ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ПЛОТНАЯ ДЛЯ ХРАНЕНИЯ МИКРОБА ЧУМЫ Российский патент 2019 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 C12R1/01 

Изобретение относится к биотехнологии, именно к получению питательных сред, которые создают оптимальные условия для хранения микроба чумы.

Известна питательная среда Романова для сохранения жизнеспособности микроорганизмов, основой которой является панкреатический гидролизат казеина-8,0; натрия хлорида-5,0 агара 10,0; дистиллированная вода до 1 л; pH 7,1±0.1 (после автоклавирования). Панкреатический гидролизат казеина смешивают с дистиллированной водой из расчета 3 г сухих веществ на 1 л, вносят натрий хлористый до 5 г/л (с учетом содержания Cl в гидролизате казеина) и агар, устанавливают pH 8,0-8,2 10% раствором натрия гидроокиси. Расплавление агара производят в автоклаве при 100°C в течение 1 ч, затем среду фильтруют через ватно-марлевый фильтр, устанавливают pH 7,2-7,4 5% раствором соляной кислоты, разливают по 5 мл в пробирки и стерилизуют при 120°C - 20 мин. Готовая среда годна к употреблению в течение 2-х месяцев со дня приготовления при условии хранения ее при температуре 6±2°C. (Приказ №31 от 13 января 1983 г. Об унификации методов контроля медицинских иммунобиологических препаратов. Москва - 1983 г. С. 21-22.)

Недостатком данной среды является малый срок хранения только 2 месяца.

Наиболее близкой к предполагаемому изобретению относится питательная среда - агар Хоттингера pH 7,2±0.1 для хранения микроба чумы, основой которой является ферментативный гидролизат говяжьего мяса до 170,0 мл; натрия хлорид - 5,0 г; агар микробиологический - 10,0-12,0 г; pH 7,0±0,2. Среду разливают по 7 мл в бактериологические пробирки, автоклавируют 30 мин при температуре 121°C, охлаждают до температуры 56°, затем скашивают. Рабочие субкультуры хранят на скошенном агаре в пробирках. Пересевы культур проводят не менее 1 раза в 3 мес., но не более четырех раз в год. (по МУК 4.2.2316-88, с. 33; МУ 3.3.2.2124-06 с. 7).

Недостатком данной среды является, то что пересевы культур проводят не менее 1 раза в 3 мес., но не более четырех раз в год.

Целью изобретения является получение качественной питательной среды плотной для хранения микроба чумы на белковой основе из растительного сырья - ферментативного гидролизата кукурузного экстракта сгущенный, которая обеспечивает визуально обнаруживаемый рост на пробирках с питательной средой в течение длительного времени при температуре выращивания 27±1°C на всех засеянных пробирках с питательной средой, а также значительный экономический эффект.

Сущность предполагаемого изобретения заключается в том, что питательная среда плотная в качестве питательной основы содержит ферментативный гидролизат кукурузного экстракта сгущенный, а также соли: натрий хлористый, натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный, агар микробиологический и питьевую воду, при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

Ферментативный гидролизат кукурузного экстракта сгущенный 40,0-56,0 Натрий хлористый 4,0-6,0 Натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный 3,0-5,0 Агар микробиологический 8,0-12,0 Питьевая вода до 1 л.

В качестве исходного сырья используют кукурузный экстракт сгущенный, содержащий в среднем 9,4% белка. Благодаря высокому содержанию в сухом остатке азотистых веществ (до 45%) и углеводов (до 25%), экстракт является хорошей питательной средой при производстве пенициллина и других антибиотиков, а также витаминов. Кроме того, он богат микроэлементами, мг/кг: цинк 22; марганец 5; медь 5; кобальт 0,02; йод 0,30, макроэлементами, в %: фосфора 0,25; натрия 0,04; кальция 0,59; калия 0,36; магния 0,12; серы 0,11; хлора 0,04; аминокислотами, в %: аргинина 90,0; гистидина 72,0; лейцина 72,0; изолейцина 89,0; фенилаланин 59,0; треонин 95,0; валин 12,7; лизина 0,96; метионина 0,56; триптофана 0,22; метионин + цистин 0,27 и витаминами, мг/кг: каротин (витамин А) 8,0; B₁ 4,0; B₂ 1,0; B₃ (пантотеновая кислота) 6,5; B₄ (холин) 400; B₅ 17; B₆ 2,9. Как известно (И.В. Петрухин, 1989), кукурузные белки характеризуются повышенным содержанием треонина, гистидина, лейцина, валина, поставляющих макроэргические связи, кукурузные белки содержат также большое количество таких незаменимых аминокислот как изолейцин, лейцин, аргинин, фенилаланином. (М.Ф. Нестерин, И.М. Скурихин. Химический состав пищевых продуктов. Москва. «Пищевая промышленность». 1979. 247 с). Имеются также сведения о способности лейцина, как аминокислоты с разветвленной белковой цепью, инициировать синтез белка (Е. А. Газов, X. С.Морган, / США / 1989).

