Изобретение относится к фармации, биотехнологии и касается создания раствора для инъекций на основе интерферона, а также к рекомбинантным штаммам Escherichia coli (E. coli) и плазмидам для его получения.
Известны способы получения лейкоцитарного интерферона человека из лейкоцитов донорской крови человека, индуцированных вирусами и другими индукторами (SU 1713591, RU 2066188, RU 2080873).
Основным недостатком этих способов получения интерферонов является вероятность контаминации конечного продукта вирусами человека, такими как вирусы гепатитов В и С, вирус иммунодефицита и др. В настоящее время более перспективным признан способ получения интерферона путем микробиологического синтеза, который обеспечивает возможность получения целевого продукта со значительно более высоким выходом из сравнительно недорогого исходного сырья. Используемые при этом подходы позволяют создать оптимальные для бактериальной экспрессии варианты структурного гена, а также регуляторных элементов, контролирующих его экспрессию.
В настоящее время в качестве исходных микроорганизмов используют различные конструкции штаммов Pichia pastoris, Pseudomonas putida и Escherichia coli. Недостатком использования P.pastoris в качестве продуцента интерферона (J.N.Garcia, J.A.Aguiar et. al. // High level expression of human IFN-2b in Pichia pastoris. // Biotecnologia Aplicada., 12(3)., 152-155., 1995) являются крайне сложные условия ферментации этого типа дрожжей, необходимость строго поддерживать концентрацию индуктора, в частности метанола, в процессе биосинтеза; при этом уровень выхода целевого продукта сравним с уровнем выхода целевого продукта для рекомбинантных штаммов E.coli. Недостатком использования штаммов Ps.putida (SU 1364343, SU 1640996, SU 1591484, RU 1616143, RU 2142508) является сложность процесса ферментации при низком уровне экспрессии (10 мг интерферона на 1 л культуральной среды). Известно большое количество плазмид и созданных на их основе штаммов E.coli, экспрессирующих интерферон: штаммы E. coli ATCC 31633 и 31644 с плазмидами Z-pBR322 (Pst1) HclF-11-206 или Z-pBR 322(Pst1)/HclN SN 35-AHL6 (SU 1764515), штамм E.coli pINF-αA-P2 (SU 1312961), штамм E.coli pINF-αF-Ра (AU 1312962), штамм E. coli SG 20050 с плазмидой p280/21FN (Кравченко В.В. и др. Биоорганическая химия, 1987, т.13, №9, с.1186-1193), штамм E. coli SG 20050 с плазмидой pINF14 (SU 1703691), штамм E. coli SG 20050 с плазмидой pINF16 (RU 2054041) и другие. Недостатком технологий, основанных на использовании этих штаммов, является их нестабильность, а также недостаточный уровень экспрессии интерферона.
Прототипом заявляемых штамма и плазмиды является штамм E.coli SS5 и рекомбинантная плазмида pSS5, содержащая три промотора: Plac, РT7 и Ptrp, и ген альфа-интерферона с введенными нуклеотидными заменами (RU 2165455).
Экспрессия интерферона штаммом E. coli SS5, содержащим эту плазмиду, контролируется тремя промоторами: Plac, РT7 и Ptrp. Уровень экспрессии интерферона составляет около 800 мг на 1 л клеточной суспензии.
Недостатками данной плазмиды и штамма на ее основе являются использование в плазмиде сильного нерегулируемого промотора фага Т7 в штамме Е. coli BL21 (DE3), в котором ген Т7 РНК полимеразы находится под промотором lac оперона и который всегда "течет". Следовательно, в клетке непрерывно происходит синтез интерферона, что приводит к диссоциации плазмиды и снижению жизнеспособности клеток штамма и в результате - к снижению выхода интерферона.
Наряду с особенностями используемых штаммов эффективность процесса во многом зависит от используемой технологии выделения и очистки интерферона.
Известен способ получения интерферона, включающий в себя культивирование клеток Ps.putida, разрушение биомассы, обработку полиэтиленимином, фракционирование серно-кислым аммонием, гидрофобную хроматографию на фенилсилохроме С-80, рН-фракционирование лизата, его концентрирование и диафильтрацию, ионообменную хроматографию на целлюлозе DE-52, элюирование в градиенте рН, ионообменную хроматографию полученного элюента на целлюлозе СМ-52, концентрирование пропусканием через кассету фильтров и гель-фильтрацию на Сефадексе G-100 (SU 1640996). Недостатком этого способа, кроме сложной многостадийной ферментации, является многостадийность при получении конечного продукта.
Известен способ получения интерферона, включающий в себя культивирование штамма Е. coli SG 20050/pIF16, в LB-бульоне в колбах в термостатированном шейкере, центрифугирование биомассы, ее промывку буферным раствором и обработку ультразвуком для разрушения клеток. Полученный лизат центрифугируют, промывают 3М раствором мочевины в буфере, растворяют в растворе гуанидинхлорида в буфере, обрабатывают ультразвуком, центрифугируют, проводят окислительный сульфитолиз, диализ против 8 М мочевины, ренатурацию и окончательную двухстадийную хроматографию на СМ-52 целлюлозе и сефадексе G-50 (RU 2054041, RU 2118366, RU 2123010). Недостатками этого способа являются его относительно невысокая производительность и нетехнологичность основных этапов процесса выделения и очистки. В особенности это относится к ультразвуковой обработке продукта, диализу и окислительному сульфитолизу, что приводит к нестабильности выхода интерферона, а также к невозможности использования этого метода для промышленного производства интерферона.
Прототипом заявляемого способа получения интерферона является способ получения лейкоцитарного интерферона человека, заключающийся в культивировании рекомбинантного штамма E.coli SS5, замораживании полученной биомассы, разрушении клеток микроорганизма лизоцимом, разрушении ДНК и РНК введением в лизат ДНК-азы и очистке нерастворимой формы интерферона отмывкой детергентами, растворении интерферона в растворе гуанидин гидрохлорида, ренатурации и одностадийной очистке на СМ-52 целлюлозе (RU 2165455).
