СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИДРОГЕЛЯ С ТЕРМООТЩЕПЛЯЕМЫМИ НУКЛЕИНОВЫМИ КИСЛОТАМИ Российский патент 2024 года по МПК C08J3/02 C12Q1/68 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области органической химии, биохимии и молекулярной биологии. Описан способ получения кросс-сшитых агарозных ячеек, связанных ковалентными связями с рабочей полимерной подложкой, содержащими иммобилизованные термоотщепляемые от агарозы олигонуклеотиды, которые после термоотщепления могут участвовать в ПЦР в качестве праймеров.

Уровень техники

Амплификация нуклеиновых кислот позволяет исследовать ультрамалые количества исходного генетического материала и широко используется в молекулярно-генетических исследованиях и клинической диагностике. Сочетание ПЦР и параллельного множественного анализа продуктов ПЦР стало основным трендом современных высокопроизводительных молекулярно-биологических исследований, в том числе технологии биологических микрочипов (microarray) (Gryadunov D., Dementieva E., Mikhailovich V., Nasedkina Т., Rubina A., Sawateeva E., Fesenko E., Chudinov A., Zimenkov D., Kolchinsky A., Zasedatelev A. Gel-based microarrays in clinical diagnostics in Russia. Expert Rev. Mol. Diagn., 2011, V. 11, №8, P. 839-853) и секвенирования нового поколения (NGS) (Mardis E.R. Next-Generation Sequencing Platforms. Annu. Rev. Anal. Chem., 2013, V. 6, P. 287-303). Несмотря на несомненные успехи методов секвенирования, множественный параллельный анализ нуклеиновых кислот на биологических микрочипах находит применение в геномных исследованиях и продолжает развиваться.

Метод биочипов развивается и в протеомных исследованиях. Зонды, специфичные к анализируемым макромолекулам, закрепляют на твердых носителях. Носителями могут быть микросферы, кодируемые набором флуоресцентных красителей. На каждом типе микросфер закреплен один вид зондов. Анализируемая ДНК, маркированная в ходе ПЦР независимым флуоресцентным красителем, одновременно реагирует со смесью различных типов микросфер и связывается с комплементарным зондом. Связывание анализируемой ДНК с микросферами контролируют методом проточной цитометрии микросфер с декодированием по набору флуоресцентных красителей, которыми микросферы маркированы (Spiro A., Lowe М, Brown D.A bead-based method for multiplexed identification and quantitation of DNA sequences using flow cytometry. Appl. Environ. Microbiol. 2000, V. 66, №10, P. 4258-4265).

Биологические чипы представляют собой твердую подложку, на которую нанесены фрагменты нуклеиновых кислот, углеводы, белки или другие молекулы. Создание ДНК-биочипов требует разработки эффективных способов иммобилизации нуклеиновых кислот на поверхность подложки. Чаще всего зонды закрепляют непосредственно на поверхности подложки (Sassolas A., Leca-Bouvier B.D., Blum L.J. DNA Biosensors and Microarrays. Chem. Rev. 2008, 108, P. 109-139) или в гидрогелевых ячейках, связанных с подложкой (Rubina А. Yu., S.V. Pan'kov, E.I. Dementieva, D.N. Pen'kov, A.V. Butygin, V.A. Vasiliskov, A.V. Chudinov, A.L. Mikheikin, V.M. Mikhailovich, A.D. Mipzabekov. Hydrogel drop microchips with immobilized DNA: properties and methods for large-scale production. Analytical Biochemistry, 2004, V. 325, №1, P. 92-106).

В качестве подложки для биочипов могут быть использованы стекло, кремний, золото, мембранные фильтры, гидрогели на основе полиакриламида, подложки из полимерных материалов. Обычно это подложки из химически инертных доступных полимеров, полиметилметакрилата, полистирола, полипропилена, полиэтилентерефталата. Поверхность полимерных подложек, для придания им необходимых свойств, химически модифицируют, прививают к поверхности реактивные группы, покрывают слоями других полимеров (Fixe F., Dufva М., Telleman P., Christensen CV.B.V. Functionalization of poly(methyl methacrylate) (PMMA) as a substrate for DNA microarrays. Nucleic Acids Research, 2004, Vol.32, №1, e9).

