СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ МНОГОФУНКЦИОНАЛЬНОГО МУЛЬТИЧИПА, МУЛЬТИЧИП ДЛЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОГО ИЛИ ПАРАЛЛЕЛЬНОГО СКРИНИНГА БИОПОЛИМЕРОВ, СПОСОБ АНАЛИЗА БИОПОЛИМЕРОВ И НАБОР ДЛЯ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ СПОСОБА Российский патент 2008 года по МПК C12Q1/68 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к молекулярной биологии, фармакологии, медицине и охране окружающей среды. В частности, к способу изготовления и применения мультичипа, который позволяет проводить как последовательные, так и параллельные процедуры диагностики, например, на основе белковых или ДНК-овых зондов с применением разных типов меток и способов обработки полученных результатов.

Уровень техники

Известны два подхода к выбору типа биочипов, используемых в молекулярной биологии, фармакологии, медицине и охране окружающей среды. Первый основан на выпуске индивидуальных чипов с высокой плотностью точек - до 10000 на см² [1]. Эти чипы дороги и в основном используются при проведении научных исследований для сканирования библиотек фрагментов ДНК, при разработке лекарственных средств или применяются в больших медицинских центрах. Другой тип чипов проблемно ориентирован на проведение анализов в небольших медицинских центрах или лабораторных условиях, где требуется диагностировать не более 100 фрагментов ДНК или белков на отдельном чипе. Основное требование к таким чипам связано с максимальной простотой получения результата и малой стоимостью анализа.

Известные чипы, изготовленные на основе предметных стекол, несмотря на свое широкое распространение [2, 3] имеют недостатки, связанные с тем, что при подготовке слайда к диагностике требуется выполнить большое число операций по установке и креплению отдельных слайдов в разных устройствах на разных этапах изготовления чипов, к которым можно отнести: модификацию поверхности, очистку поверхности и ее промывку, нанесение олигонуклеотидов, ДНК или белков, проведение гибридизации, установку в сканер для анализа результатов диагностики. Причем из-за неточной установки чипов и смещения чипов относительно друг друга и относительно основания, на которое они устанавливаются, возможны ошибки при нанесении олигонуклеотидов на выбранную зону чипа и ошибки в интерпретации результатов.

Для устранения данных ошибок разработаны способы более точной установки чипов [4], которые усложняют устройство крепления и не позволяют закрепить большое число чипов на рабочей поверхности роботов для нанесения точек. Известны технические решения, которые позволяют учитывать смещение чипов, например, за счет введения большого количества реперных точек на каждом чипе и на общей поверхности мультичипа [5], либо за счет применения сложных устройств, имеющих большие габаритные размеры [6], либо посредством контроля в реальном времени установки каждого отдельного чипа на общей платформе [7], что значительно усложняет структуру роботов.

Наиболее близким к настоящему изобретению относится способ изготовления чипов, в соответствии с которым рабочую поверхность, выполненную в форме прямоугольника [8] или круга [9], разбивают на сектора, в которых размещают рабочие зоны, относящиеся к отдельным чипам. В текстах патентов предусматривается возможность отделения от общего носителя отдельных чипов [10]. Однако в других патентах это техническое решение критикуется, поскольку отделение от несущего элемента мультичипа, выполненного, например, из стекла, связано с большим количеством брака из-за его хрупкости [11]. Кроме того, области, принадлежащие индивидуальным чипам и отделенные от мультичипа, могут не содержать идентификаторов и другой информации, идентифицирующей принадлежность чипа [12]. В этом случае каждую отделенную область мультичипа вклеивают в индивидуальный держатель, что требует дополнительных затрат, которые могут превышать затраты на изготовление отдельных чипов по стандартным процедурам.

Существует много примеров применения идентификаторов для идентификации биочипов. Например, известно изобретение [25], в котором чип имеет два штрих-кода для идентификации двух рабочих зон. Известно изобретение [10], в котором каждая индивидуальная зона с принадлежащей ей кодированной информацией в виде одного идентификатора может быть отделена от мультичипа и использована индивидуально. Известно изобретение [26], в котором рассматриваются вопросы применения идентификаторов совместно с компьютером для контроля качества изготовления чипов.

Известно изобретение [31], в котором рассмотрены варианты изготовления биочипов с большим количеством идентификаторов, выполненных в виде буквенных цифровых или цветовых графических изображений, которые идентифицируют отдельные кластеры или группы кластеров, размещенных на рабочей поверхности биочипа. С этой целью на поверхность биочипа наносится множество буквенно-цифровых кодов или кодов, комбинируемых с цветовыми точками, расположенных рядом с соответствующими кластерами. Такое техническое решение позволяет повысить надежность идентификации множества исследуемых ДНК друг относительно друга, но размещение большого числа идентификаторов на рабочем поле биочипа резко ограничивает полезную рабочую площадь биочипа, на которой могут быть размещены кластеры.

Применение мультичипов, выполненных на основе известных изобретений [10], с размещенными индивидуальными чипами на гладкой ровной поверхности несущего элемента мультичипа может привести к ошибочным результатам диагностики из-за перекрестного загрязнения образцами близлежащих зон отдельных чипов при перетекании гибридизационной смеси с чипа на чип.

Известно, что для устранения проблем кросс-контаминации в поверхности отдельных чипов формируют углубления, в которые наносят гибридизационную смесь, либо приклеивают или механически прикрепляют разделители, выполненные в виде полых цилиндров [13], либо разделяют общую плоскую поверхность основы чипа с помощью прямоугольных решеток [20], либо на твердую или гибкую основу приклеивают чипы, выполненные в виде плоских пластин [28], тем самым создавая пьедестал для сформированных индивидуальных кластеров.

Известен мультичип [30], который устраняет проблемы кросс-контаминации. Мультичип состоит из подставки и нескольких биочипов, представляющих собой последовательно соединенные микрокюветы, в которых иммобилизируются белки. Микрокюветы соединены между собой «мостиками», которые можно переламывать и разделять кюветы. Каждая микрокювета снабжена собственным отдельным пространством для осуществления реакций, то есть использование одной микрокюветы не мешает использованию другой. В подставке, выполненной в качестве независимого узла, выполнены крепежные отверстия, в которые устанавливают последовательно соединенные микрокюветы. На боковой поверхности подставки имеются цифровые и буквенные идентификаторы, с помощью которых определяют местоположение микрокювет с белковыми образцами.

Однако данное техническое решение не предполагает идентификации отдельных микрокювет, относящихся к отдельным чипам, и не предполагает связи между временным положением отдельных чипов и характеристикой данных чипов для задач идентификации. Вместо этого использована простая буквенная и цифровая идентификация положения отдельных микрокювет на время размещения чипов в подставке, что широко известно и используется в конструкции разных типов микроплашек.

Вопросы защиты от кросс-контаминации решаются за счет формирования углублений в микрокюветах. Конструкция мультичипа состоит из раздельных узлов. Такое решение дает возможность введения в процесс диагностики ошибок оператора из-за простоты смены положения микрокювет, не снабженных идентификаторами друг относительно друга на поверхности подставки.

Решение задач идентификации чипов, снижение кросс-контаминации или обеспечение возможности отделения отдельных чипов друг от друга не рассматриваются в совокупности друг с другом и решаются как разные технические задачи.

Задача настоящего изобретения состоит в повышении эффективности диагностики за счет создания новой конструкции мультичипа и создании недорогого способа последовательной или параллельной диагностики на основе мультичипа

Другой задачей настоящего изобретения является создание мультичипа для последовательного или параллельного диагностического скрининга биополимеров с усовершенствованной идентификацией как самого мультичипа, так и индивидуальных чипов, отделяемых от мультичипа, что позволяет идентифицировать индивидуальный чип относительно группы чипов, входящих в состав мультичипа.

Сущность изобретения

Одним из объектов изобретения является мультичип для последовательного или параллельного диагностического скрининга биополимеров, содержащий несущий элемент, на поверхности которого размещен массив, содержащий N индивидуальных чипов, на поверхности каждого из которых размещены кластеры с биологическими зондами и идентификаторы. Мультичип дополнительно содержит общую зону, которая размещена планарно по отношению к массиву из N чипов и расположена по границе массива или в центре массива чипов, причем общая зона выполнена в форме прямоугольника или креста и содержит, по меньшей мере, два технологических отверстия. Соединение между каждым из чипов мультичипа друг с другом и/или соединение чипов с общей зоной выполнено с возможностью разделения, при этом на поверхности индивидуальных чипов размещены первый идентификатор, содержащий первый код, второй идентификатор, содержащий второй код, а на поверхности общей зоны мультичипа размещен третий идентификатор, который имеет третий код или код, идентичный второму коду.

Другим объектом изобретения является способ изготовления мультичипа для последовательного или параллельного скрининга биополимеров, выполненного на основе плоского твердого несущего элемента, на котором размещают N индивидуальных чипов с множеством кластеров, содержащих выбранные типы зондов. Способ характеризуется тем, что на поверхность индивидуальных чипов наносят первый и необязательно второй идентификаторы, характеризующие параметры индивидуального чипа, входящего в мультичип, а на несущем элементе мультичипа дополнительно формируют общую зону, на которой выполняют крепежные отверстия и наносят третий идентификатор, причем первый идентификатор связан с первым кодом, второй идентификатор связан со вторым кодом, отличным от первого кода, третий идентификатор имеет третий код или код, идентичный второму коду, причем указанные коды образуют уникальные N пар кодов, характеризующих многофункциональный чип.

