СПОСОБ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ВЫЯВЛЕНИЯ ФАЗ ОППОРТУНИСТИЧЕСКИХ ИНФЕКЦИЙ Российский патент 1999 года по МПК G01N33/536 

Изобретение относится к медицине, в частности к диагностике инфекционных заболеваний у детей и взрослых.

Сложность клинической диагностики и дифференциальной диагностики оппортунистических инфекций у человека, таких как герпес, цитомегалия, краснуха, хламидиоз, токсоплазмоз, микоплазма и другие, особенно в их хроническо-персистентной фазе резко повышает актуальность лабораторной диагностики этих нозологических форм. Отсутствие выраженной клинической симптоматики и частое сочетание этих инфекций как друг с другом, так и с острыми вирусными и бактериальными инфекциями, создают особую важность разработки оригинальных лабораторных приемов диагностики таких скрытых инфекций.

В настоящее время имеется достаточное число современных высокочувствительных тестов по диагностике оппортунистических инфекций, позволяющих достаточно быстро по определению антител установить у больного диагноз такой инфекции. К этим методам относятся иммунофлюоресценция, иммуноферментный и радиоиммунные анализ, иммунный блотинг, латексагглютанация (Назаров Р.О. и соавт. Определение уровня противогерпетических IgG-антител в сыворотке крови детей при помощи иммуноферментного анализа (ИФА). "Тез. докл. 1-го съезда иммунологов России, Нов-ск, 1992, с. 322; Сухих Г.Т. и соавт. Диагностика и прогностическая ценность специфического иммунного ответа к вирусу цитомегалии у беременных женщин с привычным невынашиванием беременности. "Акушерство и гинекол.", 1992, 3-7, с. 30-33; Shekarchi I.C., Sever J.L. et al. Evaluation of various plastic microtiter plates with measles, toxoplasma and gamma globulin antigens in enzyme-linked immunosorbent assays." J.Clin. Microbiol.", 1984, 19, 2, p. 89-96").

Острые формы этих инфекций дифференцируют в основном в такого рода реакциях по обнаружению специфических иммуноглобулинов класса IgM в сыворотках крови (Лысенко А.Я., Лавдовская М.В. Спид-ассоциированные инфекции и инвазии. М.: Медикос, 1992, с. 161-167).

В то же время, указанные методы не свободны от недостатков. Чувствительность методов хотя и высока, но это создает возможность получения ложно-положительных результатов, что неблагоприятно влияют на индивидуальную этиологическую расшифровку у отдельного больного. С другой стороны, наличие в сыворотках различного рода ингибиторов может приводить в ложно-отрицательным результатам, что также снижает эффективность диагностики в каждом клиническом случае.

Наиболее близким к предлагаемому способу является иммуноферментный способ без разделения компонентов с использованием ферментов, включенных в липосомы (Нго Т. Т. , Ленхофф Г. Иммуноферментный анализ. М.: Мир, 1988, с. 22-23.)
Метод основан на получении диагностикума меченых ферментом липосом с сорбированным на них антигеном. При контакте такого диагностикума с антителами и комплементом происходит их лизис, степень которого соответствует уровню имеющихся антител и комплемента. Лизис же учитывается по активности фермента.

Данный иммуноферментный метод, несмотря на сложности получения такого липосомального диагностикума, имеет одно главное преимущество. С его помощью возможно количественное определение участка антительной молекулы (Fc-фрагмент и его шейка), сорбирующий комплемент в естественных условиях организма. Это дает возможность искать подходы к количественному определению подклассов антител IgG, зависящих от структуры этого участка молекул антитела.

В то же время недостатками прототипного способа, кроме вышеуказанных сложностей получения меченых липосом, является также то, что липосомальная система не является физиологичной, поскольку она нестандартна в использовании ее в серологических реакциях. Для каждой инфекции необходимо получение отдельного диагностикума. Кроме того антитела класса IgG-4 не сорбируют комплемент, и с помощью этого теста трудно количественно дифференцировать концентрацию антител, имеющих различный уровень сорбции комплемента. Степень сорбции комплемента на иммунный комплекс убывает от IgM к IgG1-2 и IgG-4 - иммуноглобулину.