Недостатком способа является низкая технологичность использования ферментативного разрушения клеток, ДНК и РНК микроорганизма и одностадийная хроматографическая очистка интерферона. Это обусловливает нестабильность процесса выделения интерферона, приводит к снижению его качества и ограничивает возможность использования приведенной схемы для промышленного производства интерферона.
При разработке препаратов на основе интерферона основные проблемы, с которыми сталкиваются разработчики, связаны с биологической нестабильностью интерферонов, имеющих пептидную структуру.
При изготовлении и хранении препаратов на основе интерферонов возможно изменение их свойств, протекающее с различной скоростью и степенью проявления. Подобные изменения влияют на срок годности (хранения).
Как известно, стабильность лекарственных препаратов зависит от многих факторов: температуры, рН, условий хранения, освещенности, состава окружающей атмосферы, способа приготовления, вспомогательных веществ, вида лекарственной формы, особенно ее агрегатного состояния, упаковки и т.п.
Как правило, с целью стабилизации принято использовать как химические методы - добавление стабилизаторов, антиоксидантов и консервантов, так и физические - защита от воздействия факторов внешней среды, применение высокоочищенных препаратов и вспомогательных веществ, а также комбинации указанных методов.
В каждом конкретном случае использование стабилизаторов требует тщательного изучения приведения их в состав, особенно в случае инъекционных растворов.
При создании лекарственных форм интерферона в виде водного раствора предпринимались попытки использования различных стабилизаторов, в том числе альбумина, полимеров, поверхностно-активных веществ, буферных растворов, консервантов, полиолов и углеводов.
В частности, из уровня техники известен водный раствор альфа-интерферона, содержащий неионогенное поверхностно-активное вещество, такое как полиоксиэтилен (20) сорбитан моноолеат, бензиловый спирт, изотонирующий агент, буфер на основе аммония ацетата или натрия лактата, обеспечивающий рН раствора 4,5-5,5 (Патент ЕР 736303, опубл. 09.10.1996, Hoffmann La Roche, A61К 38/21, 9/08). Однако данный препарат может терять свою активность за счет введения бензилового спирта, который хотя и оказывает антимикробное действие, может вызывать некоторую агрегацию пептидов.
Известен жидкий препарат интерферона альфа для инъекций, сохраняющий стабильность, который содержит в качестве стабилизатора рекомбинантный человеческий альбумин, систему буфера с контролем рН раствора 6,5-7,5 (Патент JP 2002-265383 с приоритетом от 14.03.2001, MITSUBISHI PHARMA CORPORATION). Введение альбумина нежелательно из-за возможности возникновения аллергических состояний.
Известен водный раствор α-интерферона для инъекций, содержащий (0,1-100)×106 МЕ/мл, буферную фосфатную систему, поддерживающую рН раствора 4,4-7,1, хелатообразователь, такой как динатриевая соль ЭДТА или лимонная кислота, производное моно-9-октадеканата поли-(окси-1,2-этандиил)-сорбитана, агент, обеспечивающий осмотичность раствора, такой как натрия хлорид, консервант, обладающий антимикробной активностью, например фенол, парабены и воду для инъекций (Патент RU 2157236, опубл. 10.10.200, ШЕРИНГ КОРПОРЕЙШН, а61к 38/21, 47/00). Срок хранения лиофилизированной формы составляет до 2 лет, а в виде раствора значительно меньше. Кроме того, введение консервантов может приводить к возникновению побочных эффектов при инъекционном введении.
Известен стабильный водный препарат интерферона альфа, содержащий буферную систему, например, включающую лимонную кислоту и дифосфат натрия, обеспечивающую рН раствора 4,5-9,0, стабилизирующий агент, представляющий собой декстран или гидроксилированный крахмал, неионогенный сурфактант - полиоксиэтилен сорбитана моноолеат, регулятор осмотического давления, такой как натрия хлорид, маннитол или их смесь, и воду для инъекций (Патент ЕР 1250932, опубл. 23.10.2002, TIANJIN NUALIDA BIOTECHNOLOGY, A61К 38/21, 47/00). Данное техническое решение может быть указано в качестве наиболее близкого аналога. Предлагаемая композиция не позволяет достичь оптимального срока хранения.
Как видно из источников, характеризующих уровень техники, последнее время в мире активно разрабатываются и патентуются фармацевтические композиции на основе интерферона, в том числе интерферона альфа-2. Однако им присущ ряд недостатков.
Задачей изобретения является получение препарата альфа-интерферона в форме водного раствора для инъекций, имеющего высокую активность и стабильность при хранении и не вызывающего побочных эффектов.
Для решения поставленной задачи предложена группа изобретений, объединенная общим изобретательским замыслом.
Указанная задача решается тем, что предлагается новая композиция состава препарата на основе высокоочищенного альфа-интерферона, содержащая инертный полимерный наполнитель, представляющий собой декстран или реополиглюкин с молекулярной массой декстрана 30-50 кД, неионогенное поверхностно-активное вещество - твин 80, этилендиаминтетрауксусную кислоту или ее динатриевую соль, буферную систему, включающую натрия ацетат или натрия цитрат для обеспечения рН раствора 4,5-5,5, натрия хлорид в качестве регулятора осмотического давления и воду для инъекций при следующем соотношении компонентов в мкг/мл:
Интерферон альфа (1-15)×106 ME
Натрия ацетат 1230-1640 или натрия цитрат 1470-1960
ЭДТА или ее динатриевая соль 60-80
Натрия хлорид 5800-7500
Твин 80 100-150
Декстран или реополиглюкин (в пересчете на декстран) 40000-100000
Вода для инъекций до 1 мл
В качестве интерферона альфа используют высокоочищенные препараты, предпочтительно интерферон альфа-2 или еще более предпочтительно альфа-2b человеческий рекомбинантный интерферон.