Натрий хлористый, хч, ГОСТ 4233-77 партия 24, срок годности 12.2015. Бактерии нуждаются в минимальном количестве солей. Будучи растворены в питательной среде и находясь в состоянии электролитического распада, ионизируемые минеральные соединения являются одновременно катализаторами различных химических процессов, происходящих в микробной клетке.

Включение в состав среды натрия фосфорнокислого 2 замещенного 12 водного обосновано широким использованием фосфатов при приготовлении питательных сред, т.к. это единственные неорганические соединения, обладающие буферным действием в физиологически важном диапазоне pH, они малотоксичны (Методические рекомендации по изготовлению и использованию питательных сред и растворов для микробиологических целей, культивирования клеток и вирусов - М., 1989). (М.С. Поляк; В.И. Сухаревич; М.Э. Сухаревич. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии. СПб.: ЭЛБИ-СПб. - 2008. - С. 37-38).

Агар микробиологический - агар бактериологический (европейский тип). Производитель: «Pronadisa» Испания. Партия LF 15130184. Срок годности до 10.2017 г. Дата изготовления: октябрь 2013 г.

Питьевая вода-ГОСТ Р 51232-98 отвечает всем гигиеническим требованиям.

Приготовление ферментативного гидролизата из кукурузного экстракта сгущенный.

Способ приготовления питательной основы для хранения микроба чумы заключается в следующем: кукурузный экстракт сгущенный в количестве 4,0 кг помещают в варочный котел, затем добавляют 24 л питьевой воды кипятят в течение 5 минут, устанавливают pH до 8,2 40% раствором натрия гидроокиси в количестве 52 мл, затем настой сливают в 10 л баллоны, охлаждают до 46°C. В остуженный настой добавляют поджелудочную железу крупного рогатого скота (КРС) из расчета 30,0 на 1 л, устанавливают pH до 8,2-8,5, добавляют 1,5% хлороформа. Гидролиз ведут в термокамере при температуре 46°C в течение 10 сут. В первые 24 ч смесь перемешивают через каждые 15 мин, в последующем смесь перемешивают через каждые 2 ч. Ежедневно измеряют уровень аминного азота. На 10 сутки аминный азот составляет 1120 мг%, а сухой остаток соответственно 25,5%. С прекращением нарастания аминного азота, что бывает на 7-10 сутки, прекращают перемешивать и подогревать. Дают отстояться в течение 2 суток, затем жидкость отфильтровывают от осадка на пресс-фильтре, разливают по бутылям с добавлением 1% хлороформа, пробкуют стерильными резиновыми пробками и хранят при температуре 4-6°C.

Приготовление питательной среды плотной

Питательную среду на основе ферментативного гидролизата кукурузного экстракта сгущенный для хранения микроба чумы готовят следующим способом: ферментативный гидролизат, разбавленный питьевой водой до показания аминного азота 0,12% 48 мл, натрий хлористый 5,0; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водного 4,0; агар микробиологический 17,0; питьевая вода до 1 литра. Среду кипятят до полого растворения, затем устанавливают pH 7,2±0,1 с помощью 20% раствора натрия гидроокиси, разливают в бактериологические пробирки по 7,0 мл, затем стерилизуют при 1 атм. в течение 10 мин. После стерилизации, охлаждают до 56°C, затем скашивают.

Перед приготовлением культуры каждого штамма со среды хранения пересевают на чашки Петри с агаром Хоттингера pH 7,2±,1 (МУК 4.1./4.2.588-96, с. 45), инкубируют при температуре (28±1)°C в течение (48±1) ч. Выросшие на питательном агаре культуры каждого штамма проверяют визуально на чистоту роста и пересевают на скошенный в пробирках питательный агар. Одновременно контролируют ее культурально - морфологические и ферментативные свойства, высевают по 2 пробирки со средами Гисса с сахарозой, лактозой, рамнозой и глицерином, к которым добавляют индикатор Андреде, и высевают на 3 чашки Петри с агаром Хоттингера pH,3±0,1. Также культуру высевают на 3 чашки Петри с агаром Хоттингера pH,1±0,1, которые в дальнейшем используют последовательного рассева с целью получения изолированных колоний. Все чашки Петри с посевами помещают на (48±2) ч для выращивания в термостат при температуре (27±1)°C. В том случае, если культура без диссоциации т.е. морфология колоний типична для микроба чумы и штаммы стойко удерживают свой биохимический тип. Посевы инкубируют (24±1) ч при (27±1)°C. Через сутки пробирки с культурой высевают на скошенные поверхности исследуемой плотной питательной среды в количестве 1 бактериологической петли, затем выращивают термостате в течение (48±2) ч. при (27±1)°C. Пробирки с посевами запаивают и хранят при температуре (5±1)°C в течение 12-18 месяцев (срок наблюдения). В опыте были использованы девять штаммов возбудителя чумы из коллекции института. Семь штаммов Yersinia pestis sybspecies pestis из Центрально-Кавказского высокогорного, и Прикаспийского песчаного природных очагов чумы. Пять штаммов (С-767, С-787, С-788, С-839, С-840) были изолированы в разные годы от основных переносчиков (блох Nosopsyllus laeviceps, Neopsylla.setosa, Nosopsyllus. mokrzeckyi) с очеса гребенщиковых и полуденных песчанок, малого суслика и серого хомячка в Прикаспийском песчаном природном очаге. Два штамма (С-724, С-780) были выделены в Центрально-Кавказском высокогорном очаге от блох Ceratophilus tesquorum. Штаммы проявляли биологические свойства, типичные для основного подвида. Для их роста на синтетических питательных средах необходимы метионин, треонин, фенилаланин, цистеин, одному из штаммов (С-724) дополнительно требуется пролин. Две культуры (С-744, С-831), выделенные в разные годы в Восточно-Кавказском высокогорном природном очаге от блох {Frontopsylla. elata и Ctenophthalmus. intermedins), проявляли свойства, характерные для Y. pestis sybspecies caucasica.