В предлагаемом заявителями способе в отличии от базового у больных с предполагаемой оппортунистической инфекцией проводят определение антител в сыворотке крови с помощью реакции связывания комплемента, соединяя сыворотку больного с соответствующим антигеном и экзогенным комплементом. Уровень антител выявляют по количеству сорбированного комплемента, измеряя его остаток по лизису бараньих эритроцитов и смеси с гемолитической сывороткой. Степень этого лизиса в отличии от базового способа оценивают по уровню эритроцитарных оксидазных ферментов, количество которых измеряют спектрофотометрически по изменению цветности субстрата ортофенилендиамина в присутствии перекиси водорода.

Используя такую количественную систему выявления комплемент-связывающих антител, проводят оценку уровня антител в следующих классах иммуноглобулинов: IgM, IgG-1-2, IgG-3 и IgG-4. С этой целью реакцию связывания комплемента по заявляемому способу проводят в нативной сыворотке, а также в сыворотке, обработанной 2% суспензией цистеина и 5% взвесью золотистого стафилококка (штамм Cowan 1).

От каждого больного с испытуемым антигеном исследуют три пула сыворотки - нативную, после обработки цистеином и после сорбции на стафилококк. Фаза оппортунистической инфекции оценивается по следующим параметрам. Диагноз первично острой инфекции (антитела класса IgM) ставится по высокому уровню антител в исходной сыворотке при резком снижении их уровня после кратковременной обработки цистеином в течение 2 часов, но таком же высоком уровне после часового взаимодействия с 5% суспензией стафилококка. Обострение хронически-персистирующей инфекции ставится при умеренном уровне антител в нативной сыворотке, таком же после контакта их со стафилококком и резком их снижении после длительной обработки цистеином в течение 18 часов при +4^o (антитела класса IgG-3). Хронически-персистирующая фаза подтверждается по установлению антител класса IgG-4, которые не выявляются в реакции связывания комплемента в нативной сыворотке (Петров Р.В. Иммунология М., 1982, с. 54). Однако после обработки цистеином в течение ночи в сыворотке крови появляется достаточно высокий уровень антител к соответствующему антигену, но они отсутствуют после обработки стафилококком.

Способ осуществляется следующим образом.

Сыворотка крови больного в разведении 1:5 делится на 3 части. Первая часть разводится в 2 раза фосфотно-буферным раствором и соединяется в равных объемах с соответствующим антигеном одной из оппортунистических инфекций, затем в эту смесь вносится 2 гемолитических дозы комплемента. Вторая часть сыворотки соединяется в равных объемах с 5% взвесью золотистого стафилококка с после часового контакта при комнатной температуре центрифугируется при 3000 об/мин в течение 15-20 минут. Третья часть соединяется в равных объемах с 2% суспензией аминокислоты-цистеина и также центрифугируется после 2 часового контакта. Надосадок этой 3-ей части сыворотки делится на 2 части, одна их которых идет в опыт с добавлением антигена и 2 доз комплемента. В другую вновь вносится цистеин в той же концентрации и она помещается в холодильник на +4^o на ночь. Спустя ночь смесь центрифугируется при тех же оборотах и времени и тоже связывается с антигеном и 2 гемолитическими дозами комплемента.

