Способ определения степени патогенности штаммов вируса огуречной мозаики Советский патент 1991 года по МПК C12N7/00 A01N63/00 

Изобретение относится к вирусологии и фитопатологии и может быть использовано для определения степени патогенности штаммов или изолятов вируса огуречной мозаики (ВОМ) с последующим использованием сильнопатогенных штаммов ВОМ при оценки селекционного материала на устойчивость растений к вирусу, а слабо патогенных - при вакцинации растений для их

защиты от поражения сильнопатогенными штаммами ВОМ

Целью изобретения является уменьшение времени определения степени патогенности и увеличение числа выделяемых из одного природного изолята штаммов ВОМ.

Способ определения степени патогенности штаммов ВОМ заключается в следующем.

Растения перца Capsicum angulosum var. Largo comun № каталога ВИР-К-1630 в фазе 5-7 листьев инфицируют исследуемым изолятом или штаммом ВОМ, выращивают 6-12 дней при до образования на листьях растений локальных повреждений (некрозов), Визуально определяют морфологию полученных некрозов. К патогенным штаммам относят штаммы, вызывающие некрозы размером 1 см с черным центром, а к слабопатогенным - штаммы, вызывающие некрозы размером более 1,5 см в виде коричневого кольца со светлым хлоротичным центром.

Визуальный просмотр некрозов на ино- кулированных листьях перца К-1630 позволяет судить о патогенности природного изолята и его однородности в зависимости от частоты встречаемости однотипных некрозов.

Для получения мононекрозных мзоля- тов ВОМ и изучения их патогенных свойств некрозы с перца вырезают и заражают ими повторно перец, табак клейкий, табак обыкновенный (может быть использован другой системный хозяин вируса). Эффективность заражения системного хозяина при использовании единичных некрозов с перца 95%.

Способы оценки патогенности природных изолятов ВОМ базируются в основном на ответной реакции определенного набора растений-индикаторов. Характер и степень проявления симптомов болезни (мозаика, деформация листьев, задержка роста) служат основным критерием для оценки пато- генности изолятов вируса. Однако природный изолят нередко представляет собой популяцию штаммов, отличающихся по патогенности. Поэтому для диагностики природного изолята используют растения с локальной реакций на ВОМ, а именно бобы (Vlcia fabae), вигну (Vigna sinensls) и Chenopodium guinoa. При заражении указанных видов растений на инокулирован- ных листьях развиваются через 6-12 дней локальные повреждения - некрозы, которые в дальнейшем используют для заражения хозяина с системной реакцией. Обычно для характеристики изолята и оценки патогенности выбирают различные виды табака, на которых через 12-16 дней после заражения некрозами регистрируют симптоматику болезни. В дальнейшем для отбора штаммов с определенными характеристиками проводят повторные пассажи через хозяев с местной и системной реакцией, что занимает довольно продолжительный период времени и во многих случаях не дает положительных результатов в получении слабых штаммов ВОМ,

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример1.В лабораторных условиях изучали реакцию различных сортов перца из коллекции ВИР (Мг К-1515, 1615, 1630, 2033. 2407, 2453, 2454, 5605) на заражение различными природными изолятами ВОМ,

Для этого рассаду перца в фазе 3-5 листьев пикируют в вазоны и выращивают в теплице при 20-25°С, освещенности 18 ч в сутки.

В фазе 5-7 листьев растения инокулиру- ют инфекционным началом изолятов вируса,

Инокулюм готовят из листьев предварительного зараженных системных хозяев вируса ВОМ, выращенных в тех же условиях. Для приготовления инокулюма листья N.glutinosa или табака с верхних ярусов и с четкими симптомами мозаики через 14-16 дней после заражения мацерируют в 0,1%- ном растворе гипосульфита натрия в соотношении 1:10 соответственно. Каждым изолятом заражают 5-6 растений перца каждого сорта.

Для заражения используют изоляты: В- А. В-Л, В-С, В-3, В-4, В- П, характеристика которых представлена в табл.1.

Через 12 дней на инокулированных листьях перца К-1630 появляются некрозы, которые отличаются по размеру и типу проявления (черные пятна, хлоротичные пятна, концентрические кольца со светлым центром и т.д.). Эти некрозы вырезают бритвой и мацерируют на предметном стекле в капле 0,1 %-ного раствора гипосульфита натрия, гомогенат используют для заражения системного хозяина (N.glutinosa, табак) и через 2 недели наблюдают проявление симптомов. При направленном отборе для получения стабильных по патогенности штаммов ВОМ проводят 4-8 пассажей через местного и системного хозяина, так как географические изоляты представлены популя- циями штаммов.

Другие сорта перца (К-1515, 2033, 2407, 2453, 2454, 5605) и зараженные растения системных хозяев ВОМ (табак) при заражении изолятами ВОМ на инокулированных листьях развивают либо диффузную мозаику, либо хлоротичную пятнистость, за кото- рыми следует системная мозаика и деформация листьев. На сорте К-1615 наблюдали четкие локальные некрозы, но на сорте перца К-1630 гамма симптомов была выражена гораздо шира. чем на сорте К- 1615. Таким образом сорт перца К-1630 дзет ка все испытанные изоляты ВОМ локальную реакцию на листьях с наиболее разнообразными симптомами.

П р и м е р 2. По аналогичной методике изучали морфологические отличия географических изолятов ВОМ: В-13, В-25, В-26, В-27, Т-1, Т-3, Т-4, Т-5, характеристика которых представлена в табл.2.

