ШТАММ БАКТЕРИЙ YERSINIA PESTIS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В КАЧЕСТВЕ ТЕСТ-ШТАММА, РЕЗИСТЕНТНОГО К ЧУМНОМУ БАКТЕРИОФАГУ Л-413 "С" Российский патент 2003 года по МПК C12N1/20 C12N7/00 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при идентификации фагорезистентных штаммов чумного микроба, изучении свежевыделенных штаммов возбудителя чумы в Центрально-Кавказском природном очаге чумы, а также для исследовательских работ но генетике и биохимии.

Г. Ю. Пак и соавт. (1985) зарегистрировали 27 штаммов чумного микроба, резистентных к действию бактериофага Л-413 "C". Из них 8 выделены из Среднеазиатского пустынного очага, 16 - из Тянь-шанского очага и 3 штамма выделены за рубежом.

В природных же очагах чумы Кавказа и Закавказья случаев выделения штаммов чумного микроба, резистентных к фагу Л-413 "С" не зарегистрировано. Случаи выделения фагорезистентных культур чумного микроба указывают на то, что в природных очагах возбудитель чумы контактирует с чумными фагами 11 серовара, к которому и относится бактериофаг Л-413 "С". Вероятность циркуляции фагорезистентных штаммов в очагах чумы очень велика, поэтому необходимо изучить их биологические свойства, чтобы определить эпидемическую значимость.

Недостатком имевшихся природных фагорезистентных штаммов чумного микроба является то, что по своим биологическим свойствам они не соответствуют штаммам Центрально-Кавказского природного очага чумы.

Целью изобретения является селекция резистентного к Л-413 "С" фагу субкультуры чумного микроба в Центрально-Кавказском природном очаге чумы, которая обладает четким, стабильным свойством фагоустойчивости и может быть использована в качестве тест-штамма при идентификации фагорезистентных штаммов, изучении свежевыделенных культур, а также в генетических экспериментах и для изучения механизма устойчивости.

Поставленная цель достигается селекцией фагорезистентного тест-штамма из организмов естественных носителей и лабораторных животных.

Преимущества заявленного штамма перед известными, обеспечивающие решение поставленной задачи, заключаются в том, что он является вирулентным к живым организмам, имеет 97,3±2,7 колониеобразующих единиц, которые синтезируют капсулу, а также стабильно сохраняет свои культурально-морфологические и биохимические свойства, типичные для чумного микроба, циркулирующего в Центрально-Кавказском природном очаге чумы (срок наблюдения 9 лет).

Штамм Yersinia pestis С-694-С-620 (3-КБ) имеет следующие характеристики:
Культурально-морфологические свойства. Возбудитель в мазках представляет собой палочковидное биполярно окрашенное образование. Грамотрицателен.

Штамм неподвижен. Образует капсулу.

Изолированные колонии серовато-белого цвета, круглой формы с бурым выпуклым рыхло-зернистым центром. Края колонии плоские, нежные, напоминающие кружево. В бульоне хлопьевидный осадок и нежная пленка на поверхности.

Вирулентность. Изучалась на морских свинках, белых мышах и горных сусликах.

Павших и забитых на 15 сутки после заражения животных исследовали бактериологическим методом. С этой целью делали посевы тканей из места инокуляции бактерий, из регионарных лимфатических узлов, внутренних органов, крови. Диагноз чумы у погибших подтверждался ростом культуры.

Патологоанатомические изменения варьировали от сугубо местных (в первичном комплексе) до типичных для септической чумы. В наиболее ярких случаях они сводились к гнойному инфильтрату, гематоме, слизистому отеку в месте введения микроба, увеличению регионарных лимфатических узлов, гиперимии печени, некротическим изменениям в печени и селезенке.

Биохимическая активность штамма. Не обладает протеолитической активностью. При ферментации углеводов и спиртов не образует газа, глицириннегативен, ферментирует арабинозу, не восстанавливает нитраты в нитриты, не проявляет уреазной активности.

Отношение к специфическим бактериофагам. Дизируется чумным фагом Покровской, псевдотуберкулезным фагом, резистентен к фагу Л-413 "C".