Другим объектом изобретения является способ диагностики биополимеров, включающий обеспечение исследуемых образцов исследуемой ДНК, прямых и обратных праймеров, проведение мультиплексной ПЦР, гибридизации амплифицированных продуктов на поверхности мультичипа, детекции результатов диагностики и идентификацию результатов. В указанном способе используют мультичип, содержащий первый, второй и третий идентификаторы, причем перед проведением этапа идентификации заносят данные диагностики и параметры первого, второго и третьего идентификаторов в базу данных для быстрого поиска и идентификации параметров индивидуальных чипов или групп индивидуальных чипов друг относительно друга.

Идентификацию и интерпретацию результатов диагностики осуществляют с применением программных средств и баз данных путем сравнения данных, полученных при сканировании чипа.

Другим объектом изобретения является набор для идентификации биополимеров на основе ДНК-овых или белковых зондов, включающий: а) биологический мультичип, б) реагенты для подготовки образца и проведения идентификации, причем набор может дополнительно содержать сканер, использующий в качестве возбуждающего источника флуоресценции свет диодных лазеров и укомплектованный ПЗС-камерой или сканер для измерения поглощения света, а также содержать устройство для интерпретации и хранения результатов идентификации на основе компьютера.

Перечень фигур

Фиг.1. Размещение основных элементов мультичипа на поверхности несущего элемента:

а) и б) - распределение зон на несущем элементе мультичипа;

в) вариант мультичипа с комбинацией выемок и сквозных отверстий между чипами с размещением двух идентификаторов;

г) вариант мультичипа с выемками между чипами с размещением одного идентификатора.

Фиг.2. Сечение несущего элемента мультичипа для разных вариантов выемок:

а) треугольная выемка, б) сферическая выемка, в) прямоугольная выемка, г) многоугольная выемка, д) вариант выемки с двух сторон несущего элемента.

Фиг.3. Размещение основных элементов мультичипа на поверхности несущего элемента с формированием общей зоны на несущем элементе:

а) распределение зон на несущем элементе мультичипа;

б) вариант мультичипа с комбинацией выемок и сквозных отверстий между чипами с размещением трех идентификаторов;

в) вариант мультичипа с комбинацией выемок и сквозных отверстий между чипами с размещением двух идентификаторов.

Фиг.4. Размещение основных элементов мультичипа на поверхности несущего элемента с разными вариантами расположения общей зоны мультичипа:

а) боковое, б) центральное, в) крестообразное, г) верхнее размещение общей зоны.

Фиг.5. Изометрическая проекция поперечного разреза ванны для модификации поверхностей нескольких несущих элементов, выполненных в прямоугольной форме, с размещением общей зоны крепления с верхней стороны мультичипа.

Фиг.6. Вид сборки двух вариантов индивидуальных биочипов и рамки для установки в сканер.

Фиг.7. Блок-схема системы для сбора, обработки и передачи информации о данных, считанных с мультичипов на индивидуальные компьютеры пользователей.

Фиг.8. Изображение точек при детекции флуоресцентно меченных зондов.

Фиг.9. Изображение точек при детекции хромогенных зондов.

Фиг.10. Изображение медицинского чипа.

Перечень сокращений.

1. ПММА - полиметилметакрилат.

2. ПВХ - поливинилхлорид.

3. EDC - гидрохлорид диметиламинопропилэтилкарбодиимида.

4. FAM - 6-карбоксифлуоресцеин.

5. APTES - 3-аминопропилтриэтоксисилан.

6. Позиции 100 - относятся к конструктивным элементам мультичипа.

7. Позиции 200 - относятся к системе для анализа результатов диагностики.

Описание изобретения

К одному из объектов настоящего изобретения относится мультичип для последовательной или параллельной диагностики биополимеров, к группе которых можно отнести ДНК, пептиды антитела и другие биологически активные вещества. Такие анализы проводятся в медицине, ветеринарии, при производстве продуктов питания, при контроле параметров окружающей среды и в криминалистике.

Основным аспектом данного изобретения является повышение достоверности полученных результатов анализа за счет разработки новой конструкции мультичипа,

Было обнаружено, что решение поставленных технических задач возможно с помощью новой конструкции мультичипа, в которой реализовано техническое решение, связанное с совершенствованием идентификации биочипов и снижением кросс-контаминации, влияющих на повышение достоверности полученных результатов анализа.

В отличие от известных решений, которые для повышения достоверности полученных результатов обеспечивали либо более совершенную идентификацию отдельных чипов [31], или обеспечивали снижение уровня кросс-контаминации между отдельными кластерами, размещенными на поверхности биочипа [30], предлагаемое техническое решение позволяет выполнить поставленные задачи на основе общего технического решения.

Было обнаружено, что введение в структуру мультичипа общей зоны, сопряженной с частью внешней границы, по меньшей мере, одного чипа, входящего в состав мультичипа, с возможностью легкого отсоединения общей зоны от индивидуальных биочипов позволяет реализовать поставленные технические задачи, обеспечивая синергетический вклад, обеспечиваемый возможностями общей зоны содержать третий идентификатор, общий для всех индивидуальных биочипов, и выемками и/или выемками в комбинации со сквозными отверстиями, с помощью которых крепятся индивидуальные чипы друг с другом и/или с общей зоной, и обеспечивается снижение кросс-контаминации за счет стекания излишков гибридизационной смеси в выемки или отверстия.

Под общей зоной понимается часть общей планарной поверхности мультичипа, на основной части которой размещены N индивидуальных чипов. Включение общей зоны в состав мультичипа позволяет разместить на ней дополнительные элементы конструкции, такие как идентификатор и отверстия для крепления мультичипа в процессе его изготовления, либо крепления в процессе диагностики. Кроме того, отделенный от чипов элемент, содержащий общую зону с расположенными на ее поверхности третьим идентификатором, и, по меньшей мере, одним отверстием, может выполнять дополнительную функцию идентификации объектов диагностики. К таким объектам можно отнести объекты хранения исследуемых образцов, например коробки, к которым крепится элемент с идентификатором. Элемент с третьим идентификатором может быть размещен рядом с диагностируемым больным и закреплен, например, на кровати рядом с информацией о больном или размещен в карте больного для быстрого поиска в базах данных информации о проведенных ранее диагностиках.

Другой проблемой, решаемой настоящим изобретением, связанной с повышением достоверности полученных результатов, является снижение или устранение перекрестного загрязнения при гибридизации. В предлагаемом изобретении проблема кросс-контаминации решается одновременно с формированием возможности отсоединения общей зоны от массива чипов и/или отсоединения чипов друг от друга.

Возможность отсоединения общей зоны от индивидуальных биочипов или отсоединения чипов друг от друга осуществляют за счет формирования на лицевой планарной поверхности мультичипа выемок или комбинации выемок и сквозных отверстий, выполненных в виде перфораций, прорезей, промежутков или интервалов между боковыми границами чипов. В этом случае излишки гибридизационной смеси будут стекать в выемки и/или сквозные отверстия.

Формирование планарной поверхности, на которой размещена общая зона и массив чипов, которые выполнены с возможностью отсоединения друг от друга за счет выемок или выемок и сквозных отверстий, осуществляют за счет стандартных и простых процедур, которые выбирают из группы, включающей, но не ограничивающей штамповку, термоформовку, отливку, механическую обработку, лазерную резку или комбинацию этих способов обработки.

Таким образом, введение общей зоны в мультичип позволяет повысить достоверность результатов диагностики за счет формирования двух- или трехуровневой идентификации данных.

При этом на каждом из индивидуальных чипов размещают, по крайней мере, один первый идентификатор, относящийся к идентификации данных об объекте исследования и, необязательно, второй идентификатор, на котором размещены данные производителя о дате изготовления, типе и параметрах зондов. В общей зоне крепления всех чипов мультичип дополнительно содержит третий идентификатор, который имеет третий код или код, идентичный второму коду.

Первый идентификатор связан с первым кодом, второй идентификатор связан со вторым кодом, отличным от первого кода. Указанные коды образуют уникальные N пар кодов, характеризующих многофункциональный чип. Идентификатор может быть выполнен в виде цифровых и/или буквенных обозначений, которые выполняют функцию кода, или в виде штрих-кодов или их комбинаций.

В качестве примера, включающего, но не ограничивающего объема данного изобретения, ниже приведены параметры, которые могут быть введены в параметры первого идентификатора при определении или диагностики заболеваний млекопитающих.

Первый идентификатор отдельного чипа может включать в себя следующие данные, входящие в группу, состоящую из: а) кода болезни, б) кода, характеризующего объект, из которого взята проба (кровь, лимфа, соскоб, слюна и т.д.), в) кода пациента или кода данных, идентифицирующий пациента (ФИО, возраст), г) кода медицинского учреждения и/или страховой компании, д) дату диагностики.

