Способ получения препарата вакционного штамма вируса табачной мозаики Советский патент 1990 года по МПК A01N63/00 C12N7/00 

яется показателем предельной инфек- ционности исходного препарата.

Через 3-4 недели с температурой 20-25°С, после накопления вируса в растениях, осторожно отбраковывают растения, проявившие резкие симптомы. Этот этап, являясь этапом накопления вируса для нового препарата вакцины, одновременно используется как биологический контроль исходного препарата, при этом относительное число бессимптомных растений является показателем чистоты исходной партии вакцины и генетической стабильности вакцинного штамма. Вакцину считают пригодной для использования, если число патогенных изолятов не превышает 0,3% для вируса штамма V-69 и 1,6% для вируса штамма АТ-16. Листья бессимптомных растений собирают и используют для получение препарата вакцины.

Выделение вируса в предлагаемом способе осуществляют по упрощенной методике высаливания вируса сернокислым аммонием с использованием бумажных фильтров.

Промороженные листья измельчают с помощью бытовой мясорубки, сок отжимают через двойной слой марли. В сок добавляют сернокислый аммоний до конечной концентрации 20% и всю смесь наносят на бумажный фильтр в стеклянной воронке для осаждения на нем вируса. Отмывку осадка вируса осуществляют на этом же фильтре 17%-ным раствором сернокислого аммония, а растворение вируса с этого фильтра - водопроводной водой.

Растворенный вирус собирают в мерные цилиндры и снова осаждают в 20%-ном растворе сернокислого аммония . Осадок вируса уплотняется при выстаивании, и его концентрируют сливанием надрсадочной жидкости.

Препарат сохраняют до получения результата биологического контроля, который, в свою очередь, являетсяч этапом накопления следующей партии вакцины.

Из 1 кг листовой массы получают 700-800 мг вируса.

Препарат в 20%-ном растворе сернокислого аммония ампулируют, сохра- няют и транспортируют. Хранится пре- парат в холодильнике при 2-7 С, при транспортировке допускается хранение

1

1

0

5

при температуре от -5 до в пределах 1-2 мес. без потери исходной инфекционности.

П р и м е р. В условиях экспериментальной теплицы проводят испытания вакцинирующего эффекта штамма V-69 против 14 патогенных штаммов ВТМ, относящихся к трем генетическим группам (для растения томата) по классификации Пэлхэм и различающихся по патогенности. 100 сеянцев томата в фазе семядольных листочков иноку- лируют вакцинным штаммом V-69, затем спустя 10 дней проводят вторичную суперинокуляцию патогенными штаммами ВТМ. Контролями служат 3 группы сеянцев томата: 1 группа - растения, зараженные только вакцинным штаммом{ 2 - зараженные каждым ив патогенных штаммов; 3 - здоровые, не зараженные вирусом. В табл. 1 приведены результаты учета числа мозаичных растений через 1,5 мес. после инокуляции растений патогенными штаммами.

Таблица 1

i;

35

Все контрольные растения, зараженные патогенными штаммами, проявили резкие симптомы уже через 10-12 дней после инокуляции. Все незараженные растения остались здоровыми. Растения, зараженные вакцинным штаммом V-69 сохранились бессимптомными. В опыте вакцинирующий эффект штамма V-69 проявляется в сдерживании развития мозаичного заболевания отдельных штаммов на 10-84%.

Как видно из данных табл. 1 через 1,5 мес. число растений, проявивших резкие симптомы, снижается под действием вакцинного штамма и составляет 8,1-14,6%.

В производственных условиях при естественном распространении мозаичного заболевания на посадках томата

5 I

вакцинирующий эффект от обработки (опрыскивания) вакциной определяется при сравнении скорости распространения вредоносных форм ВТМ на вакцинированных и контрольных посадках.

Вакцинацию растений препаратом, полученным по данному способу, проводят в стадии семядолей, перед пи- кировкой; -высадку рассады осуществляют через 1 мес. после вакцинации. ,

В табл. 2 приведены результаты учета числа мозаичных растений на вакцинированных и контрольных посадках томата в производственных испытаниях в весенне-летнем севообороте на площади 2 гектара опыта и 2 гектара контроля (по 50000 растений).

В контроле нарастание числа мозаичных растений идет неуклонно и чег рез 3 мес. посадка полностью поражается мозаичным заболеванием ВТМ. В опыте проявление мозаики сильно подавлено, достигая в конце оборота пораженности не более, чем у 30% растений. В случаях проявления - мозаика в опыте выражена значительно мягче, чем в контроле.

Таблица2

Сроки учета

Число мозаичных растений в % от общего числа растений

581327 °

Активное сдерживание вирусного заболевания (число больных растений, острота симптомов) в течение длительного времени (практически в течение всего периода выращивания) создает условия для формирования и сохранения урожая томата.

10

ТаОлпцаЗ

15

В табл. 3 отражен эффект вакцины из штамма V-69 на урожайность томатов,

Прибавка урожая создает экономический эффект порядка 10000 руб с гектара при себестоимости продукции 70 коп за 1 кг.

Формула изобретения

.

Способ получения препарата вакцинного штамма вируса табачной мозаики, включающий последовательное заражение слабопатргенным вирусом табачной мозаики растений табака и томата, выращивание их, отбор бессимптомных растений, получение из них сока с последующим выделением и очисткой, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, из штаммов используют штамм V-69, из растений табака - гибрид селекции М.Ф.Терновского Nicotiana tabacura x Niglutinosa, а выделение и очистку осуществляют путем осаждения сернокислым аммонием с последующим нанесением осадка на бумажный фильтр и вымыванием вируса водой.

Изобретение относится к способам производства в научных и практических целях. В частности способ относится к производству препаратов вакуумных штаммов вируса табачной мозаики (ВТМ), которые предназначены для защиты растений от патогенных штаммов данного вируса. Целью изобретения является повышение выхода конечного продукта. Способ включает последовательное заражение штаммов вируса табачной мозаики V-69 растений табака - гибрида селекции М.Ф.Терновского NICOTIANA TABACUM X NIGLUTINOSA и томата, выращивание их, отбор бессимптомных растений, получение из них сока с последующим выделением и очисткой путем осаждения сернокислым аммонием с последующим нанесением осадка на бумажный фильтр и вымыванием вируса водой. 3 табл.