СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ Российский патент 2008 года по МПК G01N33/49 

Изобретение относится к биохимии, медицине и иммунологии и может быть использовано для диагностики аутоиммунных заболеваний, характеризующихся появлением и накоплением в крови больных антител, специфичных к нативной ДНК больного.

Для определения аутоантител к нативной ДНК используют различные по чувствительности методы, зачастую трудоемкие и не поддающиеся автоматизации. Наиболее часто используют варианты иммуноферментного анализа, в которых сначала на поверхность полистирольных планшетов для иммуноанализа наносят препарат антигена (нативной или денатурированной ДНК), после чего добавляют сыворотку крови больного и далее - препарат конъюгата специфического антитела и индикаторного фермента (пероксидазы), после чего в реакционную смесь вносят субстрат фермента, дающий в реакции с ферментом окрашенные продукты. Положительным результатом (наличие антител к ДНК в сыворотке крови) служит появление окраски, интенсивность которой зависит от концентрации антител в крови больного. Метод отличается высокой чувствительностью (определение антител в сыворотках с оптимальных рабочим разведением 1:100), но имеет следующие недостатки: (1) длительность стадий инкубирования (общая продолжительность анализа более двух часов); (2) многостадийность определения (три стадии с промежуточными отмывками), (3) необходимость применения конъюгата индикаторного фермента со специфичными антителами (патент РФ №2059245, G01N 33/53, 1996 г., Егоров A.M.. Осипов А.П. и др. Теория и практика иммуноферментного анализа. Москва: Высшая школа, 1991. - 288 с.)

Наиболее близким к изобретению является способ определения антител в сыворотке крови. В соответствии с ним сыворотку крови смешивали с конъюгатом хлорофоса с денатурированной ДНК, после перемешивания в течение 15 минут вводили раствор специфичного субстрата бутирилхолинэстеразы - бутирилтиохолин иодида, опускали ферментный электрод на основе стационарного ртутнопленочного электрода и бутирилхолинэстеразы, включенной в пленку из нитрата целлюлозы. Концентрацию антител измеряли по высоте пика тока на осцилловольтамперограмме раствора при -0.55±0.05 В, высота которого растет пропорционально концентрации антител в сыворотке крови. По сравнению с стандартными вариантами иммуноферментного анализа применение ферментного электрода сокращает продолжительность измерения до 20-30 мин, обеспечивает возможность автоматизации измерений (а.с. СССР №1832198, G01N 33/53, 1993 г.).

К недостаткам прототипа относятся: использование в составе ферментного электрода высокотоксичной ртути; необходимость синтеза конъюгата ДНК и модулятора активности фермента (хлорофос); использование дорогостоящего фермента; необходимость в специальном оборудовании для измерения сигнала для удаления кислорода из рабочего раствора и измерения осцилловольтамперограмм.

В основу настоящего изобретения положена задача создания более эффективного способа определения антител в сыворотке крови, который может быть использован для диагностики заболеваний, характеризующихся появлением и накоплением в крови больных антител, специфичных к ДНК больного.

Поставленная задача решается так, что в способе определения антител в сыворотке крови, включающем инкубирование сыворотки крови и ДНК с последующей регистрацией взаимодействия ДНК и антител, при которой диагностическим признаком присутствия антител в сыворотке крови являются кривые измерения параметров электрохимической ячейки, состоящей из измерительного электрода и электрода сравнения, инкубирование сыворотки крови и ДНК проводят на измерительном электроде, поверхность которого предварительно покрывают полианилином, в качестве электрода сравнения берут хлоридсеребряный электрод, причем сыворотки крови перед инкубацией разбавляют буферным раствором в объемном соотношении 1:(20-50).

Способ осуществляют следующим образом.