В свою очередь параметры второго и третьего идентификатора, идентифицирующие мультичип, могут содержать: а) код номера партии и/или даты изготовления, б) код фирмы изготовителя, в) код, идентифицирующий способ модификации поверхности, г) код типа скрининга (последовательный, параллельный), д) код количества индивидуальных чипов, е) код количества кластеров.

Такая информация может быть полезна для выяснения качественных характеристик не только мультичипа, но и его составных компонентов. Причем сочетание первого и второго кода или первого, второго и третьего кода должна обеспечить уникальный код, соответствующий только одному мультичипу. Обращение к такому уникальному коду обеспечит быстрый поиск информации в базах данных о всех образцах при параллельном скрининге либо к информации о последовательных измерениях.

При отливке или штамповке несущего элемента мультичипа возможно формировать дополнительные углубления глубиной от 0,1 до 4,5 мм (в зависимости от толщины чипа), что позволяет свободно отделять от мультичипа отдельные чипы или группу чипов для проведения сканирования в выбранном сканере либо сканировать мультичип целиком на планшетном сканере с одновременным считыванием данных всех идентификаторов.

На фиг.1 показаны варианты размещения основных элементов мультичипа на поверхности несущего элемента без участка со сформированной общей зоной. На фиг.1(а) и фиг.1(б) приведено распределение зон на несущем элементе мультичипа для разных вариантов. В общем случае мультичип содержит несущий элемент 100, на поверхности которого размещают N чипов в секторах 102, количество N индивидуальных чипов в мультичипе выбирают не менее 2. На поверхности каждого сектора 102, принадлежащего индивидуальному чипу, формируют группу зон: а) рабочую зону чипа для нанесения зондов 103, б) зону для нанесения первого идентификатора 104 и необязательно второго идентификатора 105. Причем рабочая зона индивидуального чипа состоит из группы кластеров 106, каждый из которых формируется своим зондом. В группу типов зондов, которые выбирают для размещения на рабочей поверхности чипа, кроме зондов, относящихся к диагностике проб, входит группа зондов, относящихся к положительным или отрицательным контролям, а также группа зондов, выполненных в форме меток, например меток, идентифицирующих положение чипа. Дополнительно каждый сектор контактирует с зоной 107, контактируемой с границами, по крайней мере, двух индивидуальных чипов прилегающих к внешнему контуру каждого сектора. В зоне 107 выполняют выемки 108 и/или сквозные отверстия между чипами 109. На фиг.1(в) приведен вариант мультичипа с комбинацией выемок и сквозных отверстий между чипами с размещением двух идентификаторов. На фиг.1(г) приведен вариант мультичипа с одним идентификатором. Выемки и/или сквозные отверстия между чипами упрощают отделение индивидуальных чипов 110 от несущего элемента 100 или друг относительно друга. Если используют комбинацию выемок и сквозных отверстий в зоне 107, то соотношение между длинами выемок и сквозных отверстий между чипами выбирают в пределах от 1:10 до 10:1. Отношение ширины выемки к ширине сквозного отверстия можно выбирать в пределах от 1:10 до 10:1. Ширину выемки выбирают в пределах от 0,1 мм до 5 мм.

Возможность простого отделения индивидуальных чипов от мультичипа позволяет проведение последовательных скринингов с использованием одного мультичипа, в котором все индивидуальные чипы выполнены при одинаковых условиях, что позволяет сравнивать отдельные чипы в процессе проведения последовательных диагностик, например, при лечении пациента. На фиг.1(а) приведен вариант мультичипа с формированием на поверхности мультичипа одних выемок без сквозных отверстий между чипами и с размещением двух идентификаторов. Такое решение предпочтительно при проведении массовых скринингов, когда все чипы мультичипа должны проходить параллельную обработку и после проведения диагностики могут быть одновременно отделены от мультичипа. На фиг.2 приведены примеры форм сечений несущего элемента мультичипа для разных вариантов выемок: а) треугольная выемка 120, б) сферическая выемка 121, в) прямоугольная выемка 122, г) многоугольная выемка 123, д) вариант выемки с двух сторон несущего элемента 124. Причем выемки, предпочтительно при штамповке или отливке, могут быть организованы как с одной, так и с двух сторон мультичипа. Толщину несущего элемента выбирают от 0,5 до 5 мм. При этом отношение толщины слоя несущего элемента к глубине выемки мультичипа выбирается исходя из механических и физических параметров выбранного материала (твердость, хрупкость) для мультичипа и может составлять отношение от 2:1 до 100:1.

На фиг.3 показаны варианты размещения основных элементов мультичипа на поверхности несущего элемента, на котором формируется общая зона 111. Общая зона 111 несущего элемента мультичипа 100 может быть расположена по границе или в центре массива чипов. Она может представлять форму прямоугольника или иметь, например, крестообразную форму. Общая зона выполняет две функции. Первая связана с ее использованием для формирования на ней установочных и крепежных отверстий 112, которые способствуют креплению заготовок мультичипов при модификации поверхности, многочисленных промывках и очистках поверхности перед нанесением зондов. Второй функцией общей зоны является размещение на ее поверхности третьего идентификатора 113, на котором может быть размещена информация, полезная для последующего анализа данных диагностики при проведении параллельного или последовательного скрининга биополимеров. На фиг.3(а) приведено распределение зон на несущем элементе мультичипа. В общем случае мультичип содержит несущий элемент 100, на поверхности которого размещают N чипов, размещенных в секторах 102, на поверхности каждого сектора формируют группу зон: а) рабочую зону чипа для нанесения зондов 103, б) зону для нанесения первого идентификатора 104 и необязательно второго идентификатора 105. Причем рабочая зона индивидуального чипа состоит из группы кластеров 106, каждый из которых формируется своим зондом. В группу зондов, размещаемых на поверхности рабочей зоны, кроме зондов относящихся к диагностике проб, входит группа зондов, относящихся к положительным или отрицательным контролям, а также группа зондов, выполненных в форме меток, например меток, идентифицирующих положение чипа. Каждый сектор 102 контактирует с зоной 107, контактируемой с границами по крайней мере двух индивидуальных чипов прилегающих к внешнему контуру каждого сектора и границей общей зоны мультичипа. В зоне 107 выполняют выемки 108 и/или сквозные отверстия между чипами 109. На фиг.3(б) приведен вариант мультичипа с комбинацией выемок и сквозных отверстий между чипами с размещением трех идентификаторов. Выемки и/или сквозные отверстия между чипами обеспечивают отделение чипов 110 от несущего элемента 100 или друг относительно друга. На фиг.3(б) приведен вариант мультичипа с выемками между чипами и с размещением двух идентификаторов.

На фиг.4 приведены варианты размещения общей зоны чипа 111 на поверхности мультичипа. На фиг.4(а) приведен вариант бокового размещения общей зоны. На фиг.4(б) приведен вариант центрального размещения зоны. На фиг.4(в) приведена крестообразная форма общей зоны. На фиг.4(г) приведено расположение общей зоны в верхней части мультичипа.

Приведенные примеры включают, но не ограничивают других вариантов размещения индивидуальных чипов и общей зоны друг относительно друга. В общей зоне размещают отверстия 112, с помощью которых несколько заготовок мультичипов могут быть закреплены перед установкой в устройства, в которых происходит один из этапов подготовки поверхности, например этап модификации поверхности или этап нанесения ДНК-овых или белковых зондов.

В качестве примера, который включает, но не ограничивает других вариантов, на фиг.5 приведена изометрическая проекция поперечного разреза ванны 114 для модификации или для проведения промывок поверхностей множества мультичипов, выполненных в прямоугольной форме, с размещением зоны крепления с верхней стороны мультичипа.

При использовании лазерной или механической обработки для формирования выемок и/или сквозных отверстий между чипами предпочтительно одновременно наносить выемки или сквозные отверстия между чипами на поверхности нескольких неразделенных несущих элементов. Для этого от листа пластика отрезают прямоугольную заготовку, на которой можно разместить несколько мультичипов. После формирования сквозных отверстий между чипами и/или выемок мультичипы отделяют друг от друга.

Наиболее предпочтительна штамповка, термоштамповка или отливка с помощью матриц, в процессе которых сквозные отверстия между чипами и/или выемки формируются одновременно с формированием поверхности несущего элемента с зонами для индивидуальных чипов.

Форма мультичипа

Известно выполнение мультичипа в форме прямоугольных платформ [13], прямоугольных листов [10] или в форме плоского диска [9]. Предпочтительной формой мультичипа является плоский лист разной толщины. В рамках настоящего изобретения форму мультичипа выбирают на основании предварительной информации о типе материала для мультичипа, о предполагаемом способе модификации поверхности, информации о предполагаемом способе обработки данных анализа и выборе оборудования для съема и обработки информации. Удовлетворяющая форма мультичипа может представлять собой прямоугольник, квадрат, диск, многоугольник. Толщина несущего элемента может составлять от 0,5 до 5 мм.