Большинство изолятов на инокулиро- ванных листьях перца К-1630 вызывают локальные повреждения в виде некрозов, указанных в примере 1 и табл.3. Проводят повторное заражение перца К-1630 изоля- тами В-Л, В-С, Т-1, Т-3. Они вызывают в основном некрозы размером до 1 см с черным некротическим центром. Используя такие некрозы для заражения системного хозяина (N.glutinosa), в 85-90% случаев пол- учают патогенные штаммы ВОМ.

Данные по изучению патогенности изолятов ВОМ на Nicotiana glutinosa в зависимости от локальной реакции на перце К-1630 приведены в табл.3.

Изоляты В-Л и Т-1 входят сразу в 2 группы, так как являются географическими изо- лятами и представляют собой популяции штаммов, отличающихся по патогенности.

Таким образом, используя перец К-1630 для определения вирулентности изолятов ВОМ, возможно определить по морфологии локального некроза степень патогенности изучаемого изолята, исключая заражение растения с системной реакцией, необходимое в ранее применяемых способах. Встречаемость слабопатогенных штаммов значительно реже.

Пример 3. В лабораторных условиях изучают эффективность выделения моно- некрозных линий в зависимости от растения-хозяина с местной реакцией. С этой целью используют перец К-1630, 6o6bi(Vlcla fabae) и Ch.guinea.

Системным хозяином вируса служат во всех случаях растения Nicotiana glutinosa. Вырезают по 100 некрозов с каждого вида растений. При мацерации некрозов используют 0,1%-ный гипосульфит натрия. Для инокуляции используют изоляты В-С и В-3. Некрозы на хозяине с местной реакцией вырезают через 6-8 дней после инокуляции вирусом. Эффективность заражения табака

клейкого с перца составляет для изолята В-С 90-95%, для изолята В-3 95-90%: с бобов - 60-65% положительных заражений, с 5 Ch.guinoa -15-20%, т.е. использование пзр- ца К-1630 позволяет выделить мононекроз- ную линию в 85-95 случаев из 100.

П р и м е р А. Заражение перца К-1630 проводят, когда среднесуточная температу0 ра воздуха в теплице составляет 18-20°С. При одновременном заражении перца изо- лятами В-А, В-Л, В-С, В-3, В-4. В-11. В-13, В-26, В-27, Т-1 локальные симптомы (некрозы) наблюдаются через 8-10 дней для изо5 лятов В-Л, В-С, В-11, В-13, Т-1 через 10-12 дней для изолятов В-А, В-3, В-4, В-26. В-27, При среднесуточной температуре воздуха 24-26°С. Для получения местной реакции на перце К-1630 для изолятов В-С, В-Л, В0 11, В-13, Т-1, Т-3 достаточно 6 дней, для изолятов В-А, Т-5, Т-4 8 дней, для изолятов В-3, В-4, В-25, В-26 10-12 дней. Следовательно, минимальный период получения некрозов 6 дней, а максимальный - 12.

5 Таким образом, применение способа позволяет сократить время определения вирулентности изолятов и увеличить число вы- деляемых из одного изолята мононекрозных линий штаммов ВОМ.

0 Формула изобретения

Способ определения степени патогенности штаммов вируса огуречной мозаики, включающий заражение растений-индикаторов природными изолятами вируса, инку5 бацию зараженных растений и оценку результатов по наличию некрозов на листьях растений, о т л и ч аю щ и и с я тем, что, с целью уменьшения времени определения степени патогенности и увеличении числа

0 выделяемых из одного природного изолята штаммов ВОМ, в качестве растения-индикатора используют перец Capsicum angulosum var Largo comun (Nb каталога ВИ- Pa К-1630), к сильнопатогенным штаммам

5 относят штаммы, вызывающие некрозы размером до 1 см с черным центром, к слабопатогенным - штаммы, вызывающие некрозы размером более 1,5 см в виде коричневого кольца со светлым хлоротичным центром.

Таблица 1

Изобретение относится к вирусологии и фитопатологии и может быть использовано для определения степени патогенности штаммов или изолятов вируса огуречной мозаики (ВОМ) с последующим использованием сильнопатогенных штаммов ВОМ при оценке селекционного материала на устойчивость растений к вирусу и слабслатогенных при вакцинации растений для их защиты от поражения сильнопатогенными штаммами ВОМ. Целью изобретения является уменьшение времени определения степени патогенности и увеличение числа выделяемых из одного природного изолята штаммов ВОМ. Способ определения степени патогенности штаммов вируса огуречной мозаики заключается в следующем. Растения перца Capsicum Angulosum var Largo comurv N каталога ВИР-К-1630 в фазе 5-7 листьев инокулируют исследуемым изоля- том или штаммом ВОМ, выращивают 6-12 дней при температуре 26-18°С до образования на листьях растений локальных повреждений (некрозов). Визуально определяют морфологию полученных некрозов К патогенным штаммам относят штаммы,.вызывающие некрозы размером до 1 см с черным центром, а к слабопатогенным - штаммы, вызывающие некрозы размером более 1,5 см в виде коричневого кольца со светлым хлоротичным центром. Применение способа позволяет сократить время определения вирулентности изолятов и увеличить число выделенных из одного изолята мононекроз- ных линий (штаммов) ВОМ 3 табл. сл с о сл 4D -fcb vj 00

Таблица 2

Таблица 3