ШТАММ БАКТЕРИЙ YERSINIA PESTIS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В КАЧЕСТВЕ ТЕСТ-ШТАММА ЦЕНТРАЛЬНО-КАВКАЗСКОГО ВЫСОКОГОРНОГО ПРИРОДНОГО ОЧАГА ЧУМЫ Российский патент 2008 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 C12R1/01 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано при изучении свежевыделенных штаммов возбудителя чумы в Центрально-Кавказском высокогорном природном очаге чумы, а также для исследовательских работ по генетике и биохимии.

Полученные в результате эпизоотологического обследования и экспериментальных наблюдений сведения позволяют утверждать, что Центрально-Кавказский высокогорный природный очаг чумы, характеризуясь в целом постоянством эпизоотической активности на протяжении многих лет и невысокой эпидемичностью, обладает уникальными особенностями: ландшафтно-географической изолированностью и мозаичностью поселений основного носителя; широким диапазоном его чувствительности к чумному микробу, гетерогенностью штаммов возбудителя чумы, циркулирующих на разных участках очаговости, по признаку ауксотрофности в отношении пролина и ряду других свойств [Акиев А.К. с соавт., 1972, 1978; Дятлов А.И. с соавт., 1979, 1990, 2001; Куклев Е.В. с соавт., 2001 и др.].

Недостатком имевшихся природных штаммов чумного микроба является их фенотипическая неоднородность, а главное низкий уровень вирулентности, который неумолимо снижается при хранении на искусственных питательных средах и крайне редко восстанавливается.

Целью изобретения является селекция штамма Yersinia pestis C-781, который обладает высокой вирулентностью и стабильными биологическими свойствами и может быть использован при идентификации, изучении свежевыделенных штаммов, а также в генетических экспериментах и для расшифровки механизма межэпизоотического периода.

Поставленная цель достигается изоляцией тест-штамма из внутренних органов горных сусликов.

Преимущества заявленного штамма перед известными, обеспечивающие решение поставленной задачи, заключаются в том, что он является вирулентным для лабораторных животных, имеет 97,5±2,5 колониеобразующих единиц, которые синтезируют капсулу, а также стабильно сохраняют свои культурально-морфологические и биохимические свойства, типичные для чумного микроба, циркулирующего в Центрально-Кавказском высокогорном природном очаге чумы (срок наблюдения 5 лет).

Штамм бактерий Yersinia pestis C-781 имеет следующие характеристики:

Культурально-морфологические свойства. Возбудитель в мазках представляет собой биполярно окрашенные палочки. Грамотрицателен.

Штамм неподвижен. Образует капсулу.

Изолированные колонии серовато-белого цвета, круглой формы с выпуклым рыхло-зернистым центром. Края колонии плоские, нежные, напоминающие кружево. В бульоне хлопьевидный осадок и нежная пленка на поверхности.

Вирулентность. Изучалась на белых мышах.

С этой целью белых мышей заражали подкожно дозами 10², 10³, 10⁴ и 10⁵ м.к. (по 4 на дозу). Для количественной характеристики вирулентности исчисляли LD₅₀ методом Кербера. При испытании на 3-9 сутки после заражения. Павших животных исследовали бактериологическим методом. С этой целью делали посевы тканей из места инокуляции бактерий, из регионарных лимфатических узлов, внутренних органов, крови. Диагноз чумы у павших подтверждался ростом культуры.

Патологоанатомические изменения варьировались от сугубо местных (в первичном комплексе) до типичных для септической чумы. В наиболее ярких случаях они сводились к гнойному инфильтрату, гематоме, слизистому отеку в месте введения микроба, увеличению регионарных лимфатических узлов, гиперемии печени, некротическим изменениям в печени и селезенке.

Биохимическая активность штамма. Не обладает протеолитической активностью. При ферментации углеводов и спиртов не образует газа, глицириннегативен, ферментирует арабинозу, не ферментирует рамнозу, не восстанавливает нитраты в нитриты, не проявляет уреазной активности.

Отношение к специфическим бактериофагам. Лизируется чумным фагом Покровской, псевдотуберкулезным и Л-413 «С» бактериофагами.

Отношение штамма к видовой диагностической сыворотке. При окраске иммуноглобулинами диагностическими чумными люминесцирующими регистрируется специфическое свечение.

Питательные потребности. Является факультативным анаэробом. Хорошо растет на агаре и в бульоне Хоттингера, Мартена, рН 6,8-7,2 ед. Температурный оптимум 28±2°С. На минимальной синтетической среде растет с четырьмя аминокислотами: фенилаланин, метионин, цистеин, треонин.

