

Способ подбора цитостатического препарата для химиотерапии при лечении злокачественных опухолей головного мозга путем оценки чувствительности опухоли к цитостатическим препаратам, отличающийся тем, что из биоптата опухоли выращивают перевиваемую устойчивую линию опухолевых клеток, которую после получения устойчивого роста пересевают и подвергают обработке цитотоксическими препаратами в терапевтических концентрациях, после обработки клеткам позволяют расти в течение 1,5-2 недель, затем оценивают число вновь выросших и выживших опухолевых клеток по отношению к числу посеянных и для проведения химиотерапии используют тот препарат, при обработке которым число выживших и вновь выросших клеток минимально.