Отношение штамма к видовой диагностической сыворотке. При окраске иммуноглобулинами диагностическими чумными люминесцирующими регистрируется специфическое свечение.

Питательные потребности. Является факультативным анаэробом. Хорошо растет на агаре и бульоне Хоттингера, Мартена, рН 6,8-7,2 ед. Температурный оптимум 28±2^oС. На минимальной синтетической среде растет с четырьмя аминокислотами: фенилаланин, метионин, цистеин, треонин.

Генетические особенности штамма. Штамм имеет плазмиды: pFra/Tox⁺, pCad⁺, pPst⁺, p~3МД^-. Устойчив к бактериофагу Д-413 "С", чувствителен к канамицину, гентамицину, относительно чувствителен к стрептомицину.

Условия хранения штамма. В лиофилизированном состоянии при температуре +4^oС, агар Хоттингера рН 7,2±0,2 ед.

Способ получения штамма. Селекционирован в отделе микробиологии чумы, холеры и других опасных инфекционных заболеваний Н.С. Царевой в 1989 г. Селекцию фагоустойчивого варианта чумного микроба проводили на твердой питательной среде путем нанесения бактериофага Д-413 "С" на газон посеянной культуры с последующей инкубацией при 28^oС.

Установленная гетерогенность по ряду свойств возбудителя чумы Центрально-Кавказского природного очага, особенности его взаимоотношений с организмом основного носителя ставят вопрос о конкурентоспособности штаммов чумного микроба.

ПРИМЕР 1. Определение конкурентоспособности свежевыделенных штаммов и фагорезистентного в организме естественных носителей и лабораторных животных.

Животных заражали смесью штаммов по 5•10³ (5•10⁴) м.к. каждого в общей дозе 10⁴ м.к. в объеме 0,1 мл для белых мышей и 10⁵ м.к. в объеме 1,0 мл для морских свинок. Ежедневно в течение 1-6 суток, а затем на 8, 10, 12, 15 забивали по 2-4 животных. От павших и забитых грызунов получали субкультуры из регионарных лимфоузлов, внутренних органов и крови.

Популяции полученных субкультур чумного микроба не менее 500 м.к. изучали по признаку фагоустойчивости, рассчитывая процентное соотношение клеток с различной маркировкой.

ПРИМЕР 2. Определение конкурентоспособности свежевыделенных штаммов и фагорезистентных на искусственных питательных средах. В опытах использовали жидкие синтетические среды с 5 (метионин, треонин, цистеин, фенилаланин, пролин), 4 (метионин, треонин, цистеин, фенилаланин) аминокислотами и без аминокислот, основу которых составляла забуференная фосфатно-солевая среда. Животных заражали аналогично примеру 1. От павших и забитых животных популяции субкультур чумного микроба не менее 500 м.к. изучали по признаку потребности в факторах роста. Методом реплик, делая отпечатки на синтетических средах, а также для контроля на агаре Хоттингера рН 7,2 и фосфатно-солевой среде. Результаты учитывали на 4-10 сутки.

Таким образом, заявленный штамм Yersinia pestis С-694-С-620 (3-КБ) может служить тест-культурой при выявлении фагорезистентных штаммов в Центрально-Кавказском природном очаге чумы, может быть использован для определения конкурентоспособности свежевыделенных штаммов Центрально-Кавказского природного очага чумы.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при изучении свежевыделенных штаммов возбудителя чумы в Центрально-Кавказском природном очаге. Штамм бактерий Yersinia pestis С-694-С-620 (3-КБ) получен путем селекции фагоустойчивого варианта чумного микроба на твердой питательной среде в присутствии бактериофага Л-413 "С" на газоне посеянной культуры. Выявленная гетерогенность по ряду свойств возбудителя чумы Центрально-Кавказского природного очага, стабильность свойств фагоустойчивости указывают на способность штамма служить тест-культурой при выявлении фагорезистентных штаммов.

Штамм бактерий Yersinia pestis C-694-C-620 (3-КБ), используемый в качестве тест-штамма, резистентного к чумному бактериофагу Л-413 "С".