ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКИЙ СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРЕДНИЗОНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ Российский патент 2024 года по МПК G01N27/26 

Изобретение относится к области аналитической химии, а именно к определению веществ с помощью электрохимических средств путем определения электрохимических параметров, и может быть использовано для определения гормона преднизона в сыворотке крови.

Преднизон - это синтетический глюкокортикоид, широко применяемый для лечения многих заболеваний благодаря своим противовоспалительным и иммуносупрессивным свойствам. Является пролекарством, метаболизируется в печени под действием ферментов до активного препарата преднизолона. Количественное определение преднизона в сыворотке крови человека имеет большое значение при исследовании фармакокинетических параметров препаратов, содержащих преднизон, а также при оценке нарушении функций печени.

Известен способ определения преднизона в моче и фармацевтических препаратах методом квадратно-волновой катодной вольтамперометрии на стеклоуглеродном электроде, модифицированном углеродными наносферами [Sahoo S., Satpati A. K. Electrochemical characteristics of prednisone and its interaction with dsDNA over functionalized CNSs modified electrode //Biosensors and Bioelectronics: X. – 2022. – Т. 10. – С. 100-119]. Определение проводят в фосфатном буферном растворе при рН 7,2 в трехэлектродной ячейке, состоящей из индикаторного модифицированного электрода, насыщенного каломельного электрода сравнения и вспомогательного платинового электрода. В течение 10 минут перед каждым определением через раствор пропускают газообразный азот и при снятии вольтамперограмм регистрируют пик электровосстановления преднизона при потенциале -1,25 В. С помощью данного способа проводят количественное определение гормона в моче и фармацевтических препаратах с пределом обнаружения 7,3·10^-8 моль/дм³.

Недостатком способа является необходимость трудоемкой и длительной процедуры модификации индикаторного электрода.

Известен способ вольтамперометрического количественного определения преднизона в сыворотке крови на поверхности индикаторного электрода из пиролитического графита, модифицированного одностенными углеродными нанотрубками [Goyal R. N., Bishnoi S. Simultaneous voltammetric determination of prednisone and prednisolone in human body fluids //Talanta. – 2009. – Т. 79. – №. 3. – С. 768-774]. Электрохимический отклик регистрируют при помощи прямоугольной катодной вольтамперометрии в фосфатном буферном растворе при рН 7,2 в трехэлектродной ячейке. В качестве индикаторного электрода используют модифицированный одностенными углеродными нанотрубками пиролитический графит, в качестве вспомогательного и электрода сравнения – платиновый и хлоридсеребряный электроды соответственно. Перед каждым определением раствор барботируют газообразным азотом в течение 5 минут для удаления растворенного кислорода. Регистрацию сигнала электровосстановления преднизона в сыворотке крови проводят при потенциале -1,23 В с пределом обнаружения 0,45·10^-8 моль/дм³.

Недостаток способа заключается в необходимости модификации поверхности индикаторного электрода из пиролитического графита углеродными нанотрубками, что усложняет проведение эксперимента, увеличивает время анализа и является коммерчески нецелесообразным.

Известен вольтамперометрический способ количественного определения преднизона в сыворотке крови на поверхности индикаторного электрода, представляющего собой висящую ртутную каплю. Он принят за прототип изобретения. В качестве вспомогательного и электрода сравнения используют платиновый и хлоридсеребряный электроды соответственно. Определение проводят в буферном растворе Бриттона-Робинсона при рН 3,78 методом катодной дифференциально-импульсной вольтамперометрии [Ni Y., Li S., Kokot S. Simultaneous determination of three synthetic glucocorticoids by differential pulse stripping voltammetry with the aid of chemometrics //Analytical letters. – 2008. – Т. 41. – №. 11. – С. 2058-2076].

Аликвоту сыворотки крови, содержащую преднизон, добавляют в электрохимическую ячейку, состоящую из индикаторного, вспомогательного и электрода сравнения, помещенных в буферный раствор Бриттона-Робинсона (рН 3,78), удаляют кислород, растворенный в фоновом электролите при помощи пропускания газообразного азота через раствор в течение 6 минут, проводят предварительное электронакопление при потенциале -0,75 В в течение 30 с, затем после успокоения раствора в течение 10с регистрируют дифференциально-импульсные вольтамперограммы электровосстановления преднизона в диапазоне потенциалов от -0,75 до -1,15 В с интервалом 0,04 В при скорости сканирования 20 мВ/с. Концентрацию преднизона определяют по высоте катодного пика при потенциале -0,94±0,05В методом стандартных добавок. Предел обнаружения преднизона данным способом составляет 2·10^-8 моль/дм³.

Недостатком способа является использование в качестве индикаторного электрода токсичной металлической ртути.