В качестве буфера предлагается использовать ацетатный буфер, включающий натрия ацетат, или цитратный буфер, включающий натрия цитрат. Использование буферных растворов для создания определенного рН, как правило, имеющего существенное значение для стабилизации растворов, хорошо известно в фармации. Однако как показали биофармацевтические исследования, применение их ограничено, так как многие из них реагируют с лекарственными веществами. Настоящим изобретением было обнаружено, что создание оптимального значения рН раствора с помощью именно ацетата или цитрата натрия значительно улучшает стабильность препаратов интерферона и не снижает активности препарата.
Твин 80 относится к неионогенным ПАВ и оказывает тормозящее действие на процессы агрегации в растворе и неспецифической сорбции на поверхности контейнеров хранения.
ЭДТА и его натриевые соли относятся к хелаторам, косвенно оказывающим антиоксидантное действие. Данный компонент связывает нежелательные примеси из стекла, технического оборудования и используемых в производстве вспомогательных веществ, предотвращает окислительные реакции. Кроме того, оказывает эмульгирующее действие в системе, что также повышает стабильность состава.
Как один из стабилизаторов включен также инертный полимерный наполнитель, представляющий собой декстран или реополиглюкин. В среде высокомолекулярных полимеров замедляется окисление. Введение декетрана также имеет важное значение для улучшения состояния при интоксикациях, сопровождающих вирусные заболевания.
Предлагаемый состав вспомогательных компонентов позволил достичь значительного повышения эффективности стабилизации, обусловленного использованием нового сочетания различных по механизму действия стабилизаторов, взятых в определенном количественном соотношении.
Полученный препарат нетоксичен и апирогенен у мышей и кроликов, обладает контролируемой антивирусной активностью при испытаниях на культурах клеток человека. Не оказывает побочных эффектов.
Задачей данного изобретения является также конструирование рекомбинантого промышленного штамма продуцента Е.coli, обладающего высоким уровнем биосинтеза интерферона, и разработка эффективной промышленной технологии получения субстанции интерферона медицинского назначения, соответствующей по качеству Европейской Фармакопее для субстанции интерферона альфа-2b.
Указанная задача решалась созданием рекомбинантной плазмидной ДНК pSX50 и штамма Escherichia coli SX50, депонированных во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (коллекционный номер В-8550).
Плазмида рSХ50 имеет 3218 пар оснований (п.о.) и характеризуется наличием следующих фрагментов:
- последовательность с 1 нуклеотида по 176 нуклеотид (н.) включает фрагмент ДНК размером 176 п.о., содержащий триптофановый промотор (Ptrp);
- последовательность с 177 н. по 194 н. включает синтетический фрагмент ДНК размером 18 п.о., содержащий последовательность Шайн Дельгарно, ответственный за инициацию трансляции;
- последовательность с 195 н. по 695 н. включает фрагмент ДНК размером 501 п.о., содержащий ген интерферона со следующими нуклеотидными заменами: 37 (А→С), 39 (G→T), 40 (А→С), 42 (G→T), 67 (А→С), 69 (G→T), 70 (А→С), 72 (А→Т), 96 (G→A), 100 (А→С), 102 (А→Т), 114 (А→С), 120 (C→G), 126 (G→A), 129 (G→A), 330 (C→G), 339 (G→A), 342 (G→A), 487 (A→C), 489 (А→Т), 495 (G→A);
- последовательность с 696 н. по 713 н. включает синтетический фрагмент ДНК размером 18 п.о., содержащий синтетический полилинкер;
- последовательность с 714 н. по 1138 н. включает фрагмент ДНК плазмиды рKK223-3 с 4129 н. по 4553 н. размером 425 п.о., содержащий последовательность строгого терминатора транскрипции rrnBT1Т2;
- последовательность с 1139 н. по 1229 н. включает фрагмент ДНК плазмиды pUC19 с 2487 н. по 2577 н. размером 91 п.о., содержащий промотор гена β-лактомазы (ген устойчивости к ампициллину - AmpR);
- последовательность с 1230 н. по 2045 н. включает фрагмент ДНК плазмиды pUC4K с 720 н. по 1535 н. размером 816 п.о., содержащий структурную область гена kan;
- последовательность с 2046 н. по 3218 н. включает фрагмент ДНК плазмиды pUC19 с 1625 по 453 н. размером 1173 п.н., содержащий последовательность, ответственную за репликацию плазмиды (ori) и lac промотора (Plac).
На фиг.1 изображена схема конструирования векторной плазмиды pSX10, на фиг.2 - схема конструирования рекомбинантной плазмиды pSX41, на фиг.3 - схема конструирования рекомбинантных плазмид р8Х43 и pSX45, на фиг.4 - схема конструирования рекомбинантной плазмиды pSX50, на фиг.5 - физическая карта плазмиды pSX50, на фиг.6 представлена установленная для плазмиды pSX50 полная последовательность нуклеотидов (указаны позиции нуклеотидных оснований, по которым сделаны замены).
Штамм Escherlchia coli SX50 получен трансформацией клеток Eschenchia coli BL21 плазмидой pSX50 с использованием традиционной генно-инженерной технологии. Штамм E.coli SX50 характеризуется следующими признаками:
Культурально-морфологические признаки
Клетки мелкие, прямые, утолщенной палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на агаре "Дифко" образуются круглые, гладкие, выпуклые, мутные, блестящие, серые колонии, с ровными краями. При росте в жидких средах (в минимальной среде с глюкозой или в LB-бульоне) образуют интенсивную ровную муть.
Фикико-биологические признаки
Аэроб. Температурный диапазон роста 4-42°С при оптимуме рН 6,5-7,5. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной формах, так и органические соединения в виде аминокислот, пептона, триптона, дрожжевого экстракта и т.д.
