СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ТОКСОПЛАЗМЕННОЙ ИНФЕКЦИИ У ДЕТЕЙ Российский патент 2008 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины, в частности к лабораторной диагностике токсоплазменной инфекции, и может быть использовано в практике здравоохранения для выявления острого и хронического течения заболевания.

Актуальность проблемы токсоплазмоза обусловлена широким распространением T.gondii на всех континентах и во всех климатогеографических зонах. По данным серологических тестов в разных странах мира токсоплазменной инфекцией инвазировано от 4 до 68% населения. В России инфицированность составляет 25%. Инфицированность токсоплазмозом увеличивается с возрастом:

1 год - 2%, 2 года - 10%, 4 года - 22%, в 15-19 лет - 38,2%, 40-44 года - 65,8%. Однако, несмотря на незначительный процент инфицированности у детей, среди причин перинатальной патологии токсоплазмоз занимает одно из главных мест. На каждую 1000 новорожденных в Германии и Франции приходится от 1 до 8 детей с врожденным токсоплазмозом (ВТ). По данным исследователей Швеции токсоплазмоз является в 98% случаях причиной тяжелой гидроцефалии.

Токсоплазмоз является причиной каждого третьего случая хориоретинита с нарушением функции зрения и каждого пятого случая лимфаденита.

Несмотря на достаточно подробное изучение токсоплазменной инфекции (ТИ), существует ряд факторов, таких как превалирование латентных форм инфекции, сложность диагностики манифестных форм, недостаточная эффективность антипротозойной терапии, которые указывают на необходимость разработки алгоритмов диагностики, лечения и диспансерного наблюдения за этой категорией пациентов, направленных на определение острой или хронической фазы заболевания.

Известен метод паразитологической диагностики ТИ, когда возбудителя выявляют при непосредственной микроскопии материала, в гистологических срезах внутренних органов или путем выделения возбудителя на восприимчивых лабораторных животных с помощью биопроб. С этой целью используют кровь, ликвор, плевральную жидкость, пунктат лимфатического узла и костного мозга и т.д. Для прямого микроскопирования из исследуемого материала готовят мазки-отпечатки на предметных стеклах, высушивают, фиксируют метиловым спиртом, затем окрашивают по Романовскому и микроскопируют. Метод прямой микроскопии несложен и доступен, но результативен в небольшом проценте и требует дополнительных материальных затрат, что не обеспечивает точности диагностики (Грачева Л.И. Обзор методов диагностики 1999 г.)

Известен метод серологического исследования (реакция с красителем Сэбина-Фельдмана-РК, реакция связывания комплемента-РСК, реакция непрямой иммунофлюоресценции-РНИФ, реакция иммуноферментного анализа-ИФА), обнаруживающий наличие специфических антител в сыворотке крови обследуемого человека. Сущность метода состоит в выявлении специфических антител в исследуемой сыворотке с помощью токсоплазменного антигена и маркированной антисыворотки. Недостатком метода РК является трудоемкость и сложность исполнения и требует живых токсоплазм, что недоступно для большинства лабораторий. Антитела, определяемые в РНИФ, появляются к концу первой недели заражения и сохраняются длительное время. ИФА метод основан на непрямом иммуноферментном анализе на твердой фазе с использованием пероксидазы хрена в качестве маркерного фермента. Недостаткими методов РНИФ и ИФА является обязательное повторное исследование через 2-4 недели и по нарастанию титров JgG антител можно будет судить о развивающейся инфекции, но при давности заражения, превышающем 12 месяцев, определение в динамике IgG-toxo не несет положительной информации, так как уровни этих антител не связаны с клиническими проявлениями, тогда как выявление IgM антител, являющихся маркерами острой инфекции, представляет большие трудности из-за возможности получения ложноположительного результата в РНИФ, в связи с присутствием антиядерных антител и ревматоидного фактора. В ИФА выявление IgM антител может дать как положительный, так и отрицательный результат. Таким образом каждый из предложенных способов не отражает полностью диагностику токсоплазменной инфекции в связи с тем, что при первичном обследовании больного невозможно установить фазу процесса, а следовательно, не обеспечивает точности диагностики и не может служить критерием назначения антипротозойной терапии.

