Штамм бактерий JeRSINIa реSтIS, предназначенный для проведения генетических и эпизоотологических наблюдений Советский патент 1992 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологии, генетике и эп1;;зоотологии чумы, применимо для микробиологических, генетических экспериментов и эпизоотологического наблюдения в качестве марки.рованного штамма.

Известен аргйнинзависимый мутанг чумного микроба, вирулентный для морских свинок и белых мышей, полученный яод действием химических агентов 1.

До настоящего времени неизвестны дикие штаммы чумного микроба с аналогичными свойствами. Предлагаемый штамм впервые изолирован в природе, не имеет аналогов и может использоваться при изучении генетики вирулентности чумного микроба, механизма естественной изменчивости, закономерностей его возникновения и циркуляции в природе.

Целью изобретения является получение штамма для проведения генетических и эпизоотологических исследований.

Полученный аргининзависимый вирулентный штамм чумного микроба Y.pestfs хранится в коллекции филиала Всесоюзного музея живых культур Всесоюзного научноисследовательского противочумного института Микроб под номером КМ-843 и имеет следующие морфологические и физиологические характеристики:

Величина клеток двухсуточной бульонной культуры составляет 1-2 мкм Грамотрицательные, овоидной формы, биполярноокрашенны.

Дает агглютинативный рост в прозрачном бульоне с мелкохлопчатым.осадком на дне пробирки. На агаре Хоттингера формирует пигментированные колонии с зернистым центром и периферической зоной диаметром 2-2,5 мм. Температура оптимума роста 28°С.

Ферментирует глюкозу, маннит, арабинозу, глицин, дульцит. Не ферментирует лактозу, сахарозу, рамнозу. Обладает фибринолитической и коагулазной активностью, пестициногенен и не чувствителен к пестицину 1. На среде Джексона-Берроуза формирует пигментированные колонии, на магниево-оксалатной среде Хигучи-Смита вырастают кальцийзависимые клетки. Продуцирует фракцию 1, чувствителен к чумному фагу Покровской, фагу Л-413 С, псевдотуберкулезному диагностическому фагу, стрептомицину, тетрацикл)лну, левомицитину. Зависит от аргинина, независим от его предшественников цитрулина и орнитмна. Вирулентный для морских свинок (DCL 3,5-10 м.к.) и белых мышей {DCL- 10 м.к.).

П р и м е р 1. Способ получения штамма Yerslnta pestis.

Аргининзависймый вирулентный штамм чумного микроба КМ-843 получен путем посева суспензии 9 блох O.ilovalsklf.

Блох O.ilovaiskii получают после очеса малого суслика, отловленного в точке Акамбайли песчаного массива Бийрюк, обездвиживают парами эфира и растирают в стерильной фарфоровой ступке с 0,1 мл стерильного физиологического раствора. Полученную суспензию блох бактериологической петлей высевают на пластинку агара Хоттингера (рН 7,2) с последующей инкубацией посева в течение 48 ч при28°С.

На пластинке агара Хоттингера через 48 ч регистрируют рост колоний чумного микроба типичных по морфологии и чувствительности к чумному и псевдотуберкулезному бактериофагам.

П р и м е р 2. Использование штамма для изучения вирулентности аргининзависимых вариантов чумного микроба.

Из двухсуточной, агаровой культуры чумного микроба Y.pestis КМ-843, И-765(аргининзависимый штамм, выделенный в Горно-Алтайском природном очаге), А-1728 (аргининзависимый штамм, .выделенный в Гиссарском природном очаге) готовят суспензии по стандарту мутности (10 единиц) в забуференном физиологическом растворе (рН 7,2) с концентрацией микробных клеток 10 в 1 мл. Последовательным разведением пипеткой переносят 0,5 мл суспензии в пробирки с 4,5 мл физиологического раствора до концентрации 10 микробных клеток в 1 мл. Из разведений 10, 10 10 10 10® микробных клеток в 1 мл каждого штамма

вводят четырем морским свинкам по 1,0 мл подкожно в область верхней трети бедра. Учет результатов проводят в течение 10 сут. Сравнение вирулентности проводят.