В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы.
Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к канамицину (до 100 мкг/мл). Штамм Escherichia coli SX50 - продуцент интерферона.
Способ, условия и состав среды для хранения штамма
В L-агаре с добавлением канамицина до концентрации 20 мкг/мл под маслом, в L-бульоне, содержащем 15% глицерина и соответствующие антибиотики, в ампулах при температуре минус 70°С, в лиофилизированном состоянии - в ампулах при температуре 4°С.
Штамм Escherichia coli SX50 идентифицирован по Определителю Берги (1974) как штамм вида Escherichia coli.
Особенностью заявляемого способа является разработка технологии, позволяющая выделять интерферон из нерастворимой формы, накапливающейся в течение ферментации, что позволяет существенно упростить технологическую схему процесса выделения и повысить выход целевого продукта.
Способ заключается в культивировании в питательной среде штамма Escherichia coli SX50, разрушении клеток микроорганизма в дезинтеграторе типа Гаулин при давлении 900 bar, выделении и очистке нерастворимой формы интерферона с использованием детергентов и последующим центрифугированием, растворении осадка в растворе гуанидин гидрохлорида и последующей ренатурации интерферона.
Полученный ренатурированный интерферон подвергают очистке с помощью ионообменной хроматографии на ионообменных смолах типа СМ Sephsrose Fast Flow или SP Sepharose Fast Flow, высокоэффективной жидкостной хроматографии на обращенной фазе С18 и гель-фильтрационной хроматографии на смолах типа Superdex 75.
Оптимальными условиями проведения отдельных стадий получения интерферона являются следующие:
- ферментацию проводят при непрерывном добавлении субстратов в течение всего процесса, что обусловливает высокий уровень экспрессии интерферона;
- разрушение клеток осуществляют в дезинтеграторе типа Гаулин при давлении не менее 700 bar;
- удаление растворимых клеточных компонентов (ДНК, РНК, белков, липополисахаридов и т.д.) производят промыванием нерастворимой формы интерферона буферными растворами, содержащими денатурирующие агенты и детергенты (Тритон X100, мочевина и т.д.);
- полученный осадок, содержащий интерферон, растворяют в буферном растворе, содержащем 6 М гуанидин гидрохлорид;
- ренатурацию интерферона проводят в физиологическом буферном растворе, содержащем хаотропные агенты и детергенты;
- использование пары окисленного и восстановленного глутатиона позволяет обеспечить правильное формирование дисульфидных связей в молекуле интерферона;
- четырехстадийную хроматографическую очистку интерферона проводят на ионообменных смолах типа CM Sephsrose Fast Flow или SP Sepharose Fast Flow, обращенной фазе С 18 и гель-фильтрационной хроматографии на смолах типа Superdex 75;
- после каждой хроматографической очистки проводят стерилизующую фильтрацию через апирогенные фильтры с размерами пор 0,22 микрон.
Выход интерферона в результате применения описанного способа составляет не менее 400 мг интерферона с 1 л культуральной среды. Качество получаемого продукта соответствует нормам и требованиям Европейской Фармакопеи для субстанции альфа-2b интерферона.
Существенными отличиями заявляемого способа от прототипа являются:
- использование конструкции штамма с более высокой производительностью, что позволяет получать при биосинтезе большее количество интерферона с 1 л культуральной среды;
- использование эффективного механического разрушения клеточной биомассы, что позволяет получать более чистый экстракт нерастворимой формы интерферона за более короткое время с меньшими потерями;
- использование физиологических буферных растворов при ренатурации в присутствии хаотропных агентов и детергентов позволяет повысить выход корректно ренатурированной формы интерферона;
- использование пары окисленного и восстановленного глутатиона позволяет обеспечить корректное формирование дисульфидных связей в целевом продукте;
- четырехстадийная хроматографическая очистка интерферона позволяет получать субстанцию интерферона с чистотой более 99% по данным электорофореза в редуцирующих и нередуцирующих условиях и более 98% по данным обращено-фазной ВЭЖХ, не содержащую пирогенов (LAL-тест).
Сущность и преимущества заявляемой группы изобретений иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмиды pSX50
Способ конструирования плазмиды pSX50 включает следующие этапы:
- конструирование векторной плазмиды pSX10:
1) конструирование плазмиды pSX3 (2641 п.о.)
2) конструирование векторной плазмиды pSX10 (2553 п.о.)
- конструирование рекомбинантной плазмиды pSX41 (3218 п.о.);
- конструирование рекомбинантной плазмиды pSX43 (3218 п.о.);
- конструирование рекомбинантной плазмиды pSX45 (3218 п.о.);
- конструирование рекомбинантной плазмиды pSX50 (3218 п.о.);
Конструирование векторной плазмиды pSX10
Векторная плазмида pSX10 представляет собой вектор pUC19, в котором кодирующая последовательность гена бета-лактомазы, обеспечивающая устойчивость к ампициллину, заменяется на кодирующую последовательность гена kan и содержит терминатор транскрипции из плазмиды рKK223-3.
Конструирование векторной плазмиды pSS10 проводят в две стадии:
- получение плазмиды pSX3 (2641 п.о.), представляющей собой плазмиду pUC19, в которой кодирующая область amp гена заменяется на кодирующую область гена kan;
- получение веторной плазмиды pSX10 (2553 п.о.), представляющей собой плазмиду pSX3, в которой за BamHI сайтом вставлен фрагмент ДНК, кодирующий терминатор транскрипции rrBT1Т2.