Генетические особенности штамма. Штамм имеет плазмиды pFra⁺, pCad⁺, pPst⁺, p˜4 МД^-.

Чувствительность к антибиотикам. Штамм чувствителен к стрептомицину, тетрациклину, рифампицину, цефалексину, цефалатину, гентамицину, устойчив к эритромицину.

Условия хранения штамма. На скошенном агаре Хоттингера рН 7,2±0,2 ед. в запаянных пробирках при температуре +4°С.

Способ получения штамма. Yersinia pestis C-781 изолирован методом прямого посева на плотный агар Хоттингера рН 7,2±0,2 ед. внутренних органов агонирующего горного суслика, отловленного в урочище Джылысу Кабардино-Балкарской республики 26 июля 2001 г. Штамм последовательно пятикратно пассирован через организм активных переносчиков чумы - блох Xenopsylla cheopis, хранился на скошенном агаре Хоттингера рН 7,2±0,2 ед. в запаянных пробирках при температуре +4°С в течение года, с последующим заражением лабораторных животных (белые мыши, морские свинки).

Установленная гетерогенность по ряду свойств возбудителя чумы Центрально-Кавказского высокогорного природного очага, особенности его взаимоотношений с организмом основного носителя ставят вопрос о конкурентоспособности штаммов чумного микроба.

ПРИМЕР 1. Определение конкурентоспособности штаммов чумного микроба, выделенных в Центрально-Кавказском высокогорном и Восточно-Кавказском высокогорном природных очагах чумы, в организме естественных носителей и лабораторных животных.

Животных заражали смесью штаммов по 5·10³ (5·10⁴) м.к. каждого в общей дозе 10⁴ м.к. в объеме 0,1 мл для белых мышей. Ежедневно в течение 1-6 суток, а затем на 8, 10, 12, 15 забивали по 2-4 животных. От павших и забитых грызунов получали субкультуры из регионарных лимфоузлов, внутренних органов и крови.

Популяции полученных субкультур чумного микроба не менее 500 м.к. изучали по признаку ферментации рамнозы, рассчитывая процентное соотношение клеток с различной маркировкой. Штаммы, изолированные в Восточно-Кавказском высокогорном природном очаге, кавказского подвида ферментируют рамнозу, а штаммы основного подвида, выделенные в Центрально-Кавказском высокогорном очаге, не ферментируют рамнозу.

ПРИМЕР 2. Определение конкурентоспособности свежевыделенных штаммов и тест-штамма Центрально-Кавказского высокогорного природного очага чумы.

В опытах использовали синтетические среды с 5 (метионин, треонин, цистеин, фенилаланин, пролин), 4 (метионин, треонин, цистеин, фенилаланин) аминокислотами и без аминокислот, основу которых составляла забуференная фосфатно-солевая среда. Животных заражали аналогично примеру 1. От павших и забитых животных популяции субкультур чумного микроба на менее 500 м.к. изучали по признаку потребности в факторах роста. Методом реплик, делая отпечатки на синтетических средах, а также для контроля на агаре Хоттингера рН 7,2±0,2 и фосфатно-солевой среде. Результаты учитывали на 4-10 сутки.

Таким образом, заявленный штамм Yersinia pestis C-781 может служить тест-штаммом при изучении штаммов возбудителя чумы, выделенных в Центрально-Кавказском высокогорном природном очаге чумы, а также для исследовательских работ по генетике и биохимии.

Изобретение относится к медицинской микробиологии. Штамм бактерий Yersinia pestis C-781 получен путем прямого посева внутренних органов больного горного суслика на плотный агар Хоттингера pH 7,2±0,2 ед. Штамм последовательно пятикратно пассирован через организм активных переносчиков чумы - блох Xenopsylla cheopis, хранился на скошенном агаре Хоттингера pH 7,2±0,2 ед. в запаянных пробирках при температуре +4°С в течение года и затем использовался для заражения лабораторных животных (белых мышей, морских свинок). Выявленная способность сохранения и восстановления вирулентности, стабильность биологических свойств штамма позволяет использовать штамм Yersinia pestis C-781 в качестве тест-штамма при выявлении штаммов чумного микроба в Центрально-Кавказском высокогорном природном очаге чумы.

Штамм бактерий Yersinia pestis C-781, используемый в качестве тест-штамма при изучении свежевыделенных штаммов возбудителя чумы.