В работе (Kinoshita К., Fujimoto К., Yakabe Т. Multiple primer extension by DNA polymerase on a novel plastic DNA array coated with a biocompatible polymer. Nucleic Acids Research, 2007, Vol.35, №1, е3) на поверхность пластиковой подложки, изготовленную из циклического сополимера, прививали слой нерегулярного сополимера 2-метакрилоилоксиэтилфосфорилхолина и нескольких других акрилатов. Покрытие подложки гидрофильным полимером с фосфохолиновыми группами полностью исключает неспецифическую сорбцию ДНК и белков и не влияет на результаты реакции удлинения праймеров (primer extension), которые ковалентно связаны с полимерным покрытием подложки. Однако, гидрофильная поверхность подложки приводит к растеканию наносимых на подложку микрокапель растворов зондов.

Для преодоления такого нежелательного явления, как растекание микрокапель растворов на подложке, в работе (Zhou Y., Andersson О., Lindberg P., Liedberg В. Protein Microarrays on arboxymethylated Dextran Hydrogels: Immobilization, Characterization and Application. Microchim. Acta, 2004, Vol.147, P. 21-30) поверхность стеклянной подложки сначала покрывали гидрофильным карбоксиметилированным декстраном. Затем изготавливали барьеры для ячеек в виде гидрофобной сетки из тетраоктиламина бромида. Гидрофобную сетку наносили микроконтактной печатью. После капельного нанесения раствора белка внутрь сетки и связывания белка с декстраном, гидрофобный барьер удаляли с поверхности чипа. Таким образом, при нанесении раствора белка капли не растекаются. При проведении анализа гидрофильное пространство между ячейками не сорбирует компоненты анализируемой пробы.

В литературе известны различные способы предварительной обработки стеклянной поверхности, используемой для изготовления ДНК-чипов: путем формирования на ней агарозной пленки (V. Afanassiev, V. Hanemann, S. Wolfl, Nucl. Acids Res., 2000, vol. 28, e66); пленки из полилизина (R. Jenison, S. Yang, A. Haeberli, B. Polisky, Nature Biotechnology, 2001, vol. 19, p.62-65; Зарытова В.Ф. Способ получения ДНК-чипов. Ru патент 2236467 С1, апрель 14, 2003); пленки из полиэтиленимина (P.Н. Lee, S.P. Sawan, Z. Modurson, L. J. Arnold, M.A. Reynolds, Bioconjugate Chemistry, 2002, vol. 13, p.97-103). Модификацию агарозной пленки проводят для образования на поверхности реакционноспособных альдегидных групп, которые затем в свою очередь реагируют с аминогруппой аминолинкера на олигонуклеотиде. После образования на поверхности ковалентных связей в виде оснований Шиффа их восстанавливают боргидридом натрия. Для ковалентного присоединения олигонуклеотидов к стеклянной подложке используют бифункциональные сшивающие агенты и предварительную обработку поверхности подложки полилизином или полиэтиленимином.

Другой способ модификации подложки ДНК-чипов (С.Consolandi, В. Castiglioni, R. Bordoni, Е. Busti, С.Battaglia, L. R. Bernardi, G. De Bellis. Nucleosides, Nucleotides, Nucleic Acids, 2002, vol. 21, p.561-580) заключается во введении на поверхность стеклянного слайда эпоксигрупп при помощи 3-глицидоксипропилтриметоксисилана с последующей обработкой раствором полилизина. Последующую активацию аминогрупп полилизина проводят при действии 1,4-фенилендиизоцианата. После серии промывок и высушивания слайды используют для создания ДНК-чипов, используя олигонуклеотиды с аминолинкером.