Для устранения вышеуказанных недостатков авторы предлагают принципиально новый способ диагностики токсоплазменной инфекции путем использования иммуноферментного анализа (ИФА) и модифицированную реакцию связывания комплемента (м-РСК), отличающийся тем, что после забора крови ставят одномоментно реакции ИФА и м-РСК, дифференцируют токсоплазменные низкоавидные антитела в подклассах иммуноглобулинов IgG-3, IgG-4 и высокоавидные антитела IgG и по уровню наличия антител в м-РСК в подклассе JgG-3 в титрах 1:10-1:80 и уровне высокоавидных антител IgG в ИФА в титрах >200 МЕ/мл устанавливают острую форму заболевания, а при наличии антител в подклассах IgG-4 в титрах 1:20-1:50 и уровне антител IgG в ИФА <200 МЕ/мл устанавливают хроническую форму заболевания.

Технический результат данного изобретения заключается в повышении точности диагностики и экспрессивности.

Авторами впервые предложен способ диагностики ТИ, основанный на одновременной постановке ИФА и м-РСК, позволяющий определить как низкоавидные, так и высокоавидные AT. В м-РСК нами выявляются слабоавидные AT, нуждающиеся для усиления их авидности в сорбции белков комплемента, что не только усиливает сродство AT к антигенным эпитопам белков возбудителя, но и включается в процесс иммунной защиты организма. Нашими исследованиями доказано, что присоединение к комплексу АТ-АГ белка системы комплимента С3b создает выраженную возможность захвата фагоцитами (макрофагами), имеющими в своей структуре рецептор к этому белку комплемента. При первичной инфекции или обострении процесс соединения АТ-АГ и комплемента достаточно быстро приводит к образованию иммунных комплексов высокой молекулярной массы. В процессе течения инфекции степень авидности AT усиливается и образуется иммунный комплекс (ИК), энергично связывающийся с Fc-рецептором фагоцитов.

Таким образом, после проведения многочисленных анализов авторы установили факт, что для полного функционирования системы элиминации возбудителя в структуре ИК необходимо, два типа AT - на начальном этапе инфекции наличие низкоавидных антител, когда сорбция на макрофаг связана с рецептором для С3-b фракцией комплемента, и высокоавидных, когда сорбция на макрофаг идет с участием макрофагального рецептора для Fc-фрагмента AT.

Согласно изобретению в отличие от вышеуказанных способов авторы на основании клинических исследований на небольшой группе больных, получив неожиданно положительный результат, предлагают осуществлять диагностику острой формы токсоплазменной инфекции на основании выявления в крови низкоавидных антител подкласса IgG-3 в титрах 1:10-1:80 методом м-РСК и высокоавидных антитетел IgG в титрах >200 МЕ/мл в ИФА. Авторы также установили, что при хроническом течении ТИ выявляются антитела в м-РСК в подклассе IgG-4 в титрах 1:20-1:50 и уровне антител IgG в ИФА <200 МЕ/мл.

После проведения 925 исследований по диагностике ТИ с целью установления форм инфекционного процесса авторы эмпирическим путем установили, что для острой формы инфекционного процесса необходимы титры антител в подклассе IgG-3 в пределах 1:10-1:80, а при хронизации процесса - титры антител в подклассе IgG-4 в пределах 1:20-1:50.

Таблица 1Характеристика форм токсоплазменной инфекции у детей при одновременной постановке ИФА и м-РСКМетодыИФАм-РСКОстрая формаIgG >200 МЕ/млIgG-3 1:10-1:80Хроническая формаIgG <200 МЕ/млIgG-4 1:20-1:50

Способ осуществляется следующим образом: доставленная в лабораторию кровь, взятая путем венопункции в объеме 2,0 мл, центрифугируется для получения сыворотки, которая и участвует как в реакции м-РСК, так и ИФА. Метод м-РСК основан на стандартной реакции связывания комплемента с существенным отличием, заключающимся в количественном определении уровня лизиса бараньих эритроцитов в гемолитической системе. Этот уровень лизиса тестируется с наличием цифрового показателя, определяемого по концентрации оксидазных ферментов, вышедших из этих лизированных эритроцитов.

Иммуноферментный метод проводят с тест системой Вектор-бест тохо с выявлением антител класса IgM и IgG в стандартном выполнении.

Полученные после проведения ИФА и м-РСК результаты анализируют и при получении титра AT IgG в титрах >200 МЕ/мл в ИФА и антител в м-РСК в подклассе JgG-3 в титрах 1:10-1:80 диагносцируется острая форма ТИ. А при получении антител IgG в ИФА <200 МЕ/мл и в подклассе IgG-4 в титрах 1:20-1:50 в м-РСК диагносцируется хроническая форма инфекции.

