СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ АЛЛЕРГЕНА ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ПАРААЛЛЕРГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ У КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА НА ППД ТУБЕРКУЛИН ДЛЯ МЛЕКОПИТАЮЩИХ Российский патент 2012 года по МПК A61K39/04 A61K39/35 

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, в частности к способу изготовления аллергена из атипичных микобактерий для диагностики туберкулеза в симультанной пробе с ППД туберкулином для млекопитающих.

Основным и общепринятым способом диагностики туберкулеза крупного рогатого скота является внутрикожная проба с применением ППД туберкулина. Одна из самых важных проблем при этой диагностике - появление неспецифических реакций на туберкулин. Массовые выявления неспецифических реакций на туберкулин приводят к убою большого количества здоровых животных, что увеличивает размеры экономического ущерба и вызывает сомнения в правильности диагностики туберкулеза известным способом.

В связи с широким распространением неспецифических (парааллергических) реакций на туберкулин в разные годы многими авторами были предложены различные методы дифференциации этих реакций.

Многочисленными исследованиями отечественных и зарубежных авторов установлено, что основной причиной проявления неспецифических реакций у крупного рогатого скота на туберкулин является сенсибилизация микобактериями: М. avium, М. paratuberculosis и быстрорастущими атипичными микобактериями, широко распространенными в окружающей среде (3, 4, 5).

В нашей стране для дифференциации неспецифических реакций с 1978 года использовалась симультанная проба с применением ППД туберкулина для млекопитающих и комплексного аллергена из атипичных микобактерий (КАМ), а с 2002 года применяется и симультанная проба с ППД туберкулином для млекопитающих и ППД туберкулином для птиц.

Известен способ изготовления аллергена для дифференциации аллергических реакций на ППД туберкулин для млекопитающих, включающий смешивание белка нокардий 0,54 мг и белка родококков 0,405 мг в ампуле с 10 мл КАМа. При этом 0,2 мл полученного аллергена содержал по 1350 единиц действия каждого из составляющих компонентов. Для приготовления рабочего раствора (10 единиц действия для морской свинки) 1 мл препарата перенесли в пробирку с 9 мл растворителя (физиологический раствор). После перемешивания 2 мл из первой пробирки перенесли во вторую с 11,5 мл растворителя. Таким образом, во второй пробирке получали раствор, содержащий в 0,1 мл 10 ЕД каждого компонента (1).

Известен также способ изготовления комплексного аллергена из атипичных микобактерий (КАМ), включающий выращивание микобактерий М. scrofulaceum №12-С и М. intracellulare №13-Н (3) на жидкой питательной среде при 37-38°С в течение 8 недель, инактивацию культур автоклавированием при температуре 120°С в течение 30 минут, осаждение белка из культурального фильтрата трихлоруксусной кислотой и переосаждением его сернокислым аммонием с последующим диализом через целлофановую оболочку для удаления сульфатов. Содержание единиц действия (ЕД) в 1 мл раствора белка каждого вида этих микобактерий определяют на морских свинках; сенсибилизированных гомологичными микобактериями в сравнении с референтными сериями этих препаратов с известной активностью. Полученные моноаллергены смешивают в равных количествах по содержанию единиц действия (2). Прототип.

Комплексный аллерген (КАМ), в состав которого входят атипичные микобактерии только 2-ой и 3-ей групп по классификации Раньона не обеспечивает полноту дифференциальной диагностики.

Анализ бактериологических исследований, проведенных в ВИЭВ, показал, что микобактерии, выделяемые из патологического материала от реагирующих на ППД туберкулин, а также от убитых с диагностической целью животных из благополучных по туберкулезу хозяйств, в большинстве случаев являются быстрорастущие атипичные микобактерии 4-ой группы классификации по Раньону.

Отчетные данные производственных ветеринарных лабораторий подтверждают эти результаты. Почти на всей территории России в ветеринарных лабораториях выделяют атипичные микобактерии, которые в процентном соотношении распределяются следующим образом: 1-я группа - 2%; 2-я - 19,7%; 3-я - 16,8% и 4-я группа - 59,5%, то есть в состав КАМ не включена наиболее часто выделяемая 4-я группа по Раньону (до 60%) атипичных микобактерий (М. fortuitum, M. smegmatis), которые вызывают сенсибилизацию к туберкулину у морских свинок, крупного рогатого скота, овец, коз и кроликов (3, 4, 5, 6, 7).

В задачу исследований входило - повышение эффективности симультанной пробы с ППД туберкулином для млекопитающих и КАМ, а также уменьшение сроков выращивания атипичных культур.