В варианте, когда форма мультичипа представляет собой форму прямоугольника, предпочтительно, чтобы соотношения между шириной и длиной мультичипа лежали в пределах от 1:1 до 1:50. В некоторых вариантах предпочтительно выбирать размеры мультичипа в пределах размеров стандартных листов бумаги, например, размер А4, на которые рассчитаны сканеры. Учитывая высокие характеристики разрешения современных сканеров и совершенство способов нанесения зондов на поверхность чипов, более предпочтительно использовать не только стандартные размеры индивидуальных чипов 25 мм×75 мм, но и другие размеры. Например, для сокращения расходов на подготовку индивидуальных чипов в составе мультичипа возможно использовать чипы, габариты которых составляют значение 12,5 мм×75 мм, либо мини-чипы размером 25 мм×37,5 м либо 12,5 мм×37,5 мм. На фиг.6 приведены варианты размещения индивидуальных чипов в стандартных рамках (15) для последующего сканирования. Фиг.6(а) показывает размещение чипа с шириной 25 мм, а фиг.6(б) показывает размещение чипа с шириной 12,5 мм.

Материал несущего элемента

Материал несущего элемента должен обеспечивать несколько функций, способствующих проведению достоверных анализов. Материал должен обеспечивать достаточную стабильность формы в период проведения подготовки поверхности, например ее модификации с целью более эффективной иммобилизации зондов к поверхности чипа. Материал должен выдерживать обработку его поверхности водными и другими растворами. Выбор материала зависит от способа детектирования и регистрации сигнала. При выборе способа детектирования сигнала по уровню флуоресценции необходимо учитывать свойства собственной флуоресценции некоторых материалов и необходимость компенсирования фонового сигнала и повышения отношения сигнала к шуму.

Известно [10], что в качестве основы для создания мультичипов можно использовать нитроцеллюлозу, стекло, силиконы, пластики, тефлоны, металлы и их комбинации. Однако, как уже указывалось, не все материалы, перечисленные в группе, обладают способностью ковалентно иммобилизовать зонды, представляющие собой модифицированные или немодифицированные олигонуклеотидов. В качестве материала несущего элемента для создания мультичипа предлагается использовать полимеры, стекло, керамику или их композиции.

Для такого материала, как стекло, разработано большое число способов модификации поверхности для последующей иммобилизации зондов. Однако массовое применение стеклянных мультичипов ограничивается хрупкостью этого материала, достаточно большим весом и необходимостью выполнения шагов по защите чипов при транспортировке. Выполнение двухсторонних выемок или выемок и сквозных отверстий между чипами дает возможность отделения стеклянных слайдов друг от друга без нарушения основы чипа.

Полимеры не обладают хрупкостью и могут быть изготовлены с помощью разных технологий, включающих, но не ограничивающих способы штамповки, отливки, механическую обработку. Группа используемых полимеров включает, но не ограничивает полиметилметакрилат, полибутилметакрилат, поливинилхлорид, поликарбонат, сополимеры метилметакрилата и/или сополимеров бутилметакрилата с другими мономерами, такими как стирол, акрилонитрил и др. Более предпочтительно использовать полиметилметакрилат, который имеет меньший уровень автофлуоресценции, прозрачен и может составлять основу композитных несущих поверхностей. Поливинилхлорид позволяет эффективно проводить модификацию поверхности и являться основой для изготовления индивидуальных чипов и мультичипов.

Способы модификации поверхности несущего элемента мультичипа

Известны патенты, в которых приведены способы модификации поверхности стекла, полимеров, металлов. Наиболее часто для модификации поверхности используют разнообразные кремнийорганические соединения, в том числе производные триалкоксисиланов.

В некоторых случаях покрытие стеклянной подложки осуществляют APTES в газовой фазе [14, 15]. Следует отметить, что в случае применения для покрытия стекла производных алкоксисиланов происходит их ковалентная пришивка за счет образования силоксановых мостиков. Известна модификация поверхности полимеров действием различных триалкоксисиланов или их производных [16], например способ модификации поверхности полимеров действием золь-геля, получаемого при гидролизе несущего нужную функциональную группу триалкоксисилана совместно с тетраалкоксисиланом [17]. Известен способ модификации сложноэфирных групп на поверхности полимеров, который заключается в их аминолизе под действием полиаминов [18, 19]. На полученной таким образом аминированной поверхности проводят иммобилизацию зонда в присутствии конденсирующего агента и/или гетеробифункционального кросс-линкера. В качестве примера, включающего, но не ограничивающего рамки данного изобретения, рассматривается применение методов модификации стеклянных подложек с применением функциональных кремнийорганичесих соединений. На стадии модификации на стеклянную подложку действуют раствором соединения формулы Y-X-Si(OR)₃, где Х - алкильный, арильный или алкиларильный мостик, R - алкил или арил, Y - требуемая функциональная группа, в подходящем растворителе. В качестве модифицирующих агентов могут применяться триалкоксисиланы, содержащие функциональную группу, необходимую для дальнейшей иммобилизации биомолекул, например эпокси-, меркапто-, амино-, акрилоил- и др. Подходящими модифицирующими агентами могут быть:

3-(глицидилокси)пропилтриэтоксисилан, 3-(глицидилокси)пропилтриметоксисилан, 3-меркаптопропилтриэтоксисилан, 3-меркаптопропилтриметоксисилан, 3-аминопропилтриэтоксисилан, 3-аминопропилтриметоксисилан, 3-(акрилоилокси)пропилтриэтоксисилан, 3-(акрилоилокси)пропилтриметоксисилан. В качестве растворителя можно использовать этанол, метанол, пропанол, воду или их смеси.

В ходе процесса вода вызывает гидролиз алкоксигрупп, находящихся в растворе и на поверхности подложки, которые затем подвергаются самопроизвольной поликонденсации. В результате с поверхностью подложки силоксановыми мостиками оказываются связанными большое число молекул алкоксисилана, несущие требуемые функциональные группы. Концентрация модифицирующего агента может варьировать в пределах от 0,1 до 20% по объему. Температуру проведения модификации выбирают в пределах от 15 до 30°С. Предпочтительно использовать комнатную температуру. Длительность стадии модификации выбирают от 30 мин до 2 часов, предпочтительно 1 час.

Для ковалентной модификации полимерных подложек, включающих электрофильные фрагменты (сложноэфирные группы, галогеналкановые фрагменты и др.), необходимо использовать только соединения указанной формулы с Y=NH₂. При этом модифицирующий агент следует использовать в гидролизованной форме. В результате модификации на поверхности полимера формируются аминогруппы. Температура проведения модификации выбирают в пределах от 15 до 80°С. Длительность стадии модификации выбирают от 10 мин до 12 часов, предпочтительно от 20 до 120 минут.

В качестве зонда используют дифференцирующие олигонуклеотиды, модифицированные по 5' или 3'-концу функциональной группой, входящей в набор, состоящий из фосфато-, карбокси-, амино-, гидрокси-, тио-, гидразо-, гидразино-, аминоокси- и др. Во многих случаях для иммобилизации олигонуклеотидов возможно применение конденсирующих агентов, входящих в группу, состоящую из: гидрохлорида диметиламинопропилэтилкарбодиимида, карбонилдиимидазола, мезитиленсульфонилтетразола, мезитиленсульфонилнитротриазола, триизопропилфенилтетразола, триизопропилфенилнитротриазола, в концентрации от 0,1 до 100 мМ. Также возможно использование бифункциональных кросс-линкеров, входящих в группу, состоящую из дитиобис(сукцинимидилпропионата), дисукцинимидилсуберата, дисукцинимидилтартрата, бис [(2-(сукцинимидооксикарбонилокси)этил]сульфоната, этиленгликольбис(сукцинимидилсукцината), дисукцинимидилглутарата, дисукцинимидилкарбоната, гидрохлорида диметиладипимидата, гидрохлорида диметилпимелимидата, диметил-3,3'-дитиобис(пропионимидата), 1,4-бис[3'-(2'-пиридилдитио)-пропионамидо]бутана, бисмалеимидогексана, гидрохлорида гидразида 4-(4-N-малеимидо-фенил)-бутановой кислоты, 1,5-дифтор-2,4 динитробензола, диглицидилового эфира 1,4-бутандиола, карбогидразида, дигидразида адипиновой кислоты, N-сукцинимидил-3- (2-пиридилдитио)-пропионата, сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)-циклогексан-1-карбоксилата, N-м-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимида, дигидрохлорида диметилсуберимидата, сукцинимидил-(4-иодоацетил)-аминобензоата, сукцинимидил-4-(п-малеимидофенил)-бутирата, сукцинимидил-6-[(иодоацетил)амино]-гексаноата, сукцинимидил-4-[(иодоацетиламино)-метил]-циклогексан-1-карбоксилата, п-нитрофенилиодоацетата.

В примере 1 приведен пример модификации поверхности ПММА с использованием гидролизованного 3-аминопропилтриэтоксисилана. Приведенные в примерах 1-5 способы модификации разработаны на основе исследований и имеют изобретательский уровень. На стадии модификации поверхности несущего элемента возможно проведение модификации а) на всей поверхности несущего элемента мультичипа, б) в рабочих зонах индивидуальных чипов, например, сформированных в виде углублений.