Учет результатов:

Для плотных сред проводят учет ежемесячно. После чего изучают культурально - морфологические и биохимические свойства, лизироваться бактериофагами: поливалентным Покровской и Л-413С. По морфологии - должны быть грамотрицательными палочками с закругленными концами, неподвижные, на агаре образовывать колонии в R-форме не менее 1 мм в диаметре с шероховатым центром коричневого цвета и кружевной зоной. Биохимические свойства - должны ферментировать глюкозу, манит, и мальтозу, не должны ферментировать глицерин и рамнозу.

Пример 1. Культуры микроба чумы выращивали на скошенной поверхности питательной среды плотной для хранения микроба чумы, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат кукурузного экстракта сгущенный 40,0; натрий хлористый 4,0; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12 водный 3,0; агар микробиологический 8,0; питьевую воду до 1 л. При таком соотношении ингредиентов при окраске мазков по Граму - грамотрицательные палочки с закругленными концами, на агаре вырастают колонии в R-форме, диаметром 1,1 мм, с менее выраженной кружевной зоной, ферментируют глюкозу, манит, и мальтозу, не ферментируют глицерин и рамнозу, лизируются чумными бактериофагами: поливалентным Покровской и Л-413С.Культуры микроба чумы сохраняются в течение 1 года.

Пример 2. Культуры микроба чумы выращивали на скошенной поверхности питательной среды плотной для хранения микроба чумы, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат кукурузного экстракта сгущенный 48,0; натрий хлористый 5,0; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12 водный 4,0; агар микробиологический 10,0; питьевую воду до 1 л. При таком соотношении ингредиентов при окраске мазков по Граму - грамотрицательные палочки с закругленными концами, на агаре вырастают колонии в R-форме, диаметром 1,8 мм, с выраженной кружевной зоной, ферментируют глюкозу, манит, и мальтозу, не ферментируют глицерин и рамнозу, лизируются чумными бактериофагами: поливалентным Покровской и Л-413С. Культуры микроба чумы сохраняются в течение 18 месяцев.

Пример 3. Культуры микроба чумы выращивали на скошенной поверхности питательной среды плотной для хранения микроба чумы, содержащей, г/л; ферментативный гидролизат кукурузного экстракта сгущенный 56,0; натрий хлористый 6,0; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12 водный 5,0; агар микробиологический 12,0; питьевую воду до 1 л. При таком соотношении ингредиентов при окраске мазков по Граму - грамотрицательные палочки с закругленными концами, на агаре образовывают колонии в R-форме, диаметром 1,0 мм, с менее выраженной кружевной зоной, ферментируют глюкозу, манит, и мальтозу, не ферментируют глицерин и рамнозу, лизируются чумными бактериофагами: поливалентным Покровской и Л-413С. Культуры микроба чумы сохраняются в течение 11 месяцев.

Таким образом, заявленная питательная среда плотная для хранения микроба чумы (пример 2), приготовленная на основе ферментативного гидролизата кукурузного экстракта сгущенный может применяться для хранения микроба чумы, которая обеспечивает визуально обнаруживаемый рост в течение 18 месяцев (срок наблюдения) с сохранением культурально - морфологических и биохимических свойств, лизируются чумными бактериофагами: поливалентным Покровской и Л-413С. При хранении микроба чумы на плотной питательной среде основой которой является ферментативный гидролизат кукурузного экстракта сгущенный нет необходимости пересевать культуры часто, достаточно 1 раз в 18 месяцев. Отмечается значительный экономический эффект при замене мясных питательных основ на кукурузные. Рентабельность составляет 35 процентов.

Изобретение относится к микробиологии, в частности к питательным средам для микроорганизмов. Питательная среда плотная для хранения микроба чумы содержит ферментативный гидролизат кукурузного экстракта сгущенный, натрий хлористый, натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный, агар микробиологический и питьевую воду при заданном содержании компонентов. Изобретение позволяет сохранить культурально – морфологические и биохимические свойства микроба чумы в течение 18 месяцев. 3 пр.

Питательная среда плотная для хранения микроба чумы, содержащая, г/л:

Ферментативный гидролизат кукурузного экстракта сгущенный 40,0-56,0 Натрий хлористый 4,0-6,0 Натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный 3,0-5,0 Агар микробиологический 8,0-12,0 Питьевая вода До 1 л