Все полученные четыре пробы помещаются в термостат при 37 ^o на 1,5 - 2 часа. Затем в эти смеси добавляется гемолитическая система, состоящая из разных объемов 0,8% взвеси бараньих эритроцитов и 10 доз гемолитической сыворотки к этим эритроцитам (гемолитическая система). Контролями к такому способу являются пробы с сывороткой, содержащей антитела к исследуемому антигену (положительный контроль) и не содержащей таких антител (отрицательный контроль), а также контроль антигена и гемолитической системы с комплементом и без него. Опытные пробы от каждого больного со всеми исследуемыми антигенами и указанными контролями выдерживаются при комнатной температуре до появления гемолиза в контролях, затем центрифугируются при 3000 об/мин в течение 1 - 2 минут, надосадки с гемолизом отсасываются в отдельные емкости и измеряется активность этого гемолиза. Для этого во все пробы добавляется 0,05% раствор ортофенилендиамина в 3% растворе перекиси водорода. Через 20 минут реакцию останавливают 1н. серной кислотой и показатели учитывают на иммуноферментном анализаторе при длине волны 495 нм.

Титр антител считывается высоким при снижении показателей экстинции в опыте более, чем на 50% по отношению к среднему значению контролей, умеренным при 50-25% снижении и низким при менее, чем 25% снижении.

Фазы оппортунистической инфекции оценивают следующим образом.

Для первично острой инфекции характерны высокие титры антител в нативной сыворотке, резком их снижении до низких показателей после кратковременной обработке цистеином, равно как и при длительной обработке и отсутствии изменений по сравнению с нативной сывороткой после воздействия стафилококка.

Для обострения уже текущей оппортунистической инфекции доказательством являются умеренные титры антител в нативной сыворотке, такие же после кратковременной обработки цистеином и контакта со стафилококком и низкие титры или практически полное разрушение антител после длительного контакта с цистеином.

Хронически-персистирующая оппортунистическая инфекция подтверждается при отсутствии антител в нативной сыворотке, но появление их до высоких концентраций после ночной обработки цистеином и отсутствии их после обработки стафилококком.

Пример 1.

Больной Якутович Слава, 5 лет поступил с нейроклинику НИИДИ с предположительным диагнозом "Менингоэнцефалит неясной этиологии 26.04.96 г. При обследовании крови на все вышеперечисленные инфекции обнаружены антитела к вирусу цитомегалии при пересчете в титрах: в нативной сыворотке 1:17, после кратковременной обработки цистеином - 1:16, после 18-часовой обработки цистеином-0 (отсутствие антител) и после сорбции на стафилококк-1:45. На другие антигены титров антител не обнаружено. При оценке титров антител установлено: отсутствие IgM-антител, низкий уровень IgG-1-2- антител и высокий уровень IgG-3-анител (1:45). Подтверждена цитомегаловирусная инфекция в фазе обострения хронически-персистентной инфекции.

Окончательный диагноз: Цитомегаловирусный менингоэнцефалит в фазе обострения.

Пример 2.

Черкин Ж., 8 лет поступил ва отделение реанимации НИИДИ с неясным диагнозом. При обследовании крови на все перечисленные инфекции обнаружены антитела к токсоплазменной инфекции при пересчете в титрах: в нативной сыворотке - 0, после кратковременной обработки цистеином - 0, после 18-часовой (ночной) обработки цистеином 1:105 и после обработки стафилококком - 0. На другие антигены титров антител не обнаружено. При оценке титров антител установлено: отсутствие антител класса IgM и выявлен подкласс антител IgG-4 в высоком титре. Подтверждена токсоплазменная инфекция в хронически-персистентной фазе.

Окончательный этиологической диагноз: Токсоплазменная инфекция в скрытой форме.

Таким образом, заявляемый способ позволяет при постановке реакции связывания комплемента с конечным иммуноферментным тестированием и специальной обработкой сыворотки крови больного серологически поставить диагноз оппортунистической инфекции и выявить ее фазу.

Особенностью данного способа являются следующие моменты.

Во-первых, обязательность постановки реакции связывания комплемента в количественно-ферментной реакции. Эта реакция выявляет состояние и изменение структуры Fc-фрагмента антитела (и его шеечного участка). В то же время очевидно, что изменение классов и особенно подклассов антител IgM и IgG связаны не столько с Fab-участками, а именно с Fc-фрагментом и количеством дисульфидных мостиков между H-цепами. Следовательно, выявляемые в предлагаемом способе подклассы антител различаются по этим структурам. Использование других реакций (например, РТГА, РНГА или реакция нейтрализации) по принципу заявляемого способа не дает возможность выявить эти подклассы антител.