Данные о параметрах модификации поверхности могут быть занесены в шифр идентификатора, например, в виде штрих-кода. Эта информация может позволить осуществить автоматический выбор алгоритма учета фона при считывании и обработки полученных данных.

Способ изготовления мультичипа

Другим объектом настоящего изобретения является способ изготовления несущего элемента многофункционального мультичипа. В общем случае способ изготовления многофункционального мультичипа (в частности, для получения отдельных пользовательских чипов) состоит из ряда стадий, в соответствии с которыми: а) выбирают материал несущего элемента и способ модификации его поверхности, б) выбирают форму и способ подготовки заготовки несущего элемента, в) выбирают дизайн мультичипа, в котором определяют расположение секторов для формирования N чипов, зоны для формирования выемок или сквозных отверстий между чипами, г) изготавливают несущий элемент, формируя выемки и/или сквозные отверстия между чипами и необязательно углубления для гибридизации, и проводят модификацию всей поверхности или ее рабочей части, д) выбирают химическую структуру зондов, входящих в отдельные чипы, и способ иммобилизации (применение кросс-линкера и т.д.), е) выбирают форму расположения капель с зондами внутри кластеров, в которых расположены группы одинаковых зондов, ж) выбирают структуры и форму размещения капель с метками, выполняющими вспомогательные функции, например фиксирующие габаритные размеры рабочей зоны чипа, з) формируют и наносят на поверхность чипов наклейки с идентификаторами, и) наносят зонды и капли с дополнительными метками на поверхность рабочей зоны чипов, к) высушивают и хранят мультичип до его применения.

Способы нанесения точек (печать) кластеров

Известны способы нанесения зондов олигонуклеотидов [21] и пептидов [22] на модифицированную и немодифицированную [23, 24] поверхность индивидуальных чипов.

Нанесение растворов, в которые входят индивидуальные зонды в виде олигонуклеотидов, ДНК или белков, осуществляют с помощью известных роботов, например, фирмы Affymetrix. Дифференцирующие олигонуклеотиды наносят в виде одной точки или в виде кластеров. Количество кластеров, размещенных в рабочей зоне каждого индивидуального чипа, может составлять от 1 до 1000. Для диагностики в области медицины предпочтительно использовать от 5 до 100 кластеров. Наиболее предпочтительно использовать от 5 до 20 кластеров. На фиг.10 приведен пример расположения 15 кластеров в рабочей зоне индивидуального чипа для диагностики урогенитальных патогенов. Данный пример включает, но не ограничивает других схем расположения кластеров на поверхности индивидуальных чипов. Размещение кластеров на поверхности зоны индивидуального чипа осуществляют с учетом задач диагностики и/или возможностей программного обеспечения по обработке данных. В каждом кластере размещают не менее 2 точек, формируемых растворами дифференцирующих олигонуклеотидов - зондов. Количество нанесенных зондов одного типа дифференцирующего олигонуклеотида на поверхности каждого кластера составляет от 1 до 50. Для медицинских приложений предпочтительно размещать в каждом кластере от 4 до 9 зондов одного типа дифференцирующего олигонуклеотида.

В кластере точки наносят в виде серии точек, образующих прямоугольные, квадратные (см. фиг.10), треугольные, эллипсоидные формы или формы в виде серии кругов, концентрических форм, многоугольников. Кластеры могут, в свою очередь, организовывать на поверхности рабочей зоны чипа последовательность линейных структур, прямоугольных, квадратных, круглых или иных форм, которые, с одной стороны, оптимальны для обработки данных, с другой стороны, привносят индивидуальность чипов. Кроме того, на рабочей зоне чипа могут быть размещены точки, характеризующие параметры качества и контроля проведения диагностики, например, нанесены положительные или отрицательные пробы или нанесены точки, характеризующие позицию зоны относительно общей поверхности индивидуального чипа. Соотношение между количеством кластеров, в которых размещают зонды, и кластеров, в которых размещают положительные или отрицательные контроли, выбирают в диапазоне от 1:1 до 500:1 Объем капли наносимого зонда с дифференцирующим олигонуклеотидом может лежать в диапазоне от 0,005 до 0,05 мкл, предпочтительно 0,02 мкл. Объем вспомогательных капель, например, для формирования реперных точек, по которым определяют, например, границы рабочей зоны чипа, может составлять от 0,05 до 0,5 мкл.

Формат мультичипа

Формат чипа зависит от задач, для которых мультичипы используют в исследовательской, лабораторной практике или в медицинских учреждениях. В известных мультичипах количество зондов и сформированных на их основе кластеров, образующих рабочую зону чипа, а также количество рабочих зон, размещенных на поверхности чипа, колеблется в значительных пределах. Например, известно изобретение с двумя зонами [25], где каждая зона имеет 100 кластеров. Известен мультичип, формируемый на основе плашки, имеющей 96 рабочих зон [13]. Мультичип может разместить на поверхности до 4800000 зондов и может быть ориентирован на применение в научных исследованиях или для больших специализированных учреждений, где требуется массовый скрининг. Известно изобретение [10], в котором количество зон выбирается от 2 и более с плотностью до 10000 зондов на квадратный сантиметр. Как уже указывалось ранее, в [10] не описаны способы отделения индивидуальных чипов от мультичипа, что проблематично во многих случаях, например при использовании в качестве основы для мультичипа хрупкого стекла.

Существенным отличием формата мультичипа, предлагаемого в данном изобретении, от известных аналогов является то, что мультичип позволяет обеспечить отделение от несущей основы как индивидуальные чипы, так и группы чипов, закрепленные друг относительно друга или закрепленные на части общей зоны мультичипа. Такие мини-мультичипы, содержащие от 2 до 10 чипов, полезны для проведения последовательных скринингов, например, при диагностике состояния больного и подтверждения выбора терапевтических средств. При проведении последовательного скрининга проб от группы индивидуальных чипов в процессе диагностирования последовательно отделяют, по крайней мере, один индивидуальный чип, который используют для гибридизации с продуктами ПЦР в индивидуальных камерах.

Способ проведения анализа

Из множества способов диагностики с использованием биочипов можно выделить два основных направления. Первое относится к параллельной диагностике множества образцов в течение одного параллельного скрининга. Пример такого способа измерений с помощью мультичипа описан в изобретении [13]. Достаточно часто встречается необходимость последовательных скринингов образцов, полученных от одного объекта в период некоторого времени, например, при исследовании крови пациента до лечения, во время и после лечения. С этой целью в настоящее время используют индивидуальные чипы, например, на основе стеклянных слайдов. Применение индивидуальных чипов может привести к введению систематических ошибок при измерениях. Это связано с тем, что при изготовлении чипов и последующем их хранении возможно смешение нескольких партий чипов, изготовленных в разное время в разных условиях и с использованием различных методов. Поскольку каждая партия чипов выполняется с разбросом условий, например, при проведении модификации, это автоматически приводит к систематическим ошибкам в интерпретации данных из-за разной плотности нанесенных аминогрупп.

В данном изобретении изготовление мультичипа происходит в одних и тех же условиях, это позволяет получить одинаковые индивидуальные чипы, сделанные из одного материала, с применением одной процедуры модификации поверхности, с одинаковыми концентрациями зондов и активностями реагентов. Применение разделяемых мультичипов позволяет использовать принцип дифференциального метода анализа при проведении последовательных измерений проб, взятых от одного и того же объекта. В процессе измерений данные параметров анализа первого чипа можно использовать в качестве опорных для сравнения с другими параметрами, полученными в процессе последовательного измерения других образцов. С этой целью применяют индивидуальные чипы, взятые от одного и того же мультичипа, от которого был отделен первый чип. В качестве опорных данных используют, например, данные об интенсивности сигналов стандартных меток, которые нанесены на все чипы в одинаковых условиях при одинаковой концентрации реагентов. Данный способ позволяет исключить ошибки, связанные с процессом изготовления и хранения чипов.

Для детектирования индивидуальных чипов или мультичипов можно использовать флуоресценцию, колориметрические системы измерения, пропускание, отражение или измерение радиоактивности.

Аппаратные и программные средства идентификации данных диагностики

Для реализации возможностей мультичипа по проведению параллельных и последовательных скринингов биологических объектов необходим комплекс аппаратных и программных средств для обработки полученных данных, их идентификации и занесения в базу данных.

На фиг.7 показана блок-схема установки для проведения параллельных и последовательных скринингов биологических объектов. В состав блок-схемы входят: компьютер 201, к которому могут быть подключены устройства, входящие в группу, состоящую из дисплея 202, принтера 203, и устройства для сканирования мультичипов или индивидуальных чипов. Устройства сканирования могут быть выбраны из группы, состоящей из: планшетного сканера 210, цифровой ПЗС-камеры 211, сканера 212, индивидуальных чипов 110, сканера 213 мультичипа, размещенного на диске 140, ручного сканера 214. Данные, полученные посредством сканирования с прямоугольных 130 или дисковых 140 мультичипов, а также с индивидуальных чипов 110, обрабатываются в компьютере 201. Обработанные данные выдаются либо в форме, записанной на твердых носителях, например, на CD диске 204, либо посредством связи через Интернет или по локальной сети на компьютер 205, на основе которого формируется база данных множества диагностик, которые хранятся, например, на жестких дисках 206. Этой информацией с помощью локальной сети или через Интернет могут пользоваться несколько пользователей с помощью своих компьютеров 207, например карманных.