Для получения плазмиды pSX3 проводят пять раундов амплификации ДНК методом ПЦР (полимеразная цепная реакция). В ходе первого раунда, используя ДНК плазмиды pUC19 в качестве матрицы, проводят амплификацию фрагмента ДНК размером 1828 п.о. (фрагмент PU1-PU2) с помощью праймеров:
PU1 5'-CCCGTTGAATATGGCTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTG-3'
PU2 5'-ATGCTCGATGAGTTTTTCTAACTGTCAGACCAAGTTTAC-3'
Данную и последующие ПЦР реакции проводят в следующих условиях: 20 mM Tis-HCl, рН 8.8, 10 mM (NH4)2SO4, 10 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0.1% Triton X100, 0.1 mg/ml
BSA, 0.2 mM каждого dNTP, 1,25 ед. Pfu ДНК полимеразы, 100 нг ДНК.
Процесс амплификации состоит из следующих стадий: прогревание при 95°С 5 мин, 35 циклов ПЦР (30 с 95°С, 30 с 56°С, 2 мин 72°С) и инкубация 10 мин при 72°С. После амплификации (и после последующих амплификации) фрагмент ДНК очищают электрофоретически в 1% агарозном геле. В ходе второго и третьего раундов, используя ДНК плазмиды pUC4K в качестве матрицы, проводят амплификацию фрагмента ДНК размером 555 п.о. (фрагмент КМ1-КМ2) с помощью праймеров:
КМ1 - 5'-CAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGCCATATTCAACGGG-3'
КМ2 - 5'-CCGGTGAGAATGGCAAGAGTTTATGCATTTC-3'
и амплификацию фрагмента ДНК размером 258 п.о. (КМ3-КМ4) с помощью праймеров
КМ3 - 5'-GAAATGCATAAACTCTTGCCATTCTCACCGG-3'
КМ4 - 5'-GTAAACTTGGTCTGACAGTTAGAAAAACTCATCGAGCAT-3'
Далее фрагменты (КМ1-КМ2) и (КМ3-КМ4) объединяют в четвертом раунде амплификации, используя праймеры КМ1 и КМ4, получают фрагмент ДНК размером 813 п.о. (КМ1-КМ4), кодирующий структурную часть гена kan.
В пятом раунде ПЦР проводят объединение фрагментов (PU1-PU2) и (КМ1-КМ4) в следующих условиях: прогревание при 95°С 5 мин, 5 циклов ПЦР (30 с 95°С, 30 с 56°С, 10 мин 72°С) и инкубация 10 мин при 72°С. ДНК, полученную после последней ПЦР, прямо трансформируют в клетки штамма E.coli DH5 и высевают на среду LA, содержащую 20 мкг/мл канамицина. После инкубирования в течение 12 час при 37°С клоны отсевают, выделяют плазмидную ДНК и проводят рестрикционный анализ. В результате получают плазмиду pSX3 размером 2641 п.о.
Для получения векторной плазмиды pSX10 проводят три раунда амплификации ДНК методом ПЦР. В ходе первого раунда, используя ДНК плазмиды pSX3 в качестве матрицы, проводят амплификацию фрагмента ДНК размером 2025 п.о. (фрагмент 10.1-10.2) с помощью праймеров:
10.1 - 5'-CCGCCAAAACAGCTGCAGGTCGACGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGC-3'
10.2 - 5'-AATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGCCATATTCAACGGG-3'
В ходе второго раунда, используя ДНК плазмиды рKK223-3 в качестве матрицы, проводят амплификацию фрагмента ДНК размером 528 п.о. (фрагмент KK1-KK2) с помощью праймеров:
KK1 - 5'-GCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCGTCGACCTGCAGCTGTTTTGGCGG-3'
KK2 - 5'-CCCGTTGAATATGGCTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATT-3'
В третьем раунде ПНР проводят объединение фрагментов (10.1-10.2) и (KK1-KK2) в следующих условиях: прогревание при 95°С 5 мин, 5 циклов ПЦР (30 с 95°С, 30 с 56°С, 10 мин 72°С) и инкубация 10 мин при 72°С. ДНК, полученную после последней ПНР, прямо трансформируют в клетки штамма E.coli DH5 и высевают на среду LA, содержащую 20 мкг/мл канамицина. После инкубирования в течение 12 час при 37°С клоны отсевают, выделяют плазмидную ДНК и проводят рестрикционный анализ. В результате получают плазмиду pSX10 размером 2553 п.о.
Конструирование рекомбинантной плазмиды pSX41
Рекомбинантная плазмида pSX41 представляет собой Hind III - BamHI фрагмент ДНК векторной плазмиды pSX3 (2529 п.о.), Hind III - EcoRI фрагмент ДНК размером 168 п.о., кодирующий промотор триптофанового оперона E. coli (Ptrp), EcoRI-XbaI синтетический фрагмент ДНК размером 20 п.о., кодирующий SD последовательность (Шайн-Дельгарно) и XbaI-BamHI фрагмент ДНК размером 501 п.о., кодирующий ген альфа 2b интеферона человека.
Для получения Hind III - BamHI фрагмент ДНК векторной плазмиды pSX3 (2529 п.о.) ДНК плазмиды pSX3 обрабатывают ферментами рестрикции Hind III и BamHI с последующей электрофоретической очисткой в 1% агарозном геле.