Этого удалось достичь благодаря тому, что при изготовлении комплексного аллергена из атипичных микобактерий (КАМ) дополнительно добавлено 2 вида микобактерий 4-ой группы по Раньону (М. fortuitum, M. smegmatis), при этом выращивание культур проводят на жидкой питательной среде Сотона в течение 2-3 недель, а не 8 недель.

Способ получения предложенного аллергена заключается в следующем: выращивание культур атипичных микобактерий М. scrofulaceum, M. intracellulare, М. fortuitum и М. smegmatis проводят раздельно на жидкой питательной среде Сотона при температуре 37-38°С в течение 2-3 недель, инактивируют культуры автоклавированием при 120°С в течение 30 минут, осаждают белок из культурального фильтрата каждого штамма в отдельности трихлоруксусной кислотой до конечной 4% концентрации, переосаждают белок сернокислым аммонием при 50%-ном насыщении с последующим диализом раствора белка через целлофановую оболочку против обессоленной воды для удаления сульфатов, определение концентрации белка в растворах каждого вида микобактерий с последующей подтитровкой концентрации на сенсибилизированных различными видами микобактерий морских свинках в пределах 0,45-0,5 мг в 0,1 мл, что соответствует активности 1350 единиц действия (ЕД), далее смешивают растворы белка в равных долях по содержанию ЕД, стерильно фильтруют, расфасовывают и лиофилизируют.

Конкретные примеры отражены в таблицах 1, 2 и 3.

Таблица 1 Результаты испытаний различных моноаллергенов на сенсибилизированных атипичными микобактериями морских свинках (n=25) Аллерген
Кол-во белка в 0,1 мл испыт. раст-ра Интенсивность реакций животных на гомолог, моноаллергены (ср. ⌀ мм) Сенсибилизация M.intracellulare Сенсибилизац.
М. scrofulaceum Сенсибилизаця. M.fortuitum Сенсибилизация М. smegmatis Аллерген intracellulare 19,4±1,37 6,5±1,05 5,1±1,05 4,7±0,63 Аллерген scrofulaceum 6,3±0,54 20,3±2,15 5,8±1,14 7,3±1,4 Аллерген fortuitum 7,6±1,23 5,2±0,96 29,7±2,68 11,7±2,37 Аллерген smegmatis 6,3±0,67 5,8±0,96 12,4±2,3 31,4±3,87 ППД туберкулин для млекопит. 4,1±0,85 3,2±0,54 5,8±1,06 6,2±1,52

Данные табл.1 показывают, что аллергические реакции на моноаллергены (МА) из испытуемого аллергена у сенсибилизированных гомологичными культурами морских свинок больше, чем на МА, входящие в состав производственного КАМ:

на МА из M.fortuitum - на 53,1% больше, чем на МА из M.intracellulare, и на 46,3% больше, чем на МА из М.scrofulaceum;

на МА из M.smegmatis - больше на 62,4 и 54,7% соответственно.

Таблица 2 Результаты испытаний различных аллергенов на сенсибилизированных атипичными микобактериями морских свинках (n=25) Аллерген Интенсивность реакций животных на гомолог, моноаллергены (⌀ мм) Сенсибилизация M.intracellulare Сенсибилизац. M.scrofulaceum Сенсибилизаця. M.fortuitum Сенсибилизация M.smegmatis ППД туберкулин для млекопит.         4,1±0,85 3,2±0,54 5,8±1,06 6,2±1,52         Производственный КАМ 17,6±3,54 15,6±3,85 7,2±4,83 6,3±0,55 Испытуемый аллерген 18,2±2,14 18,9±1,76 20,8±2,88 21,5±2,75

При сравнительных исследованиях испытуемого препарата и производственного КАМ у животных, сенсибилизированных M.fortuitum и M.smegmatis, наблюдали увеличение аллергических реакций в 3 раза. У животных, сенсибилизированных M.intracellulare и M.scrofulaceum, реакции на испытуемый аллерген были выше на 3,4 и 21,2% соответственно.

Таблица 3 Сравнительные испытания аллергена, полученного из 4 видов атипичных микобактерий, и производственного КАМ в симультанной пробе на ППД туберкулин для млекопитающих на крупном рогатом скоте Аллерген Животные, реагирующие на ППД туберкулин для млекопитающих (n=26) Кол-во животных (голов), реагирующих на аллерген Процент реагирующих животных Интенсивннось реакций, толщина кожной складки (мм) Испытуемый аллерген 22 84,6 13,1±1,14 Производственный КАМ 14 53,8 8,3±1,25 ППД туберкулин для млекопитающих 4 11,5 3,2±0,45

При плановом исследовании крупного рогатого скота (457 гол.) благополучного хозяйства по туберкулезу установили, что на ППД туберкулин для млекопитающих реагировало 26 коров.