Техническим результатом предложенного способа является разработка вольтамперометрического способа количественного определения преднизона в сыворотке крови методом катодной вольтамперометрии.

Вольтамперометрический способ количественного определения гормона преднизона в сыворотке крови, также как в прототипа, включает использование трехэлектродной электрохимической ячейки, содержащей в качестве фонового электролита буферный раствор Бриттона-Робинсона, в которую помещают индикаторный, вспомогательный и хлоридсеребряный электрод сравнения, удаляют кислород в растворе фонового электролита, барботируя его газообразным азотом, проводят электронакопление, регистрируют вольтамперограмму фонового электролита, затем последовательно вносят аликвоты сыворотки крови без преднизона, сыворотки крови с преднизоном, стандартные добавки раствора преднизона, проводя после внесения каждой добавки удаление кислорода, предварительное электронакопление и регистрацию вольтамперограмм электровосстановления преднизона относительно хлоридсеребряного электрода сравнения, определение концентрации преднизона по высоте катодного пика методом стандартных добавок.

Согласно изобретению, в качестве индикаторного электрода используют механически очищенный дисковый импрегнированный графитовый электрод. В качестве вспомогательного электрода используют хлоридсеребряный электрод, используют буферный раствор Бриттона-Робинсона с рН 7,4. Удаляют кислород из раствора фонового электролита, барботируя его азотом в течение 5 минут, проводят предварительное электронакопление в течение 10 с при потенциале +0,8 В, перемешивают в течение 10 с и успокаивают раствор в течение 20 с. Регистрируют катодную вольтамперограмму раствора фонового электролита в диапазоне развертки потенциалов от -1,0 до -1,6 В при скорости 70 мВ/с. После внесения аликвот сыворотки крови без преднизона, сыворотки крови с преднизоном, стандартных добавок раствора преднизона удаление кислорода и электронакопление ведут при тех же вышеуказанных условиях, а регистрацию вольтамперограмм электровосстановления преднизона ведут при потенциале -1,35±0,05 В в режиме постояннотоковой линейной развертки потенциала.

Вольтамперометрический способ количественного определения преднизона в сыворотке крови на немодифицированном импрегнированном графитовом электроде является простым в исполнении, экспрессным и селективным. Время анализа составляет не более 20 минут. По сравнению с прототипом предложенный способ является более безопасным, так как исключает применение металлической ртути.

На фиг. 1 представлена структурная формула преднизона.

На фиг. 2 показана зависимость тока электровосстановления преднизона от концентрации в буферном растворе Бриттона-Робинсона (рН 7,4) на импрегнированном графитовом электроде относительно хлоридсеребряного электрода (1 моль/л KCl), при скорости сканирования потенциала 70 мВ/с.

На фиг. 3 приведены вольтамперограммы электровосстановления преднизона на импрегнированном графитовом электроде, где 1 – раствор фонового электролита; 2 - сыворотка крови без добавления преднизона (100 мкл); 3 - сыворотка крови, содержащая 0,4 мкмоль/дм³ преднизона (100 мкл); 4,5 - стандартные добавки преднизона концентрацией 0,0001 моль/дм³ (20 мкл).

В таблице 1 представлены результаты количественного определения преднизона в сыворотке крови человека.

Использовали стандартный образец гормона преднизона с содержанием основного действующего вещества 99,5% (CAT № 1559006; material mfd in China) (фиг. 1).

Для приготовления исходного раствора концентрацией 0,001 моль/дм³ брали навеску преднизона массой 0,0179 г, которую помещали в мерную колбу вместимостью 50 см³, растворяли в смеси этилового спирта и воды (1:1) и доводили до метки водно-этанольной смесью. Далее готовили рабочий раствор преднизона с концентрацией 0,0001 моль/дм³. Для этого дозатором отбирали 5 см³ исходного раствора преднизона с концентрацией 0,001 моль/дм³, помещали в мерную колбу вместимостью 50 см³ и доводили до метки водно-этанольной смесью (1:1).

Для приготовления кислой части буферного раствора Бриттона-Робинсона брали навеску 2,4732 г борной кислоты, 2,65 мл ортофосфорной кислоты и 5,69 мл уксусной кислоты, помещали в мерную колбу вместимостью 1000 см³, растворяли в небольшом количестве дистиллированной воды и доводили объем раствора до метки дистиллированной водой. Для приготовления основной части буферного раствора Бриттона-Робинсона (0,2М NaOH) брали навеску NaOH массой 8 г, помещали в мерную колбу вместимостью 1000 см³, растворяли в небольшом количестве дистиллированной воды и доводили до метки дистиллированной водой. Для создания необходимого значения рН 7,4 к кислой части буферной смеси постепенно добавляли 0,2М NaOH. Регистрировали изменение рН с помощью рН-метра.

