Способ определения фагоцитарной активности нейтрофилов Советский патент 1990 года по МПК G01N33/48 A61B10/00 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения фагоцитарной активности нейтрофилов по отношению к токсоплаз- мам в клинике и эксперименте.

Целью изобретения является повышение точности диагностики.

Сущность способа заключается в следующем.

Токсоплазменный сухой антиген для реакции иммунофлуоресценции разводят в 0,5 мл дистиллированной воды, под- считьшают количество токсоплазм в камере Горяева. К растворенному антигену добавляют среду t99, доводят концентрацию токсоплазм до 250300 тыс./мл и используют в тот же день в реакции фагоцитоза. Кровь для исследования берут из пальца или вены в стерильную стеклянную пробирку с гепарином (из расчета 20 ЕД на 1 мл крови) в день постановки реакции.

Гепаринизированную периферическую кровь в количестве 0,1 мл помещают в полиэтиленовую пробирку и туда же вносится 0,1 мл приготовленной суспензии токсоплазменного антигена. Смесь крови и антигена инкубируют в термостате при 37 С в течение 160 мин (2,5 ч) при периодическом легком встряхивании.

о сд

О5

Через 40 мин инкубации забирают каплю смеси, наносят на предметное стекло и делают мазок. Смесь инкуб РУют еще 120 мин. После окончания кубации лробирку встряхивают и из оставшейся смеси крови с антигеном делают мазок. Мазки сушат на воздух атем фиксируют в смеси Никифорова 30 мин, окрашивают по Романовскому :1мзе или по Нокту в течение 20- Ю мин. Проводят подсчет 100 нейтро (эилов в световом микроскопе при увеличении 10x90..

I При просмотре мазков могут встре аться нейтрофилы с адсорбцией токс iMasMbi на поверхности; с фагоцитиро 1 анными токсоплазмами,- с разрывом Нлеточиой оболочки, распадом ядра, ЕГО пикиозом, деформированные с микроскопическим обнаружением токсопла расположенных внутри.клеток, а такж ез паразитов.

I ,Тля учета реакции в каждый из ср подсчитывают количество нейтро- с Фагоцитированными токсоплаз- мр1и на 100 просмотренных нейтрофи- л|ав (фагоцитарный индекс - ФИ как в| классическом методе); количество Фагоцитированных токсоплазм с пос- л дующим вычислением фагоцитарного . (ФЧ как в классическом способе количество разрушенных нейтрофилов н 11рО просмотренных нейтрофилов (ин- ДЙкс разрушения - ИР).

По предлагаемому способу, помимо вычисления ФИ и ФЧ в кавдьвЧ из сро- Kj)B (40, 160 мин), предлагается под- с итывать индекс специфической защищенности нейтрофилов, который выра жфется отношением числа просмотренны нфитрофилов (100) к сумме нейтрофи- лфв с фагоцитированными токсоплазмами и разрушенных нейтрофилов в со- Р° наблюдения (ИСЗН

И zlUjfi )

исзн

100

ФИ + ИР

в табл. 1 приводятся средние значения ФИ, ФЧ, определенные по классическому методу с использованием в качестве тест-микроба стафилококка ауреус шт. 209, и по предлагаемому методу с использованием в качестве тест- системы токсоппазменного сухого ан-гигена для РНИФ, а также средние значения ИСЗН.

Указанные параметры изучают у 11 серонегативных (группа Т-) и 12 лиц с положительньми серологическими или аллергическими ре ктщями на токсо- плазмоз (группа Т+).в каждой группе пациенты со сходной клинической картиной, обратившиеся для обследования на токсоплазмоз по поводу акушерской патологии в анамнезе, вегетососу- дистой дистонии, лимфоаденопатии. заболевании глаз.

Из представленных данных видно, что общепринятые фагоцитарные показатели, полученные при использовании в качестве тест-микроба стафилококка не дают четкого представления относительно характера специфической пересройки организма, зараженного токсоплазмами, тогда как большинство показателей и особенно-индексы разрушения и специфической защищенности -нейтрофилов в отношении возбудителя токсо- плазмоза позволяют четко выявить токсоплазмоз положительных и отрицательных лиц, что особенно важно при наличии низкого,титра антител, определя- ювдхся в серологических реакциях. Эта закономерность подтверждается и данными табл. 2, где приводятся индивидуальные колебания индексов завершенности фагоцитоза в отношении обоих тест-микробов и специфической защиты от токсоплазм.

Более высокий индекс специфической защищенности нейтрофилов у токео- плазмозположительных лиц объясняется особенностью иммунных реакций при токсоплазменной инвазии: способность токсотшазм размножаться в фагоцитах и сегментоядерных лейкоцитах, формирование иммунитета, который носит нестерильный характер, и как следствие этого процесса - защитная реакция нейтрофилов, выражающаяся в снижении фагоцитарной реакции по отношению к токсоплазмам.

Пример t. Больная П., 36 лет. обратилась в токсоплазмозный центр по поводу лимфоаденопатии. Больная в течение 4 мес обследуется и лечится у специалистов районной поликлиники. При обследовании в токсоппазмозном центре: реакция связывания комплемента (РСК), реакция непрямой имму- нофлеоресценции (РНИФ) с токсоплаз- менными антигенами положительные 1:160 и 1:80 соответственно, внутри- кожная проба (ВКП) положительная ++++-.