Предпочтительно использовать для съема данных диагностики сканирующие устройства, которые могут реализовать, по крайней мере, один из трех известных способов: измерение пропускания, измерение отражения, измерение флуоресценции. Детекция флуоресцентного сигнала производится с использованием, например, экспериментальной установки, состоящей из флуоресцентного микроскопа, ПЗС-камеры и компьютера, либо темнопольной установки с подключенной ПЗС-камерой [27], в которой используется возбуждающий свет лазерных светодиодов. Колориметрическая детекция, например, биотинилированной ДНК, осуществляется с использованием сканирующих устройств, например экспериментальной установки, состоящей из сканера и компьютера, и специального программного обеспечения.

Предпочтительно, чтобы комплекс аппаратных средств содержал устройства, входящие в группу, состоящую из: ручных сканеров штрих-кода и изображений, автоматических сканеров планшетного типа, сканеров, обеспечивающих съем информации с отдельных индивидуальных чипов и других сканеров. Сканер преобразует изображения рабочей зоны чипа, входящего в состав мультичипа или конкретных кластеров, расположенных в рабочей зоне чипа, в сигналы, полученные с помощью измерения флуоресценции, измерения пропускания, колориметрического измерения, сигналов отражения, в цифровые данные, которые поступают на компьютер для последующей обработки по разным алгоритмам. Описание подобных аппаратных и программных систем хорошо известно из литературы.

Интерпретация полученных результатов

На фиг.10 представлен вариант медицинского чипа, в котором дифференцирующие олигонуклеотиды разделены на 12 (двенадцать) групп в зависимости от вида патогена. Интенсивность сигнала образующихся совершенных или несовершенных дуплексов внутри каждой группы существенно выше интенсивности сигнала отрицательных контролей, что позволяет проводить надежную видовую идентификацию инфекционных патогенов. Интерпретацию результатов проводят исходя из гибридизационной картины, которую получают, используя экспериментальную установку, включающую, например, сканер, компьютер и специальное программное обеспечение. Для цифровой обработки изображений применяют программу «Медскан-1».

Интерпретацию результатов проводят следующим образом. Интенсивности флуоресцентных или колорометрических сигналов в каждой группе ДНК-зондов, в которой содержатся олигонуклеотиды, видоспецифичные для одного из 12 инфекционных агентов, с помощью специального программного обеспечения сравнивают с группами зондов положительного (максимальная интенсивность сигнала) и отрицательного (минимальная интенсивность сигнала) контроля. Гибридизуемая проба ДНК способна образовать дуплексы лишь с одним типом специфичных олигонуклеотидов в каждой группе. В результате на биочипе образуется гибридизационная картина, различная для групп положительного контроля, отрицательного контроля и до 15 видов инфекционных агентов в зависимости от наличия инфекционных агентов в исследуемом образце, что позволяет однозначно интерпретировать полученные данные.

Особенности аппаратной и программной систем, разработанных в рамках настоящего изобретения, относятся к использованию мультичипов в качестве объекта диагностики. Каждый мультичип характеризуется перечнем параметров, которые входят в группу, состоящую из: а) значения интенсивности сигналов в каждом конкретном кластере рабочей зоны для каждого индивидуального чипа, б) количестве кластеров в рабочей зоне каждого индивидуального чипа и их распределение по объектам исследования, в) количество и расположение положительных и/или отрицательных контролей в рабочей зоне каждого из чипов, г) способа съема данных об интенсивности сигналов, д) изображение рабочей зоны чипа в виде графического изображения. Данные параметры формируются по определенным алгоритмам в компьютерный файл, который передается в базу данных, например в общий компьютер клиники. В дополнение к данным параметрам в состав файла входит уникальный идентификационный код, состоящий из комбинации первого идентификационного кода каждого отдельного чипа и/или второго и третьего идентификационных кодов, характеризующих параметры мультичипа.

Компьютерная программа идентифицирует уникальный код мультичипа в автоматическом или диалоговом режиме и производит обработку параметров, занесенных в компьютерный файл при сканировании мультичипа или его индивидуальных компонентов. Данные обработки заносятся в файл и в зависимости от структуры хранения информации в каждом конкретном лечебном заведении хранятся либо на дисках в картотеке вместе с картой больного, либо хранятся в компьютерной форме на жестких дисках центрального компьютера больницы. К этим данным может обращаться врач. Причем поиск файлов осуществляется при введении кода пациента и/или сканировании штрих-кодов с карты больного. После получения результатов диагностики отдельные чипы могут храниться в карте больного и при сканировании штрих-кода чипа и введении запроса в центральный компьютер последний выдает полную информацию по файлу, характеризующему все параметры и коды диагностики. Врач может сравнивать данные, полученные на разных этапах лечения болезни, по результатам независимых диагностик и корректировать лечение или прием тех или иных лекарств в соответствии с данными диагностики. Таким образом, уникальный код мультичипа и его компонентов позволяет упростить программы поиска необходимых файлов и сохранять данные о диагностике в разных формах, начиная от компьютерного файлов, кончая хранением индивидуальных чипов в период лечения больного.

Набор для диагностики

Набор для идентификации биополимеров на основе ДНК-овых или белковых зондов включает:

а) биологический мультичип, охарактеризованный в п.1 формулы изобретения;

б) реагенты для подготовки образца и проведения идентификации;

Набор может дополнительно содержать сканер, использующий в качестве возбуждающего источника флуоресценции свет диодных лазеров и укомплектованный ПЗС-камерой или сканер для измерения поглощения света, а также устройство для интерпретации и хранения результатов идентификации на основе компьютера.

Примеры

Ниже приведены примеры, которые включают, но не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Модификация ПММА.

Смешивали 1 объем 3-аминопропилтриэтоксисилана с 9 объемами дистиллированной воды и выдерживали 1 час при комнатной температуре. Затем в этот раствор помещали образец ПММА и выдерживали 2 часа при 40°С. Подложку дважды промывали водой и один раз этанолом. Осушку проводили при комнатной температуре.

Пример 2. Модификация ПММА.

Смешивали 1 объем 3-аминопропилтриэтоксисилана с 19 объемами дистиллированной воды и выдерживали 1 час при комнатной температуре. Затем в этот раствор помещали образец ПММА и выдерживали 3 часа при 30°С. Подложку дважды промывали водой и один раз этанолом. Осушку проводили при комнатной температуре.

Пример 3. Модификация ПВХ.

Смешивали 1 объем 3-аминопропилтриэтоксисилана с 19 объемами дистиллированной воды и выдерживали 1 час при комнатной температуре. Затем в этот раствор помещали образец поливинилхлорида и выдерживали 1 час при 45°С. Образец дважды промывали водой и один раз этанолом. Осушку проводили при комнатной температуре.

Пример 4. Модификация поликарбоната.

Смешивали 1 объем 3-аминопропилтриэтоксисилана с 15 объемами дистиллированной воды и выдерживали 1 час при комнатной температуре. Затем в этот раствор помещали образец поликарбоната и выдерживали 3 часа при 30°С. Подложку дважды промывали водой и один раз этанолом. Осушку проводили при комнатной температуре.

Пример 5. Модификация стекла.

Микроскопные стекла (Menzel, Германия) помещали на один час в 1%-ный раствор аммиака, промывали водой и заливали на час хромовой смесью, содержащей до 2% (v/v) олеума. Стекла тщательно промывали проточной, затем дважды дистиллированной водой, этиловым спиртом и сушили в вертикальном положении в течение 20 минут при 120°С.

В контейнер с вертикально расположенными стеклами наливали 5%-ный раствор 3-аминопропилтриэтоксисилана в ацетоне и выдерживали в течение одного часа. Стекла трижды промывали ацетоном (по 5 минут каждая), затем этанолом (2 раза по 3 минуты) и сушили при температуре 130°С в течение 20 минут.

Пример 6. Пришивка флуоресцентно меченного олигонуклеотидного зонда к поверхности амино-модифицированного стекла.

Для проверки качества получаемой аминированной поверхности проводили ковалентную пришивку флуоресцентно-меченного зонда и затем регистрировали уровень флуоресценции кластеров и фона. В качестве зонда использовали олигонуклеотид, модифицированный фосфатной группой по 5'-положению и 6-карбоксифлуоресцеином (FAM) по 3'-концу:

SEQ ID: 1 ТСТ СТТ TAG GCA TTG GTT TCG AAG CGG GCA

Реакционную смесь, содержащую 1 мкМ олигонуклеотида и 60 мМ EDC в 0,1 М 1-метилимидазоле, рН 7,0, наносили на поверхность стекла роботом (Xpress Lane, США), объем капель составлял от 10 до 50 нл. Стекла помещали в герметичную емкость и выдерживали при комнатной температуре в течение часа во влажной атмосфере для предотвращения высыхания капель. Затем стекла промывали на шейкере 1 мМ раствором NaOH в течение 10 минут для удаления нековалентно связанных молекул олигонуклеотидов, обрабатывали дистиллированной водой и хранили при 4°С.