В качестве индикаторного электрода использовали дисковый импрегнированный графитовый электрод, представляющий собой стержень из спектроскопического графита, пропитанного парафином (ООО «ЮМХ» (Томск, Россия)). Поверхность электрода регенерировали механической полировкой на фильтровальной бумаге [Khristunova E. et al. Electrochemical immunoassay for the detection of antibodies to tick-borne encephalitis virus by using various types of bioconjugates based on silver nanoparticles //Bioelectrochemistry. – 2020. – Т. 135. – С. 107576].

Далее в кварцевый стаканчик вместимостью 20 см³ вносили 10 см³ раствора фонового электролита – буферного раствора Бриттона-Робинсона с рН 7,4 и помещали в электрохимическую ячейку вольтамперометрического анализатора (ТА-Lab, OOO "Томьаналит", г. Томск). В раствор фонового электролита опускали индикаторный импрегнированный графитовый электрод, хлоридсеребряный вспомогательный электрод и хлоридсеребряный электрод сравнения.

Затем проводили удаление кислорода, растворенного в растворе фонового электролита. Для этого к вольтамперометрическому анализатору (ТА-Lab, OOO "Томьаналит", г. Томск) подключали баллон с газообразным азотом и силиконовой трубкой для подачи газа, проводили барботирование раствора фонового электролита в течение 5 минут.

После этого проводили электронакопление в течение 10 с при потенциале +0,8 В, перемешивали раствор в течение 10 с, успокаивали раствор в течение 20 с и регистрировали катодную вольтамперограмму в постояннотоковом режиме развертки потенциала в диапазоне от -1,0 до -1,6 В при скорости сканирования потенциала 70 мВ/с. Отсутствие каких-либо пиков на вольтамперограмме свидетельствовало о чистоте раствора фонового электролита. После регистрации вольтамперограммы фона приступали к анализу либо модельных растворов для построения градуировочного графика, либо образцов сыворотки крови для определения содержания в ней преднизона. Удаление кислорода и электронакопление проводили каждый раз при одних и тех же условиях после внесения аликвоты анализируемых образцов в фоновый электролит.

Для определения линейной области зависимости тока пика от концентрации преднизона в раствор фонового электролита последовательно вносили 6 добавок рабочего раствора преднизона (0,0001 моль/дм³) для достижения концентрации в ячейке от 0,2 до 1,2 мкмоль/дм³. После каждой добавки проводили электронакопление, перемешивание и успокоение раствора, затем регистрировали катодные вольтамперограммы в постояннотоковом режиме в диапазоне развертки потенциала от -1,0 до -1,6 В при скорости 70 мВ/с.

Измеряли высоту катодного пика электровосстановления преднизона при потенциале -1,35±0,05 В и строили градуировочный график зависимости высоты катодного пика от концентрации преднизона в электрохимической ячейке (фиг. 2). График имеет линейную зависимость тока пика от концентрации преднизона в диапазоне от 0,2 до 1,2 мкмоль/дм³ с коэффициентом корреляции R²=0,9985. Данный диапазон концентраций определяет рабочую область определения преднизона предложенным способом.

Для определения содержания преднизона в сыворотке крови после получения доказательств отсутствия загрязнителей в фоновом электролите и воспроизводимой фоновой кривой (фиг. 3, кривая 1), количественно дозатором вносили 100 мкл исследуемого образца сыворотки крови, не содержащей преднизон. Проводили удаление кислорода, электронакопление и регистрировали катодную вольтамперограмму в диапазоне потенциалов от -1,0 до -1,6 В при скорости развёртки потенциала 70 мВ/с. При этом при потенциале -1,35±0,05 В не наблюдали изменения электрохимического отклика в связи с отсутствием преднизона в данном образце сыворотки крови (фиг. 3, кривая 2). Далее количественно дозатором вносили 100 мкл исследуемого образца сыворотки крови, содержащей в своем составе преднизон, и после удаления кислорода и электронакопления регистрировали катодную вольтамперограмму, измеряя значение тока электровосстановления преднизона при потенциале -1,35±0,05 В (фиг. 3, кривая 3). Затем последовательно дозатором вносили в электрохимическую ячейку две добавки стандартного раствора преднизона концентрацией 0,0001 моль/дм³ объемом 20 мкл. После внесения каждой добавки проводили удаление кислорода и электронакопление и регистрировали катодные вольтамперограммы, измеряя значение тока электровосстановления преднизона при потенциале -1,35±0,05 В (фиг. 3, кривые 4, 5).

После регистрации всех вольтамперограмм измеряли ток электровосстановления преднизона в сыворотке крови и стандартных образцах. Содержание преднизона рассчитывали по формуле:

где С_ст - концентрация стандартного раствора преднизона в электрохимической ячейке;

I_x – интенсивность тока преднизона в сыворотке крови;

I_ст+x – интенсивность тока преднизона с добавкой стандартного раствора.