Анализ известных методов на дату подачи заявки показывает, что не существует подобных способов, позволяющих на основании первичного обследования определить фазу инфекции и точно поставить диагноз. На основании предлагаемого метода проводится этиологическая терапия в острую фазу ТИ, что существенно улучшает прогноз заболевания.

В качестве доказательств приводим следующие примеры:

1. Ж.Артем, 3 мес., амб. карта №522, д-з: врожденный токсоплазмоз, центральный хориоретинит, реконвалесцент менингоэнцефалита: в ИФА антитела IgG в титре 400 МЕ/мл, в м-РСК выявлены IgG-3 в титре 1:60. Была установлена острая форма инфекционного процесса, назначена антипротозойная терапия, что привело к улучшению состояния ребенка (исчез синдром вегетовисцеральных нарушений, улучшились весоростовые показатели).

2. Л.Аня, 10 мес, амб. карта №144, д-з: хронический токсоплазмоз, центральный хориоретинит: в ИФА выявлены IgG антитела в тире 180 МЕ/мл, в м-РСК антитела в подклассе IgG-4 в титре 1:20. Диагноз хронического токсоплазмоза был подтвержден.

3. О.Артур, 13 лет, амб. карта №105, д-з: приобретенный токсоплазмоз, острое течение, миокардиодистрофия. В ИФА IgM не определялись, выявлены IgG антитела в титре 300 МЕ/мл, в м-РСК выявлены IgG-3 в титре 1:80. Диагносцирована острая фаза приобретенного токсоплазмоза. Получил курс антипротозойной терапии. Через 3 мес антитела в м-РСК не определялись, в ИФА выявлены антитела IgG в титре 800 МЕ/мл - в антитпротозойной терапии не нуждается.

Приведенные примеры свидетельствуют о высокой информативности разработанного метода диагностики острой и хронической фазы инфекции.

Таблица 2Обследовано детейВ том числе, диагноз подтвержден Абс%Всего94100ВТ, манифестная форма1414,8ВТ, латентное течение и резидуальные проявления2627,6ПТ, острое течение2122,3ПТ, латентное течение3335,1

Апробация метода на клиническом материале детей с диагнозом: лимфоаденопатия, субфебрилитет неясной этиологии, ВУИ неуточненного генеза показала его высокую эффективность. Положительные результаты получены как на начальном этапе развития заболевания, так и при обострении хронической инфекции.

Авторами впервые предложен метод, позволяющий при первичном обследовании определить фазу инфекции и назначить адекватную терапию. Преимуществом этого метода является его высокая специфичность, точность и возможность использования как для выявления первичной инфекции, так и при обострении хронической.

Разработанный авторами способ можно рекомендовать врачам-клиницистам для широкого использования в практике здравоохранения для определения как острой, так и хронической формы инфекции с последующим назначением этиологического лечения.

Изобретение относится к области медицины, в частности к лабораторной диагностике токсоплазменной инфекции у детей. После забора крови одномоментно проводят определение подклассов иммуноглобулинов IgG-3 и IgG-4 путем постановки модифицированной реакции связывания комплемента (м-РСК) и определение уровня антител IgG методом иммуноферментного анализа (ИФА). При наличии антител в м-РСК в подклассе IgG-3 в титрах 1:10-1:80 и уровне антител IgG в ИФА в титре >200 МЕ/мл устанавливают острую форму заболевания. При наличии антител в м-РСК в подклассе IgG-4 в титрах 1:20-1:50 и уровне антител IgG в ИФА <200 МЕ/мл устанавливают хроническую форму заболевания. Использование способа позволяет повысить точность диагностики токсоплазменной инфекции. 2 табл.

Способ диагностики токсоплазменной инфекции у детей путем исследования крови больного, отличающийся тем, что после забора крови одномоментно проводят определение подклассов иммуноглобулинов IgG-3 и IgG-4 путем постановки модифицированной реакции связывания комплемента (м-РСК) и определение уровня антител IgG методом иммуноферментного анализа (ИФА), и при наличии антител в м-РСК в подклассе IgG-3 в титрах 1:10-1:80 и уровне антител IgG в ИФА в титре >200 МЕ/мл устанавливают острую форму заболевания, а при наличии антител в м-РСК в подклассе IgG-4 в титрах 1:20-1:50 и уровне антител IgG в ИФА <200 МЕ/мл устанавливают хроническую форму заболевания.