Пример 7. Детекция флуоресцентно меченного зонда. Флуоресценцию хромофора (FAM) возбуждали в спектральном диапазоне 450-490 нм и регистрировали в диапазоне 510-560 нм с помощью интерференционных светофильтров HQ470/40X и HQ535/50M (Chroma Technology Corp., США) соответственно. Изображение поверхности стекла проектировалось на ПЗС-матрицу монохромной телевизионной камеры WAT-120N (Watec Co., Ltd., Япония), которая преобразовывала оптический сигнал в электрический и передавала его на плату видеозахвата, установленную в компьютере. Камера работала в линейном режиме. Далее сигнал преобразовывался в цифровую форму и обрабатывался компьютером с помощью оригинальной программы анализа изображений "QuantA". Программа позволяет рассчитать интегральную яркость выделенных областей изображения. Данные измерения флуоресценции представлены в относительных единицах по 8-битной шкале градации серого цвета (256 уровней яркости). Интегральная интенсивность окраски пятна/интенсивность фона составляет 103/11. На фиг.8 представлено изображение кластера, состоящего из 4 точек, нанесенного на поверхность модифицированного стеклянного чипа.

Пример 8. Пришивка олигонуклеотидного зонда к поверхности амино-модифицированного ПММА.

В качестве зонда использовали олигонуклеотид, модифицированный фосфатной группой по 5'-положению:

SEQ ID: 1 TCT CTT TAG GCA TTG GTT TCG AAG CGG GCA

Реакционную смесь, содержащую 1 мкМ олигонуклеотида и 60 мМ EDC в 0,1 М 1-метилимидазоле, рН 7,0, наносили на поверхность подложки роботом (Xpress Lane, США), объем капель составлял от 10 до 50 нл. Подложку помещали в герметичную емкость и выдерживали при комнатной температуре в течение часа во влажной атмосфере для предотвращения высыхания капель. Затем подложку промывали на шейкере 1 мМ раствором NaOH в течение 10 минут для удаления нековалентно связанных молекул олигонуклеотидов, обрабатывали дистиллированной водой и хранили при 4°С.

Пример 9. Гибридизация с биотинилированным праймером.

Перед гибридизацией в смесь продуктов ПЦР, меченных биотином и содержащих последовательность, комплементарную иммобилизованному олигонуклеотиду, добавляли буфер 20×SSC (не более 5% v/v) и SDS до конечной концентрации 0,1%. От 10 до 20 мкл полученной смеси наносили на рабочую зону подложки и накрывали покровным стеклом. Гибридизацию проводили при 45°С в течение часа. По окончании реакции избыток смеси смывали гибридизационным буфером 5×SSC, 0,1% SDS и затем тщательно промывали на шейкере следующими растворами: 2×SSC, 0,1% SDS - 2 раза по 5 минут; 0,1×SSC, 0,1% SDS - 2 раза по 3 минуты; 0,1×SSC - 2 смены по 1 минуте.

Пример 10. Проведение пероксидазной реакции.

Исходный стрептавидин-пероксидазный конъюгат ("Имбио", Россия) разбавляли последовательно в 200 раз 1×SSC, содержащим 1% BSA. Конъюгат наносили на рабочую зону подложки, накрывали покровным стеклом и выдерживали во влажной атмосфере при комнатной температуре в течение 30 минут. Отмывку не связавшегося конъюгата проводили 2×SSC в течение 5 минут, 1×SSC - 5 минут и 0,1×SSC в течение 1 минуты.

Подложку заливали свежеприготовленным раствором субстрата - диметиламинобензидина (DAB). Для этого не более чем за полчаса до проведения реакции растворяли 1 мг DAB в 1 мл 0,1×SSC, добавляли 20 мкл 3%-ного раствора пероксида водорода и перемешивали. Рабочую зону заливали приготовленным раствором субстрата, накрывали покровным стеклом и выдерживали от 10 до 30 минут при комнатной температуре. В случае положительной реакции появлялись коричневые пятна окисленного субстрата. Затем стекло промывали дистиллированной водой и помещали в вертикальном положении в контейнер для осушки и дальнейшего хранения

Пример 11. Детектирование хромогенного зонда.

Для получения изображений гибридизационных кластеров использовали слайд-сканер Nikon CoolScan 9000ED. Затем проводили количественную обработку изображений с помощью оригинальной программы "AnGene". Результат анализа изображений гибридизационного кластера, состоящего из 9 точек, размещенного на подложке, выполненной из ПММА, приведен на фиг.9. Анализ результата дает усредненную интенсивность окраски в зонах, равную 43,9, и интенсивность фона - 1,2 (в условных единицах).

Пример 12. Изготовление мультичипа из полимера

Брали массив ПММА размером 1500 мм×1500 мм, толщиной 1 мм, отрезали полосы шириной 210 мм, на рабочей поверхности формировали выемки и сквозные отверстия между чипами согласно формуле п.1, отрезали заготовки длиной 290 мм (формат А4) или формировали выемки между отдельными мультичипами. Рабочую поверхность при необходимости очищали, промывали и высушивали.

Промышленная применимость

Изобретение относится к устройству мультичипа и способу его применения для анализа образцов, полученных в молекулярной биологии, фармакологии, медицине и охране окружающей среды. В частности, изобретение относится к способу изготовления и применения мультичипа, который позволяет проводить как последовательные, так и параллельные диагностики на основе белковых или ДНК-овых зондов с применением разных типов идентификаторов и способов обработки полученных результатов.

Основные преимущества новой конструкции мультичипа и способа изготовления мультичипа, а также способа проведения анализа результатов диагностики состоят в низкой себестоимости производства мультичипов и удешевлении проводимой диагностики, а также возможности одновременного анализа множества проб на одном мультичипе при массовых скринингах, а также расширении применения мультичипов для диагностики в молекулярной биологии, фармакологии, медицине и охране окружающей среды.

Литература

1. McGall, Glenn H. Method for producing a high density nucleic acid array using activators. US Patent Applic. 20040180368 (September 16, 2004).

2. Белецкий И.П. и др. Набор праймеров для детекции и/или идентификации трансгенных последовательностей ДНК в растительном материале и его содержащих продуктах (варианты), праймер (варианты), пара праймеров (варианты), способ детекции и/или идентификации с их использованием (варианты) и устройство для осуществления способа. Патент RU2265668 (2005.12.10).

3. Мирзабеков А.Д. и др. Способ идентификации трансгенных последовательностей ДНК в растительном материале и продуктах на его основе, набор олигонуклеотидов и биочип для осуществления этого способа. Патент RU 2270254 (2006.02.20).

4. Sugiyama Y. et al. Biochip substrate holding method and biochip-reader. US Patent Applic. 20050136533 (June 23, 2005).

5. Sheridan R. et al. Method and apparatus for accessing a site on a biological substrate. US Patent 6673315 (January 6, 2004).

6. Bevirt J. et al. Microarray placer unit. US Patent Applic. 20040136868 (July 15, 2004).

7. Ganz B.L. et al. Microarray dispensing with real-time verification and inspection. US Patent 6558623 (May 6, 2003).

8. Bass J.K. Feature quality in array fabrication. US Patent 6587579 (July 1, 2003).

9. Remade J. et al. Detection and/or quantification method of a target molecule by a binding with a capture molecule fixed on the surface of a disc. US Patent Applic. 20020177144 (November 28, 2002).

10. Dellinger D.J. et al. Quality control method for array manufacture. US Patent Applic. 20050186580 (August 25, 2005).

11. Lefkowitz S. M. et al. Chemical arrays. US Patent Applic. 20030077380 (April 24, 2003).

12. Schembri С.Т. et al. Packaged microarray apparatus and a method of bonding a microarray into a package. US Patent Applic. 20030113724 (June 19, 2003).

13. Rava R.P. et al. Methods for concurrently processing multiple biological chip assays. US Patent 6720149 (April 13, 2004).

14. Hanzel D.К. Vapor phase method for producing silane coatings. US Patent Appl. 20040069634 (April 15, 2004).

15. Moffat W.A. et al. Silane coated substrate. US Patent Appl. 20050089695 (April 28, 2005).

16. Laguitton В. Silsesquioxane-coated substrates for immobilizing biomolecules. US Patent Appl. 20020090739 (July 11, 2002).

17. Но Chih-Wei et al. High-density functional slide and preparation method thereof. US Patent Appl. 20020028506 (March 7, 2002).

18. Buchardt О. et al. Polymer modification. US Patent 5077344 (December 31, 1991).

19. Fixe F. et al. Functionalization of poly (methyl methacrylate) (PMMA) as a substrate for DNA microarrays. Nucleic Acids Research, Vol.32, №1 e9 (, 2004).

20. Duffy et al. Methods of arraying biological materials using peelable and resealable devices. US Patent 7001740 (February 21, 2006).