Во-вторых, проведенные разработчиками многочисленные исследования показали, что обострение оппортунистической инфекции более связано с антителами класса IgG-3, видимо, за счет их меньшей функциональной активности Fc-фрагмента (Р. В. Петров Иммунология. М., 1982, с. 53-55), ведущей к меньшей активности нормальных и иммунных киллеров. При хроническо-персистентной фазе иммунологическим свидетелем является наличие антител класса IgG-4, которые в заявляемом способе можно выявить без специфических анти-IgG-4 антиглобулинов, а по представленным в способе физико-химическим свойствам. Эти антитела на выявляются в нативной сыворотке при постановке реакции связывания комплемента, так как они небольшой молекулярной массы и, вероятно, связаны в комплексе с какими-то другими белками сыворотки, которые разрушаются после заявляемой обработки.

Заявляемый способ прост в выполнении не требует для дифференцировки подклассов специальных антиглобулинов и может четко дифференцировать фазы оппортунистических инфекций, что чрезвычайно важно при их активации у детей, при тяжелых иммунологических дефектах (типа СПИД'а), а также после сложных операционных вмешательств.

Изобретение относится к медицине, в частности к способу диагностики инфекционных заболеваний, вызываемых условно-патогенными бактериями. Способ основан на определении уровня антител в нативной сыворотке больного с помощью реакции связывания комплемента. Сравнивают уровень антител в нативной сыворотке с уровнем антител в сыворотке, обработанной суспензией цистеина, и сыворотке, обработанной суспензией золотистого стафилококка. При высоком уровне антител в нативной сыворотке, при резком снижении их уровня после обработки цистеином и высоком уровне после взаимодействия со стафилококком диагностируют первично острую фазу заболевания. При умеренном уровне антител в нативной сыворотке, умеренном уровне после обработки стафилококком и низком уровне или полном разрушении антител после обработки цистеином диагностируют обострение хронически персистирующей фазы заболевания. При отсутствии антител в нативной сыворотке, высоком их уровне после обработки цистеином и отсутствии после взаимодействия со стафилококком диагностируют хронически персистирующую фазу заболевания. В ходе диагностики уровень антител считают высоким при снижении показателей экстинкции в опыте более чем на 50%, умеренным - на 50 - 25%, низким - менее чем на 25% по отношению к контролю. Способ прост в выполнении, позволяет четко дифференцировать фазы оппортунистической инфекции.

Способ выявления фазы оппортунистической инфекции путем жидкостного иммуноферментного определения уровня антител, отличающийся тем, что уровень антител в сыворотке крови определяют с помощью реакции связывания комплемента, сравнивают уровень антител в нативной сыворотке с уровнем антител в сыворотке, обработанной 2%-ной суспензией цистеина, и сыворотке, обработанной 5%-ной суспензией золотистого стафилококка, и по высокому уровню антител в исходной сыворотке, при резком снижении их уровня после обработки суспензией цистеина в течение 2 ч и высоком уровне после взаимодействия с суспензией золотистого стафилококка в течение 1 ч выявляют первично острую фазу оппортунистической инфекции, при умеренном уровне антител в нативной сыворотке, умеренном их уровне после взаимодействия с суспензией золотистого стафилококка и низком уровне или практически полном разрушении антител после обработки суспензией цистеина в течение 18 ч при 4^oC выявляют обострение хронически персистирующей фазы оппортунистической инфекции, при отсутствии антител в нативной сыворотке, при высоком их уровне после обработки суспензией цистеина в течение ночи и отсутствии антител после взаимодействия сыворотки с суспензией золотистого стафилококка выявляют хронически персистирующую фазу оппортунистической инфекции, при этом уровень антител считают высоким при снижении показателей экстинкции в опыте более чем на 50%, умеренным - на 50 - 25%, а низким - менее чем на 25% по отношению к среднему значению контролей.