Среди огромного количества промышленных пластмасс лишь некоторые являются полимерами, содержащими на своей поверхности реакционноспособные группы. В их числе полиметилметакрилат (Шляпников Ю.М. и др. Способ получения ДНК-чипов (варианты). Ru патент RU 2315114С2. Январь 20, 2008).

Одним из способов модификации сложноэфирных групп является их аминолиз под гексаметилендиамина (Buchardt, et al. Polymer modification. US Patent 5077344 December 31,1991; Roger M.S. Methacrylate polymer coating composition modified with an alkylenimine. US Patent 3 290 416, Dec. 6, 1966; F. Fixe, M. Dufva, P. Telleman, C.B.V. Christensen, Functionalization of poly(methyl methacrylate) (PMMA) as a substrate for DNA microarrays, Nucleic Acids Research, 2004, Vol.32, No. 1; Henry A.C., Tutt J.J., Galloway M., Davidson Y.Y., McWhorter C.S., Soper S.A., McCarley R.L. Surface modification of poly(methyl methacrylate) used in the fabrication ofmicroanalytical devices. Anal. Chem. (2000), Vol.72, P. 5331-5337). При помощи конденсирующих агентов далее проводят иммобилизацию зонда на аминированную поверхность. Существенный недостаток такого рода модификации поверхности является неспецифическая сорбция олигонуклеотидов, несущих отрицательный заряд, на положительно заряженной гидрофобной аминированной поверхности. Неспецифическая сорбция в дальнейшем приводит к снижению чувствительности анализа.

Авторами (Bulmus. V., Ayhan. Н. and Piskin, Е. Modified PMMA monosize microbeads for glucose oxidase immobilization. Chem. Eng. J. (1997), Vol.65, P. 71-76) предложен способ модификации поверхности, содержащей сложноэфирные группы путем проведения реакции переэтерефикации полимера действием поливинилового спирта с последующей обработкой периодатом натрия. Образующиеся на поверхности альдегидные группы реагировали с концевой аминогруппой олигонуклеотидов, содержащих аминолинкер. Образующиеся в ходе реакции азометиновые группы далее подвергались обработке боргидридом натрия для предотвращения гидролитического расщепления сшивки.

Авторы (Holmberg et al. Poly I: С covalently bonded to polymer for diagnostic purposes. US Patent 4767701, August 30,1988; Шляпников Ю. M. и др. Способ получения ДНК-чипов (варианты). Ru патент RU 2006 111 052. Январь 20, 2008) предложили модифицировать поверхность полиметилметакрилата при помощи обработки 2-15М раствором щелочи в диапазоне температур от 10°С до 100°С. Иммобилизацию олигонуклеотидов проводят в присутствии EDC.

В ячейках микрочипа анализируемый образец реагирует с зондами, закрепленными на носителе. Ковалентное закрепление зондов на носителе, особенно если носителем является твердая поверхность, снижает специфичность взаимодействия зондов с анализируемыми пробами биополимеров. Химические свойства поверхности, на которой закреплены пробы, существенно сказывается на возможностях всей аналитической системы (Brittain W.J., Brandstetter Т., Prucker О., Rühe J. The surface science of microarray generation - a critical inventory. ACS Applied Materials and Interfaces. 2019, vol. 11, 43, 39397-39409). Для уменьшения негативного воздействия носителя используют различные приемы. В работе (Watanabe R., Komatsu Т., Sakamoto S., Urano Y., Noji H. High-throughput single-molecule bioassay using micro-reactor arrays with a concentration gradient of target molecules. Lab on Chip, 2018, №18, P. 2849-2853) описан чип, в котором пробы не закреплены на носителе, а находятся в виде раствора в микрореакторах, изготовленных на подложке. Чип содержит более 100000 микрореакторов диаметром 4 мкм и высотой 0,5 мкм. Стеклянную гидрофильную подложку покрывали фторуглеродным полимером. Затем покрывали специальным положительным фоточувствительным слоем. Матрицу микрореакторов получали методом сухого травления кислород-ионной плазмой. Слой фторуглеродного покрытия протравливали до гидрофильной стеклянной подложки. После удаления фоточувствительно слоя получали матрицу микрореакторов. Сверху подложки размещали крышку с каналами шириной 2 мм и высотой 0.3 мм. Микрореакторы по каналам заполняли контролируемым потоком водного раствора мишени с градиентом концентрации в направлении потока вдоль по каналу. Заполнение микрореакторов происходит под действием гидрофильно-гидрофобных сил, характерных для капилляров и диффузионного распределения вещества мишени. Затем растворы мишени в микрореакторах закрывали липидной бислойной мембраной. Анализ проводили в камере, собранной из подложки с микрореакторами и крышки с каналами. Данное устройство позволяет анализировать вещества, которые проникают через липидный мембранный слой. Контроль результатов анализа ведут методом флуоресценции с покадровой регистрации. Устройство использовано для анализа ферментов с флуорогенным субстратом, находящимся в микрореакторах, а также для анализа мембранолизирующих белков.