по количеству погибших морских свинок с бактериологическим подтверждением инфекционного процесса (см. табл;).

Сравнительная вирулентность аргининзависимых штаммов чумного микроба из

0 разных природных очагов для морских свинок приведена в таблице.

Штамм Y.pestis КМ-843 является вирулентным аргининзависимым, DCL для морских свинок - 3,5-10 микробных клеток.

5 Полученные данные позволяют сделать заключение об отсутствии связи вирулентности чумного микроба с приобретением зависимости от аминокислоты аргинина.

П р и м е р 3. Использование штамма

0 У.pestis КМ-843 для изучения генетики вирулентности чумного микроба.

Двухсуточные агаровые культуры штаммов КМ-843 (природный аргининзависимый вирулентный для морских свинок), И-765 и

5 А-1728 (природные аргининзависимые авирулентные для морских свинок), выращенные при 28°С| переносят аппликаторами в пластиковые пробирки с 100 мкл лизирующей смеси (50 мл Tris-OH 3% SDS), смесь

0 доводят до рН 12,6 добавлением 2 N NaOH и доливают до 100,0 мл дистиллированной воды). Лизат инкубируют 15-16 мин при 5б°С с последующим экстрагированием равным обьемом фенол-хлороформа (в соот5 ношении 1:1), центрифугируют 5 мин при 6000 об/мин, отбирают 20 мкл водной фазы и смешивают с 5 мкл 0,25% бромкрезолового пурпурного в 50% глицерине (приготовленном на 0,05 М Tris - ацетате с рН 7,9) и

0 наслаивают в лунки для электрофореза. Горизонтальный электрофорез проводят в 0,7% агарозе при напряжении тока 12-14 в/см в течение 2 ч. Гель окрашивают в этидиумбромиде (0,5 мкг/мл) 30 мин при 23°С. Идентификацию плазмидных ДНК производят под УФ-лучами с использованием оранжевого фильтра.

В результате обнаружено, что все три штамма имеют типичный для чумного мик0 роба набор плазмид: pPst, pFra, pCad.

Полученные данные позволяют сделать вывод об отсутствии корреляции между вирулентностью чумного микроба и ЗАВИСИМОСТЬЮ от аргинина -наличие у всех штаммов

5 плазмиды pCad, ответственной завирулентность.

Примерз. Использование штамма У.pestis КМ-843 для изучения динамики чумного эпизоотического процесса в природном очаге чумы.

При многолетнем тщательном эпизрртологическом обследовании Зауральского степного очага чумы из грызунов и их блох регулярно изолировались типичные для очага по питательным потребностям (зависимые от амийокислот метионина, цистеина, треонина) штаммы возбудителя чумы.

В 1987 г. на Юго-Востоке Зауральского степного очага в массиве песков Бийрюк точка Акамбайли - был выделен первый аргининзависимый вирулентный штамм чумного микроба (Y.pestlsA-1861).

Последующее эпизоотрлогическое обследование и параллельное изучение питательных потребностей выделенных штаммов позволило установить первичную динамику распространения аргининзависимых вариантов чумного микроба.

Таким образом представленные данные позволяют использовать штамм КМ-843, как генетическую метку для изучения динамики природного эпизоотического процесса в очаге чумы.

0

Формул а изобретения Штамм бактерий Yerslnia pestis КМ-843, предназначенный для проведения генетических и зпизоотологических наблюдений.

Изобретение относится к микробиологии, генетике и эпизоотологии чумы, применяемой для микробиологических, генетических экспериментов и эпизоотологического' наблюдения в качестве маркированного штамма. Целью изобретения является получение штамма для проведения генетических и эпизоотологических исследований. Выделен штамм при эпизоотологическом обследовании природных очагов чумы. Штамм является природным аргининзави- симым штаммом чумного микроба. Использование данного штамма как тест-объекта дает возможность более детального изучения генома возбудителя чумы, генетики вирулентности, механизма циркуляции в природе. Штамм депонирован в коллекции Всесоюзного музея живых культур НИИ "Микроб" под номером •• КМ- 843. 1 табл..'3С/1