Измерительный электрод из стеклоуглерода механически зачищают до зеркальной поверхности, промывают ацетоном, дистиллированной водой и помещают в 5 мл 0.2 М серной кислоты. На электрод накладывают потенциал +800 мВ на 3 мин и далее проводят электролиз в диапазоне потенциалов от -300 мВ до +800 мВ (9 циклов при скорости изменения потенциала 40 мВ/с) для подготовки рабочей торцевой поверхности электрода. Далее наносят покрытие полианилина. Для этого в ячейку добавляют 30-50 мкл анилина, электрод поляризуют в режиме линейного циклического изменения потенциала в диапазоне от -300 мВ до +800 мВ (10 циклов при скорости изменения потенциала 50 мВ/с), после чего электрод вынимают из ячейки, промывают водой и подсушивают. Готовят смесь, состоящую из 10 мкл раствора 0.025 мг/мл высокополимерной ДНК из эритроцитов цыпленка в 0.001 М фосфатном буферном растворе, рН 7.5, и 2 мкл 3% раствора глутарового альдегида в дистиллированной воде. На электрод, закрепленный рабочей торцевой поверхностью вверх, наносят 2 мкл смеси и сушат при комнатной температуре. После высыхания измерительный электрод промывают в фосфатном буферном растворе и дистиллированной воде.

Для обнаружения антител измерительный электрод помещают в ячейку, содержащую 5 мл 0.001 М фосфатного буферного раствора, содержащего 0.03 М сульфат натрия, рН 3.0, и с помощью стандартного рН-метра-иономера измеряют эдс ячейки относительно хлоридсеребряного электрода сравнения. Через 20 мин измерительный электрод вынимают из электрохимической ячейки, промывают дистиллированной водой и подсушивают. Затем электрод, покрытый полианилином и ДНК, закрепляют торцевой рабочей поверхностью вверх и на нее наносят 5 мкл разбавленной сыворотки крови больного. Для предотвращения высыхания сыворотки электрод закрывают пластиковой пробиркой Эппендорфа объемом 1 мл. Через 10 мин каплю разбавленной сыворотки крови смывают рабочим буферным раствором, измерительный электрод помещают в электрохимическую ячейку и измерение эдс повторяют. Типичная кривая изменения эдс во времени до и после контакта измерительного электрода, покрытого полианилином и ДНК, с сывороткой крови приведена на фиг.1.

В качестве контроля используют измерение эдс после контакта электрода с 0.001 М фосфатным буферным раствором, рН 7.5, используемым вместо сыворотки крови. Процедура контрольного измерения аналогична проводимому с разбавленной сывороткой крови, как описано выше.

Количественную характеристику изменения эдс после инкубирования сыворотки крови и ДНК на электроде определяют:

1) по положению минимума на кривых изменения эдс во времени (метод минимумов); расчет производится по формуле:

ΔЕ=E₂-E₁,

где ΔЕ, мВ, - изменение эдс, характеризующее присутствие антител в сыворотке крови, Е₁, мВ, и Е₂, мВ, - значения эдс, соответствующие минимумам, наблюдаемым на временных зависимостях эдс, регистрируемых до и после контакта электрода с сывороткой крови соответственно (Камман К. Работа с ионоселективными электродами. Москва: Мир, 1980. - 205-207 с.).

Способ расчета представлен на фиг.2.

2) по смещению кривой изменения эдс после прохождения минимума, аппроксимируемому линейной функцией (метод вычета базовой линии). Расчет производится следующим образом. Сначала строят линейную регрессию Е=а+b×t на участке кривой изменения эдс Е, мВ, во времени t, с, регистрируемой до контакта электрода с сывороткой крови. Находят по уравнению значение E₁, соответствующее величине эдс при времени t′.

Значение t′ рассчитывают следующим образом:

t′=1200+t₂

где 1200 с - время измерения эдс до контакта электрода с сывороткой крови, t₂ - время появления минимума на временной зависимости эдс, регистрируемой после контакта электрода с сывороткой крови. После этого рассчитывают изменение эдс Е, мВ, характеризующее содержание антител в сыворотке крови:

ΔЕ=Е₂-E₁

где Е₂ - эдс минимума на временной зависимости эдс, регистрируемой после контакта электрода с сывороткой крови, E₁ - аппроксимированное значение эдс до контакта электрода с сывороткой крови, которое наблюдалось бы во время t₂ появления минимума (Камман К. Работа с ионоселективными электродами. Москва: Мир, 1980. - 205-207 с.).

Способ расчета представлен на фиг.3.