Через 30 дней при повторном исследовании этих 26 коров в симультанной пробе с ППД туберкулином для млекопитающих, производственным КАМ и испытуемымаллергеном установили, что из 26 животных на производственный КАМ реагировали 14 с увеличением толщины кожной складки до 8,3 мм, на испытуемый аллерген - 22 с увеличением толщины кожной складки до 13,1 мм. При этом на ППД туберкулин для млекопитающих наблюдали реакцию у 3 животных с увеличением толщины кожной складки от 2,8 до 3,0 мм. Из этого можно заключить, что реакции у крупного рогатого скота на ППД туберкулин для млекопитающих были парааллергическими, то есть животные сенсибилизированы атипичными микобактериями.

Предложенный способ апробирован нами с положительным результатом в лабораторных условиях на сенсибилизированных различными микобактериями 50 морских свинках и производственных условиях на крупном рогатом скоте (457 гол.) благополучного по туберкулезу хозяйства, реагирующего на ППД туберкулин для млекопитающих.

Предложенный способ получения комплексного аллергена сократит время выращивания культур с 8 до 2 недель, найдет широкое применение в животноводческих хозяйствах РФ, позволяя повысить качество дифференциальной диагностики на ППД туберкулин для млекопитающих и уменьшить экономический ущерб от вынужденного убоя реагирующих на ППД туберкулин животных.

Источники информации

1. Патент на изобретение №2217165, Российской Федерации, А61К 39/352002. Комплексный аллерген для дифференциации аллергических реакций у крупного рогатого скота на ППД туберкулин для млекопитающих / Нуратинов Р.А. и др., 2002.

2. Дис… док. вет. наук. Аллергическая диагностика туберкулеза у животных: повышение их эффективности / Шаров А.Н, Москва. - 1989. - С.75. (Прототип).

3. Ж. Ветеринария. - 1978 - №4. - С.35-38.

4. Сбор. науч. трудов ВГНКИ. - М., 1985, С.3-9.

5. Дис… док. вет. наук. Туберкулез крупного рогатого скота в республиках Северного Кавказа и Калмыкии (эпизоотология, дианостика и меры борьбы) / Нуратимов Р.А., Москва. - 1998. - С.370.

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии. Способ включает выращивание культур атипичных микобактерий на жидкой питательной среде, инактивацию культур автоклавированием при 120°С в течение 30 минут, осаждение белка из культурального фильтрата каждого штамма в отдельности трихлоруксусной кислотой до конечной 4% концентрации, переосаждение его сернокислым аммонием при 50%-ном насыщении, диализ раствора белка через целлофановую оболочку против обессоленной воды для удаления солей, определение активности раствора белка каждой культуры атипичных микобактерий, смешивание растворов белка в равных долях по содержанию ЕД, стерилизующую фильтрацию раствора, расфасовку и лиофилизацию. При этом в качестве культур атипичных микобактерий используют M. intracellulare, M. scrofulaceum, М. fortuitum и М. smegmatis, а выращивание культур атипичных микобактерий на жидкой питательной среде осуществляют в течение 2-3 недель. Способ позволяет повысить качество дифференциальной диагностики на ППД туберкулин для млекопитающих и уменьшить экономический ущерб от вынужденного убоя реагирующих на ППД туберкулин животных. 3 табл.

Способ изготовления аллергена для дифференциальной диагностики парааллергических реакций у крупного рогатого скота на ППД туберкулин для млекопитающих, включающий выращивание культур атипичных микобактерий на жидкой питательной среде, инактивацию культур автоклавированием при 120°С в течение 30 мин, осаждение белка из культурального фильтрата каждого штамма в отдельности трихлоруксусной кислотой до конечной 4%-ной концентрации, переосаждение его сернокислым аммонием при 50%-ном насыщении, диализ раствора белка через целлофановую оболочку против обессоленной воды для удаления солей, определение активности раствора белка каждой культуры атипичных микобактерий, смешивание растворов белка в равных долях по содержанию ЕД, стерилизующую фильтрацию раствора, расфасовку и лиофилизацию, отличающийся тем, что в качестве культур атипичных микобактерий используют M. intracellulare, M. scrofulaceum, M. fortuitum и М. smegmatis, а выращивание культур атипичных микобактерий на жидкой питательной среде осуществляют в течение 2-3 недель.