Hind III - EcoRI фрагмент ДНК размером 168 п.о., кодирующий промотор триптофанового оперона (Ptrp), получают методом ПНР, используя тотальную ДНК Е.coli в качестве матрицы и праймеры TRP1 и PRP2, с последующей обработкой амплифицированного фрагмента рестриктазами Hind III и EcoRI:
TRP1 - 5'-CCCAAGCTTCGTAAATCACTGCATAATTCGTG-3'
TRP2 - 5'-CCGGAATTCCTGGCGATACCCTTTTTACG-3'
Для получения EcoRI-XbaI синтетический фрагмент ДНК размером 20 п.о., кодирующий SD последовательность (Шайн-Дельгарно), синтезируются следующие комплементарные олигонуклеотиды:
SD1 - 5'-AATTCAGGAGGCCT-3'
SD2 - 5'-CTAGAGGCCTCCTG-3'
XbaI-BamHI фрагмент ДНК размером 501 п.о., кодирующий ген альфа 2b интеферона человека, получают методом ПЦР, используя тотальную ДНК человека в качестве матрицы и праймеры IFN1 и IFN2, с последующей обработкой амплифицированного фрагмента рестриктазами XbaI и BamHI:
IFN1 - 5'-TGCTCTAGATGTGTGATCTGCCTCAAAC-3'
IFN2 - 5'-CGCGGATCCTCATTCTTTACTACGTAAACTTTCTTGC-3'
Далее электрофоретически очищенные фрагменты объединяют, лигируют ферментом лигаза фага Т4, ДНК трансформируют в клетки штамма E.coli DH5 и высевают на среду LA, содержащую 20 мкг/мл канамицина. После инкубирования в течение 12 час при 37°С клоны отсевают, выделяют плазмидную ДНК, проводят рестрикционный анализ и определяют первичную структуру ДНК. В результате получают плазмиду pSX41 размером 3218 п.о. Далее проводят поэтапный мутагенез гена интерферона для увеличения уровня экспрессии целевого продукта. Мутагенез гена интерферона заключается в замене редко встречающихся в E.coli триплетов, кодирующих соответствующие аминокислоты, на часто встречающиеся в E. coli триплеты, кодирующие эти же аминокислоты. Мутагенез ДНК гена интерферона проводят методом ПЦР.
Конструирование рекомбинантной плазмиды р8Х43
Для получения рекомбинантной плазмиды pSX43 проводят один раунд амплификации ДНК методом ПЦР, используя ДНК плазмиды pSX41 в качестве матрицы и праймеры IFN3 и IFN4:
IFN3 - 5'-TAGCCGTCGTACCTTGATGCTCCTGGCACAGATGCGTCGTATCT-3'
IFN4 - 5'-AGATACGACGCATCTGTGCCAGGAGCATCAAGGTACGACGGCTA-3'
ПЦР проводят в следующих условиях: прогревание при 95°С 5 мин, 20 циклов ПНР (30 с 95°С, 30 с 56°С, 10 мин 72°С) и инкубация 20 мин при 72°С. ДНК, полученную после ПЦР, прямо трансформируют в клетки штамма E. coli DH5 и высевают на среду LA, содержащую 20 мкг/мл канамицина. После инкубирования в течение 12 час при 37°С клоны отсевают, выделяют плазмидную ДНК, проводят рестрикционный анализ и определяют первичную структуру ДНК. В результате получают плазмиду pSX43 размером 3218 п.о.
Конструирование рекомбинантной плазмиды pSX45
Для получения рекомбинантной плазмиды pSX45 проводят один раунд амплификации ДНК методом ПНР, используя ДНК плазмиды pSX43 в качестве матрицы и праймеры IFN5 и IFN6:
IFN5 - 5'-CTTGAAGGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAGTTTGGC-3'
IFN6 - 5'-GCCAAACTCCTCCTGGGGAAATCCAAAGTCATGTCTGTCCTTCAAG-3'
ПНР проводят в следующих условиях: прогревание при 95°С 5 мин, 20 циклов ПНР (30 с 95°С, 30 с 56°С, 10 мин 72°С) и инкубация 20 мин при 72°С. ДНК, полученную после ПНР, прямо трансформируют в клетки штамма E. coli DH5 и высевают на среду LA, содержащую 20 мкг/мл канамицина. После инкубирования в течение 12 час при 37°С клоны отсевают, выделяют плазмидную ДНК, проводят рестрикционный анализ и определяют первичную структуру ДНК. В результате получают плазмиду pSX45 размером 3218 п.о.
Конструирование рекомбинантной плазмиды pSX50
Для получения рекомбинантной плазмиды pSX50 проводят один раунд амплификации ДНК методом ПНР, используя ДНК плазмиды pSX45 в качестве матрицы и праймеры IFN7 и IFN8:
IFN7 - 5'-CAGAGACTCCGCTGATGAAAGAAGACTCCATTC-3'
IFN8 - 5'-GAATGGAGTCTTCTTTCATCAGCGGAGTCTCTG-3'
ПЦР проводят в следующих условиях: прогревание при 95°С 5 мин, 20 циклов ПЦР (30 с 95°С, 30 с 56°С, 10 мин 72°С) и инкубация 20 мин при 72°С. ДНК, полученную после ПЦР, прямо трансформируют в клетки штамма E.coli DH5 и высевают на среду LA, содержащую 20 мкг/мл канамицина. После инкубирования в течение 12 час при 37°С клоны отсевают, выделяют плазмидную ДНК, проводят рестрикционный анализ и определяют первичную структуру ДНК. В результате получают плазмиду pSX50 размером 3218 п.о.
Пример 2. Получение штамма Е.coli SX50 - продуцента интерферона
Штамм-продуцент интерферона Е.coli SX50 получают путем трансформации клеток штамма Е. coli BL21 рекомбинантной плазмидой pSX50. Штамм-продуцент интерферона выращивают в 30 л ферментере до оптической плотности 25,0-30,0 о.е. в среде М9, содержащей 1% кислотного гидролизата казеина (Difco), 1% глюкозы, 40 мкг/мл канамицина, при температуре 38-39°С. В процессе ферментации проводят непрерывное добавление питательного субстрата, используя гравиметрический контроллер.
Содержание интерферона в биомассе клеток, получаемое с 1 л культуры, составляет в зависимости от серии 0.9-1.0 г интерферона.