21. Ершов Г.М. и др. Способ микродозирования водных растворов веществ на носитель и устройство для его осуществления. Патент RU 2041263 (1995.08.09).

22. Mirkin С.A. et al. Protein and peptide nanoarrays. US Patent Applic. 20030068446 (April 10, 2003).

23. Зарытова В.Ф. и др. Способ получения ДНК-чипов. Патент RU 2236467 (2004.09.20).

24. Garimella, V. et al. Method for attachment of silylated molecules to glass surfaces. US Patent Applic. 20040096856 (May 20, 2004).

25. Zeleny R. et al. Automatic imaging and analysis of microarray biochips. US Patent 6215894 (April 10, 2001).

26. Cattell H.F. Chemical array fabrication and use. US Patent 6879915 (April 12, 2005).

27. Барский В.Е. Флуоресцентный микроскоп. Патент RU 2182328 (2002.05.10).

28. Schembri C.T. Tiling process for constructing a chemical array. US Patent 6875620 (April 5, 2005).

29. Мао Y. et. Al. Gene chip carrier for multiple person diagnosis. CN 1314493 (2001-09-26).

30. Genghi H. Miniature reaction cup type protein chip. CN 1580770 (2005-02-16).

31. Kojima Y. et. Al. Method for preparing biochip and biochip. JP 2004028734 (2004-01-29).

Перечень последовательностей

<110> Заявитель:

Наименование: ЗАО «Молекулярно-медицинские технологии» Местонахождение: 142290, г.Пущино, Проспект Науки, д.3

<120> Название изобретения: «Способ изготовления многофункционального мультичипа, мультичип для последовательного или параллельного скрининга биополимеров, способ анализа биополимеров с использованием мультичипа, набор для идентификации биополимеров».

<160> количество последовательностей: 1

<210> № последовательности: SEQ ID NO:1

<211> Длина: 30 нуклеотидов

<212> Тип молекулы: одноцепочечная линейная ДНК

<213> Происхождение: синтетическая последовательность

<223> Назначение: праймер

<400> Описание последовательности SEQ ID NO:1:

TCTCTTTAGGCATTGGTTTCGAAGCGGGCA

Изобретение относится к молекулярной биологии и может быть использовано в фармакологии, медицине и в охране окружающей среды. При изготовлении мультичипа используют многоуровневую систему идентификации. На поверхности индивидуальных чипов мультичипа размещают первый идентификатор, содержащий первый код, и второй идентификатор, содержащий второй код. На поверхности общей зоны мультичипа размещают третий идентификатор, содержащий третий или второй код. Мультичип, полученный указанным способом, используют для диагностики ДНК путем гибридизации продуктов амплификации исследуемой ДНК с зондами, содержащимися на поверхности указанного мультичипа или на поверхности чипов, полученных отделением от указанного мультичипа. Мультичип также используют в наборе для идентификации биополимеров совместно с реагентами для подготовки образца и проведения идентификации биополимеров. Применение изобретения позволяет повысить эффективность и снизить стоимость анализа биополимеров. 4 н. и 21 з.п. ф-лы, 10 ил.

1. Мультичип для последовательного или параллельного скрининга биополимеров, представляющий собой несущий элемент, на поверхности которого расположен массив, содержащий N индивидуальных чипов с зондами, способными специфически связываться с искомыми биополимерами, и идентификатором, отличающийся тем, что на несущем элементе расположен массив, в котором N индивидуальных чипов содержат первый и второй идентификаторы, а также общая зона, которая размещена в одной плоскости с указанным массивом и содержит третий идентификатор, причем первый идентификатор содержит первый код, второй идентификатор содержит второй код, третий идентификатор содержит третий или второй код, и указанные коды образуют уникальные N пар кодов, характеризующих многофункциональный чип, а общая зона расположена на границе или в центре указанного массива, и соединение между ней и индивидуальными чипами выполнено с возможностью разделения.2. Мультичип по п.1, отличающийся тем, что для диагностики в медицине мультичип содержит от 2 до 10 чипов.3. Мультичип по п.1, отличающийся тем, что несущий элемент имеет форму прямоугольника, квадрата, многоугольника или круга.4. Мультичип по п.1, отличающийся тем, что несущий элемент имеет толщину 0,5-5 мм.5. Мультичип по п.3, отличающийся тем, что несущий элемент имеет форму прямоугольника.6. Мультичип по п.5, отличающийся тем, что соотношение длины и ширины несущего элемента лежит в пределах от 1:1 до 1:50.7. Мультичип по п.1, отличающийся тем, что несущий элемент выполнен из материала, который выбирают из группы, состоящей из полимера, стекла, керамики и их композиции.8. Мультичип по п.7, отличающийся тем, что полимер выбирают из группы, состоящей из полиметилметакрилата, полибутилметакрилата, поливинилхлорида, поликарбоната, сополимеров метилметакрилата и/или сополимеров бутилметакрилата с такими мономерами, как стирол и акрилонитрил.9. Мультичип по п.8, отличающийся тем, что полимер представляет собой полиметилметакрилат.10. Мультичип по п.8, отличающийся тем, что полимер представляет собой поливинилхлорид.11. Мультичип по п.1, отличающийся тем, что первый, второй и третий идентификатор выполнены в виде цифровых и/или буквенных обозначений, или штрих-кодов, или их комбинаций.12. Мультичип по п.1, отличающийся тем, что каждый индивидуальный чип содержит рабочую зону, которая разбита на 1-1000 кластеров.13. Мультичип по п.1, отличающийся тем, что каждый индивидуальный чип содержит рабочую зону, которая разбита на 15 кластеров.14. Мультичип по п.12, отличающийся тем, что кластеры представляют собой кластеры зондов и кластеры, которые выбирают из группы, состоящей из кластера положительных контролей и кластера отрицательных контролей.15. Мультичип по п.14, отличающийся тем, что соотношение между количеством кластеров зондов и кластеров положительных контролей составляет от 1:1 до 500:1.16. Мультичип по п.14, отличающийся тем, что соотношение между количеством кластеров зондов и кластеров отрицательных контролей составляет от 1:1 до 500:1.17. Мультичип по п.1, отличающийся тем, что предназначен для скрининга нуклеиновых кислот и содержит в качестве зондов дифференцирующие олигонуклеотиды, которые представлены в виде кластеров, причем каждый кластер содержит от одного до пятидесяти дифференцирующих олигонуклеотидов одного типа.18. Мультичип по п.1, отличающийся тем, что предназначен для скрининга нуклеиновых кислот и содержит в качестве зондов дифференцирующие олигонуклеотиды, которые представлены в виде кластеров, причем каждый кластер содержит 4 или 9 дифференцирующих олигонуклеотидов одного типа.19. Способ изготовления мультичипа по п.1 предусматривающий размещение на поверхности несущего элемента массива, содержащего N индивидуальных чипов с зондами, способными специфически связываться с искомыми биополимерами, и идентификатором, отличающийся тем, что на поверхности несущего элемента формируют общую зону, которую располагают в одной плоскости с указанным массивом, на поверхность индивидуальных чипов помещают первый идентификатор, содержащий первый код, и второй идентификатор, содержащий второй код, а на поверхность общей зоны помещают третий идентификатор, содержащий третий или второй код, причем общую зону формируют на границе или в центре указанного массива, соединение между ней и индивидуальными чипами выполняют с возможностью разделения, указанные коды образуют уникальные N пар кодов, характеризующих многофункциональный чип.20. Способ диагностики ДНК, предусматривающий обеспечение исследуемых образцов ДНК, прямых и обратных специфичных праймеров, проведение мультиплексной ПЦР, гибридизацию продуктов амплификации с дифференцирующими олигонуклеотидами на поверхности мультичипа или на поверхности чипов, полученных отсоединением от указанного мультичипа, детекцию и идентификацию результатов, отличающийся тем, что в качестве мультичипа используют мультичип по п.1, который в качестве зондов содержит дифференцирующие олигонуклеотиды, а идентификацию результатов проводят с учетом первого, второго и третьего идентификаторов.21. Способ по п.20, отличающийся тем, что идентификацию результатов проводят путем сравнения результатов с данными баз данных при помощи программных средств.22. Способ по п.20, отличающийся тем, что, когда гибридизацию продуктов амплификации проводят на чипах, полученных отсоединением от указанного мультичипа, первый, второй и третий идентификатор, а также результаты диагностики заносят в базу данных, где хранят с тем, чтобы использовать для быстрого поиска и идентификации параметров индивидуальных чипов или групп индивидуальных чипов относительно друг друга.23. Набор для идентификации биополимеров с помощью зондов, представляющих собой ДНК или белки, состоящий из мультичипа по п.1, в котором зонды, представляют собой ДНК или белки, и реагентов для подготовки образца и проведения идентификации биополимеров.24. Набор по п.23, который содержит либо сканер, использующий в качестве источника флуоресценции свет диодных лазеров и укомплектованный ПЗС-камерой, либо сканер для измерения поглощения света.25. Набор по п.25, который содержит устройство для интерпретации и хранения результатов идентификации биополимеров на основе компьютера.