Проверку правильности предложенного способа проводили методом введено-найдено, проводя анализ образцов сыворотки крови с известным содержанием преднизона. Были определены концентрации преднизона в сыворотке крови равные 0,41±0,08, 0,58±0,12, 0,83±0,17 мкмоль/дм³, что согласуется с введенным количеством преднизона. В таблице 1 представлены результаты количественного определения преднизона в сыворотке крови методом введено-найдено при n=3, P=0,95, где n – число параллельных определений преднизона; P – доверительная вероятность (вероятность охвата). По значениям среднеквадратичного отклонения S_r можно сделать вывод об удовлетворительных результатах, полученных с помощью предложенного способа.

Изобретение относится к области аналитической химии. Раскрыт вольтамперометрический способ количественного определения гормона преднизона в сыворотке крови, включющий использование трехэлектродной электрохимической ячейки, содержащей в качестве фонового электролита буферный раствор Бриттона-Робинсона, в которую помещают индикаторный, вспомогательный и хлоридсеребряный электрод сравнения, удаляют кислород в растворе фонового электролита, барботируя его газообразным азотом, проводят электронакопление, регистрируют вольтамперограмму фонового электролита, затем последовательно вносят аликвоты сыворотки крови без преднизона, сыворотки крови с преднизоном, стандартные добавки раствора преднизона, проводя после внесения каждой добавки удаление кислорода, предварительное электронакопление и регистрацию вольтамперограмм электровосстановления преднизона относительно хлоридсеребряного электрода сравнения, определение концентрации преднизона по высоте катодного пика методом стандартных добавок, где в качестве индикаторного электрода используют механически очищенный дисковый импрегнированный графитовый электрод, в качестве вспомогательного электрода используют хлоридсеребряный электрод, используют буферный раствор Бриттона-Робинсона с рН 7,4, удаляют кислород из раствора фонового электролита, барботируя его азотом в течение 5 минут, проводят предварительное электронакопление в течение 10 с при потенциале +0,8 В, перемешивают в течение 10 с и успокаивают раствор в течение 20 с, регистрируют катодную вольтамперограмму раствора фонового электролита в диапазоне развертки потенциалов от -1,0 до -1,6 В при скорости 70 мВ/с, после внесения аликвот сыворотки крови без преднизона, сыворотки крови с преднизоном, стандартных добавок раствора преднизона удаление кислорода и электронакопление ведут при тех же вышеуказанных условиях, а регистрацию вольтамперограмм электровосстановления преднизона ведут при потенциале -1,35±0,05 В в режиме постояннотоковой линейной развертки потенциала. Изобретение обеспечивает разработку вольтамперометрического способа количественного определения преднизона в сыворотке крови методом катодной вольтамперометрии. 3 ил., 1 табл., 1 пр.

Вольтамперометрический способ количественного определения гормона преднизона в сыворотке крови, включающий использование трехэлектродной электрохимической ячейки, содержащей в качестве фонового электролита буферный раствор Бриттона-Робинсона, в которую помещают индикаторный, вспомогательный и хлоридсеребряный электрод сравнения, удаляют кислород в растворе фонового электролита, барботируя его газообразным азотом, проводят электронакопление, регистрируют вольтамперограмму фонового электролита, затем последовательно вносят аликвоты сыворотки крови без преднизона, сыворотки крови с преднизоном, стандартные добавки раствора преднизона, проводя после внесения каждой добавки удаление кислорода, предварительное электронакопление и регистрацию вольтамперограмм электровосстановления преднизона относительно хлоридсеребряного электрода сравнения, определение концентрации преднизона по высоте катодного пика методом стандартных добавок, отличающийся тем, что в качестве индикаторного электрода используют механически очищенный дисковый импрегнированный графитовый электрод, в качестве вспомогательного электрода используют хлоридсеребряный электрод, используют буферный раствор Бриттона-Робинсона с рН 7,4, удаляют кислород из раствора фонового электролита, барботируя его азотом в течение 5 минут, проводят предварительное электронакопление в течение 10 с при потенциале +0,8 В, перемешивают в течение 10 с и успокаивают раствор в течение 20 с, регистрируют катодную вольтамперограмму раствора фонового электролита в диапазоне развертки потенциалов от -1,0 до -1,6 В при скорости 70 мВ/с, причем после внесения аликвот сыворотки крови без преднизона, сыворотки крови с преднизоном, стандартных добавок раствора преднизона удаление кислорода и электронакопление ведут при тех же вышеуказанных условиях, а регистрацию вольтамперограмм электровосстановления преднизона ведут при потенциале -1,35±0,05 В в режиме постояннотоковой линейной развертки потенциала.