Пример 3. Способ выделения интерферона из штамма Е. coli SX50
Получение интерферона проводили в 4 этапа:
1 этап. Культивирование штамма Е. coli SX50
2 этап. Выделение и очистка нерастворимой формы интерферона
3 этап. Растворение и ренатурация интерферона
4 этап. Хроматографическая очистка интерферона
1 этап. Культивирование штамма E.coli SX50
Выращенный посевной материал штамма E. coli SX50 в объеме 3 л на богатой среде LB в течение 12 ч при 26°С асептически вносят в ферментер, содержащий 27 л стерильной среды, содержащей М9, 1% кислотного гидролизата казеина, 1% глюкозы, 1 мМ MgCl2, 0.1 mM CaCl2, 40 мг/мл канамицина. Культивирование в ферментере проводят при температуре 38-39°С, поддерживая рН 7±0,15 путем автоматической подтитровки 40%-ным раствором гидроокиси натрия. Концентрацию растворенного кислорода в диапазоне (50±10)% от насыщения поддерживают путем изменения скорости оборотов мешалки от 100 до 800 об/мин и подачи воздуха от 1 до 15 л/мин. Концентрацию субстратов, в частности глюкозы, измеряют в течение ферментации и поддерживают их концентрацию путем изменения скорости подачи концентрированных растворов через перистальтические насосы, используя гравиметрический контроллер.
Накопление интерферона в виде нерастворимой формы - "телец включений" - контролируют с помощью фазово-контрастной микроскопии. Ферментацию останавливают по достижении максимальной оптической плотности (˜25-30 о.е.) и появлении зрелых "телец включений". По окончании ферментации культуральную жидкость сепарируют центрифугированием в проточном роторе при скорости вращения 5000-10000 об/мин. Биомассу фасуют в полиэтиленовые пакеты и замораживают при температуре минус 70°С.
2 этап. Выделение и очистка нерастворимой формы интерферона
100-150 г замороженной биомассы штамма Е. coli SX50 суспендируют в 3000 мл буфера 1 (20 мМ Tris-HCl, pH8.0, 10 мМ ЭДТА, 0.1% Triton X100). Суспензию пропускают через проточный гомогенизатор типа Гаулин, поддерживают давление 900 бар и центрифугируют в проточном роторе при 15000 об/мин. Полученный осадок промывают в аналогичных условиях последовательно буфером 2 (20 мМ Tris-HCl, pH8.0, 1 мМ ЭДТА, 3 М мочевины) и буфером 3 (20 мМ Tris-HCl, pH 8.0, 1 мМ ЭДТА) и окончательно осадок интерферона суспендируют в 200 мл буфера 3. При этом время выделения и очистки нерастворимой формы интерферона составляет не более 5 час.
3 этап. Растворение и ренатурация интерферона
К полученной на предыдущем этапе суспензии нерастворимой формы интерферона добавляют сухой гуанидин гидрохлорид до концентрации 6 М или мочевину до концентрации 8 М, добавляют растворы Трис-HCl, рН 8.0, до концентрации 20 мМ, ЭДТА до концентрации 5 мМ и дитиотреитола до концентрации 50 мМ и инкубируют при комнатной температуре в течение 2 ч. Нерастворимый материал отделяют центрифугированием с последующей стерилизующей фильтрацией через мембрану с диаметрами пор 0,22 микрона.
Ренатурацию интерферона проводят путем быстрого разбавления полученного раствора в 100 раз буфером 7 (20 мМ Tris-HCl, pH 8.0, 35 мМ NaCl, 0,8М мочевина, 0,1% CHAPS или Тритон Х-114, по 1 мМ окисленного и восстановленного глутатиона или 25 мкМ сульфата меди), после чего ренатурационную смесь инкубируют при постоянном перемешивании в течение 12-15 час при температуре 12-16°С. Далее агрегированный материал удаляют стерилизующей фильтрацией через мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 микрона.
4 этап. Хроматографическая очистка интерферона
Хроматографическую очистку интерферона осуществляют в четыре стадии.
1. Полученный ренатурированный интерферон на первом этапе подвергают очистке с помощью катионообменной хроматографии на смоле типа CM Sepharose Fast Flow или SP Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) и интерферон элюируют градиентом (0,0-0,5 M) NaCl в буфере 50 мМ Na(СН3СОО) рН 5,0. На данной стадии достигается очистка интерферона от компонентов ренатурационного буфера, белков и ДНК клетки хозяина.
2. На второй стадии хроматографической очистки раствор интерферона подвергают обратнофазной хроматографии (Vydac). Примеси неправильно свернутых и окисленных изоформ интерферона отделяют с помощью градиента ацетонитрила (30%→80%) в 0.2% трифторуксусной кислоте.
3. Очистку от остатков органических растворителей с одновременным концентрированием проводят с помощью катионообменной хроматографии на смоле типа SP Sepharose Fast Flow или CM Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) и интерферон элюируют градиентом (0,0-0,5 M) NaCl в буфере 50 мМ Na(СН3СОО) рН 5,0.
4. Очистку мономерной формы интерферона от остатков полимерных форм интерферона проводят на четвертой стадии очистки интерферона - гель-фильтрации на смоле типа Superdex 75 (Amersham Biosciences). Хроматографию проводят в буфере 25 мМ ацетата натрия, цитрата натрия или фосфата натрия рН 5,0-7,0, содержащем 0.15 M NaCl.
Описанный способ выделения и очистки интерферона позволяет получить 4-5 г высокоочищенного интерферона за один цикл выделения в течение 7-10 дней из биомассы, полученной с 10 л культуральной среды. Качество получаемого интерферона в полной мере соответствует требованиям Европейской Фармакопеи для субстанции интерферона альфа-2b, а именно:
а. Концентрация интерферона не менее 2×108 МЕ/мл.
b. Удельная активность интерферона не менее 1.4×108 МЕ/мг.
с. Электофоретическая чистота препарата не менее 98,4% в редуцирующих и не редуцирующих условиях при окрашивании гелей серебром;
d. Содержание правильно ренатурированной формы интерферона не менее 95% по данным обращенно-фазной ВЭЖХ;
е. Изоэлектрическая точка выделенного интерферона находится в районе рН 5,8-6,3;
f. Пептидная карта выделенного интерферона принципиально не отличается от пептидной карты для Европейского стандарта интерферона альфа 2b CRS;
g. Содержание бактериальных эндотоксинов не более 100 ME на 1 мг интерферона.