Примеры определения антител к ДНК в сыворотках крови двумя описанными методами приведены ниже.

Пример 1. Сыворотка крови здорового донора. На зависимости изменения эдс ΔЕ от разбавления сыворотки крови наблюдается нерегулярное изменение сигнала, по величине близкое к удвоенному значению погрешности измерения эдс в контрольном измерении (±3 мВ) (фиг.4).

Пример 2. Сыворотка крови больного системной красной волчанкой (высокий уровень антител к ДНК по результатам иммуноферментного анализа). На зависимости изменения эдс ΔЕ от разбавления сыворотки наблюдается максимум при разбавлении сыворотки 1:20-1:50 (фиг.5).

Пример 3. Сыворотка крови больного системным аутоиммунным тиреоидитом (присутствие антител к ДНК подтверждено результатами иммуноферментного анализа). На зависимости изменения эдс ΔЕ от разбавления сыворотки наблюдается максимум при разбавлении 1:20-1:50 (фиг.6).

Положение максимума, вычисленного двумя методами, на графиках (фиг.5 и 6) позволяет предположить, что при разбавлении 1:20-1:50 измерительный электрод обладает наибольшей чувствительностью к присутствию антител к ДНК в сыворотке крови.

Диагностическим критерием для больных системной красной волчанкой (пример 2) является увеличение значения ΔЕ на 80±20% при разведении сыворотки 1:20 и 1:50 относительно контрольного измерения.

Диагностическим критерием для больных аутоиммунным тиреоидитом (пример 3) является увеличение значения ΔЕ на 70±20% при разведении сыворотки 1:20 и 1:50 относительно контрольного измерения.

Результаты расчета диагностических критериев для примеров 1-3 приведены в табл.1

Таблица 1№ п/пРазбавление1). Метод вычета базовой линии2). Метод минимумовΔЕ, мВ% отн. контроляΔЕ, мВ% отн. контроля11:20133450 1:501515531721:2026948180 1:502372756731:2023706953 1:5019507158

По сравнению с прототипом предлагаемый способ имеет следующие преимущества:

1) Отсутствует необходимость в синтезе конъюгатов и применении ферментов и токсичной ртути;

2) Все измерения проводятся в одном растворе при однократном добавлении разбавленной сыворотки;

3) Отсутствует мешающее влияние сывороточных белков и других компонентов сыворотки.

4) Измерения можно проводить с помощью стандартного серийного оборудования (рН-метров или иономеров, обеспечивающих измерение эдс с точностью не хуже 0.1 мВ).

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимии и иммунологии, и может быть использовано для диагностики аутоиммунных заболеваний, характеризующихся появлением и накоплением в крови больных антител, специфичных к нативной ДНК больного. Для определения антител инкубируют сыворотку крови и ДНК с последующей регистрацией взаимодействия ДНК и антител. При этом диагностическим признаком присутствия антител в сыворотке крови являются кривые измерения параметров электрохимической ячейки. Электрохимическая ячейка состоит из измерительного электрода и электрода сравнения. Инкубирование сыворотки крови и ДНК проводят на измерительном электроде, поверхность которого предварительно покрывают полианилином. В качестве электрода сравнения берут хлоридсеребряный электрод. Сыворотки крови перед инкубацией разбавляют буферным раствором в объемном соотношении 1:(20-50). Использование способа позволяет повысить точность и эффективность определения антител в сыворотке крови. 6 ил., 1 табл.

Способ определения антител в сыворотке крови, включающий инкубирование сыворотки крови и ДНК с последующей регистрацией взаимодействия ДНК и антител, при которой диагностическим признаком присутствия антител в сыворотке крови являются кривые измерения параметров электрохимической ячейки, состоящей из измерительного электрода и электрода сравнения, отличающийся тем, что инкубирование сыворотки крови и ДНК проводят на измерительном электроде, который предварительно покрывают полианилином, в качестве электрода сравнения берут хлоридсеребряный электрод, измеряют эдс во времени до и после контакта измерительного электрода с сывороткой крови, причем сыворотку крови предварительно разбавляют в объемном соотношении 1:(20-50).