Фагоцитарная активность нейтрофилов: через АО мин инкубации ФИ 8%, ИР 1%, через 2,5 ч 14 и 10% соответственно. Таким образом, ИС311 ° 11,1} 4,17.

На основании клинических и лабораторных данных установлен диагноз: токсоплазмом, подострое течение

Пример 2. Больную У., 23 лет направляют на консультацию по поводу первичного бесплодия. РСК с токсо- плазменным антигеном отрицательная, РНИФ положительная в титре 1:10, фагоцитарная активность нейтрофилов:

ФИ

160

,160

, 14%, ФИ 18%, Таким образом, ИСЗН 3,57, ИСЗН 1,09. Лабораторными данными диагноз токсоплазмоза не подтверждают.

Пример 3. Больная С. , 36 лет, обследуется в связи с безуспешным лечением вегетососудистой дистонии.. В анамнезе самопроизвольный аборт, РСК с токсоплазменным антигеном положительная в титре 1:10, РНИФ отрицательная, внутрикожная проба с токсо плазмином слабо положительная, фагоцитарная активность нейтрофилов: ИЗФс 1,0 ИЗФт. 0,81; ИСЗН 4,17, 2,32. Таким образом, при завершенном характере фагоцитоза стафилококка нейтрофилами фагоцитоз токсоплазм носит незавершенный характер, низкие титры комплементсвязывающих антител в сыворотке крови. ИСЗН , равный 4,17, свидетельствует о возможности инфицирования токсоплазмами. Незавершенный характер фагоцитоза токсоштаз- мы, снижение ИСЗН через 160 мин до 2,32 отражают сравнительно низкую защищенность нейтрофилов. На основании данных клинического и лабораторного обследований устанавливают диагноз хронического токсоплазмоза с поражением нервной системы и необходимость назначения коррегирующей терапии.

0

5

I

Пример 4.У больной А., 35 лет, периодически отмечают суб- фебриальную температуру, в анамнезе самопроизвольный аборт. РСК с токсо- плазмозным антигеном положительная в титре 1:10, РНИФ в титре 1:80; ИЗФС 1,04; ИЗФТ 1,14, ИСЗН ° 9,09, 6,7. На основании клинических и лабораторных данных устанавливается диагноз: токсоплазмоз, латентное течение. Функциональная активность нейтрофилов на достаточно высаком уровне по всем изученным показателям, в терапии не нуждается.

I

Пример 5. Больную В., 29 лет, обследуют по поводу хориоретинита. РСК положительная в титре 1:5, РНИФ 1:80, внутрикожная проба отрицательная. Фагоцитарная активность нейтрофилов: ИЗФС и ИЗФТ меньше 1 (0,88 и 0,59 соответственно), ИСЗН ° 7,14, 5,68. На основании клинических и лабораторных данных устанавливается диагноз: хронический токсо- плазмозный хориоретинит. Назначейо специфическое лечение.

30 Формула изобретения

5

0

5

Способ определения фагоцитарной активности нейтрофилов, включающий инкубацию биологического объекта в пробе крови с последующей обработкой полученных результатов, о т л и- чающийся тем, что, с целью . повышения точности,в качестве бчоло- гического объекта используют токсо- плазму токсоплазменного антигена для реакции иммунофлуоресценции, а при обработке результата дополнительно вычисляют индексы разрушения и специфической защищенности нейтрофилов, выражающиеся отношением числа нейтрофилов к сумме фагоцитировавших токсоплазм и разрушенных нейтрофилов.

Таблица 1

Тест-микроб

ФЧ через, мин 30 . I 120 Г ДО1

Продолжение табл.1

ИЗФ 160

Изобретение относится к медицине и касается вопроса определения и оценки фагоцитарной активности нейтрофилов по отношению к токсоплазмам. Целью изобретения является повышение точности диагностики. Для этого в качестве объекта фагоцитоза нейтрофилами применяют убитые эндозоиды токсоплазменного коммерческого антигена для реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ). Наряду с классическими методами оценки фагоцитарной активности определяют индекс специфической защищенности нейтрофилов (ИСЗН), который служит дополнительным диагностическим критерием для установления наличия токсоплазменной инвазии и обоснованием к назначению коррегирующей терапии.

Стафилококк 5,6ltO,35 6,22tO,54О 08

Токсоплаэмы2,ПО,12 1,910,44 1J7tO, 28

Т- ; Стафилококк 5,46tO,15 5,06tO,281 15iO 09

1,,15 1,60+0,12 o 96to i4.

. .

: Продолжение табл.1

Группы Тест-микроб ИР через, мин ИСЗН через, мин

I , обсле- ....

; i дованных40 160 40 160

I m Стафилококк

Токсоплазмы 26,2tO,28 58,8+6,9 2,0510,09 1,47tO,04 « Стафилококк

;Токсоплазмы 5,75+2,43 ,35 7,,53 5,85t1,06

,- „ , „. ..„

IТаблица2

Группы Тест-микроб ЙЭФ ИСЗН обследо-;

J 40 мйн бо мйн

Стафилококк , 0,68-1,65

Токсоплазмы 0,30-2,03 ,57 0,96-2,04

,j, Стафилококк 0,86-1,30

Токсоплазмы 0,33-1,73 35-16,67 2,32-14,28

. I

Составитель С.Пылова

. .Олийн,,к ; корректор т. Малец

--- ---------- --------- --.«-.,.«,

Заказ 3983Тиоаж 518гт

1ираж эюПодписное

ВНИИШ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР . V 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат Патент. г.Ужгород, улГгГгТрйн О