Как следует из приведенных примеров, заявляемая группа изобретений позволяет получать интерферон альфа-2b с высоким выходом при относительно простой и надежной технологии.
Возможность осуществления изобретения может быть проиллюстрирована следующими примерами:
Пример 1. Состав препарата на одну дозу:
Интерферон альфа 3×106 ME
Натрия ацетат 1640
ЭДТА динатриевая соль 60-80
Натрия хлорид 5800
Твин 80 100
Декстран 40 50000
Вода для инъекций до 1 мл
Способ приготовления:
Для приготовления указанного раствора смешивают 200 мл 1 М раствора натрия ацетата, 100 мл 1 М натрия хлорида и 10 мл 0,02М раствора этилендиаминтетрауксусной кислоты динатриевой соли, приготовленных на воде для инъекций. Объем доводят до 400 мл водой для инъекций. К раствору добавляют 10 мл 1% раствора Твин 80 и 500 мл 10% раствора декстрана 40. При необходимости доводят значение рН до 4,5-5,5 0,1 М уксусной кислотой. Раствор охлаждают до 4°С, после чего к нему добавляют раствор субстанции интерферона альфа-2b до концентрации 3,6 млн МЕ/мл в литре конечного раствора. Полученный раствор доводят до 1 л водой для инъекций, подвергают стерилизующей фильтрации на мембранном фильтре 0,22 мкм и разливают в ампулы по 1 мл или во флаконы по 2 мл.
Полученный раствор стабилен при хранении при 2-8°С в течение 30 месяцев.
Пример 2. Изучение стабильности методов «ускоренного старения»
Образцы растворов предложенного препарата на основе интерферона альфа-2b человеческого рекомбинантного закладывали на хранение при температура 37°С, определяли экспериментальный срок хранения, при котором сохранялись показатели качества, предъявляемые согласно нормативным документам (НД) и рассчитывали эквивалентный срок хранения в обычных условиях.
Срок рассчитывают по следующей формуле:
С=Сэ×А[(txp-tфс)/10],
где Сэ - экспериментальный срок хранения, в сутках
С - срок хранения при температуре, указанной в ФС, в сутках
А - температурный коэффициент скорости химической реакции, принят А=2
txp - температура хранения методом «ускоренного старения», в °С
tфс - температура хранения по НД, в °С
Результаты исследования стабильности препарата Интерферон альфа-2b человеческий рекомбинантный, раствор для инъекций представлены в таблицах 2-5.
Как следует из представленных данных испытаний, разработанный новый состав раствора для инъекций имеет высокую стабильность, сохраняя показатели, соответствующие требованиям нормативной документации, в течение длительного времени.
Разработанный новый состав препарата позволяет увеличить срок годности при его высокой активности и отсутствии побочных эффектов.
Препарат может храниться длительное время без необходимости лиофилизации, требующей дополнительных энергозатрат и могущей привести к снижению активности препарата.
Изобретение относится к фармации, биотехнологии и касается создания раствора для инъекций на основе интерферона, а также к рекомбинантным штаммам Escherichia coli (E.coli) и плазмидам для его получения. Предлагается новая рекомбинантная мультикопийная плазмидная ДНК pSX50, кодирующая синтез лейкоцитарного альфа-2b интерферона человека, экспрессия которого находится под контролем лактозного и триптофанового промоторов и терминатора транскрипции. В результате трансформации клеток реципиентного штамма Е. coli BL21 рекомбинантной плазмидной ДНК pSX50 получен штамм E.coli SX50 - продуцент рекомбинантного лейкоцитарного альфа-2b интерферона человека с продуктивностью до 0.9-1.0 г альфа-2b интерферона. Способ получения рекомбинантного альфа-2b интерферона основан на использовании созданного рекомбинантного штамма Е. coli SX50 и предусматривает его глубинное культивирование на питательной среде с пониженным содержанием триптофана при непрерывном добавлении питательных субстратов в процессе биосинтеза, механическое разрушение клеток микроорганизма при высоком давлении, растворение агрегированного белка в концентрированном растворе гуанидин гидрохлорида с последующей ренатурацией интерферона в физиологических буферных растворах в присутствии хаотропных агентов и его очисткой с использованием трехстадийной хроматографической очистки интерферона на смолах типа Chelating Scpharose Fast Flow, иммобилизованной ионами Cu+2, ионообменной хроматографии на ионообменных смолах типа СМ Sephsrose Fast Flow и гель-фильтрационной хроматографии на смолах типа Superdex 75. Трехстадийная хроматографическая очистка интерферона позволяет получать субстанцию интерферона более 98% чистоты по данным электорофореза в редуцирующих и нередуцирующих условиях и более 95% по данным RF HPLC и не содержащую пирогенов (LAL-тест) в количествах не менее 400 мг с 1 л культуральной среды. Изобретение обеспечивает повышение выхода интерферона и стабильности раствора. 4 н. и 8 з.п. ф-лы, 5 табл., 6 ил.
| ПРЕПАРАТ ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА В ФОРМЕ СТАБИЛЬНОГО ВОДНОГО РАСТВОРА ДЛЯ ИНЪЕКЦИЙ | 2004 |
|
RU2255729C1 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2B, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА И ШТАММ ПРОДУЦЕНТ ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ | 2003 |
|
RU2242516C1 |
| РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pSS5, КОДИРУЮЩАЯ СИНТЕЗ РЕКОМБИНАНТНОГО ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО АЛЬФА-2b ИНТЕРФЕРОНА, ШТАММ ESCHERICHIA COLI SS5 - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО АЛЬФА-2b ИНТЕРФЕРОНА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2b | 1999 |
|
RU2165455C1 |
| Ультразвуковое сканирующее и фокусирующее устройство | 1984 |
|
SU1250932A1 |