Традиционно амплификацию анализируемых образцов ДНК проводили отдельно в пробирках, а затем продукты амплификации анализировали гибридизационным анализом на биочипах (Gryadunov D., Dementieva Е., Mikhailovich V., Nasedkina Т., Rubina А., Savvateeva Е., Fesenko Е., Chudinov A., Zimenkov D., Kolchinsky A., Zasedatelev A. Gel-based microarrays in clinical diagnostics in Russia. Expert Rev. Mol. Diagn., 2011, V. 11, №8, P. 839-853). В последнее время интенсивно развивается технология микроанализа ДНК, в которой ПЦР и регистрация результатов ПЦР совмещены в одном микроустройстве (Andreadis J.D., Chrisey L.A., Use of immobilized PCR primers to generate covalently immobilized DNAs for in vitro transcritio/translation reactions. Nucleic Acids Research, 2000, V.28, №2, e5; Wu Z., Bai Y., Cheng Z., Liu F., Wang P., Yang D., Li G., Jin Q., Mao H., Zhao J. Absolute quantification of DNA methylation using microfluidic chip-based digital PCR. Biosensors and Bioelectronic, 2017, 96, 339-344). Направление получило название «лаборатория на чипе» (Lab on Chip) (Ahrberg C.D., Manz A., Chung B.G. Polymerase chain reaction in microfluidic devices. Lab on Chip, 2016, 16, 3866). При реализации данного направления используют различные методические и инструментальные подходы с применением различных полимерных материалов, с последующим направленным изменением свойств поверхности и свойств материалов в результате физического, химического или биологического воздействия. Такие материалы с программируемыми свойствами стали называть «умными» (smart) материалами (English М.А., Soenksen L.R., Gayet R.V., et all. Programmable CRISPR-responsive smart materials. Science 2019, 365, 780-785). В настоящее время технология анализа биополимеров «лаборатория на чипе» рассматривается как одно из основных направлений в развитии мирового диагностического тренда, диагностики на месте оказания помощи (Point-of-care Diagnostics) (Primiceri Е., Chiriaco М.С., Notarangelo F.M., et all. Key Enabling Technologies for Point-of-Care Diagnostics. Sensors, 2018, 18, 3607).

Недостатками представленных выше способов модификации твердой поверхности являются длительная предварительная подготовка поверхности для образования реакционноспособных групп, ковалентное присоединение олигонуклеотидов к поверхности подложки с невозможностью разрыва в мягких условиях образующейся связи.

Разработанные методы решают часть задач, необходимых для реализации технологии изготовления матрицы закрепленных на подложке агарозных ячеек -микрореакторов, предназначенных для проведения в каждой ячейке термоциклической ПЦР с общей анализируемой смесью ДНК по единому термоциклу, но с различными парами праймеров в каждой ячейке, с изоляцией ячеек от внешней среды, исключением массообмена между ячейками при термоциклировании и одновременным микроскопическим контролем результатов. Найденные решения могут быть использованы при разработке технологии параллельного множественного микроанализа образцов ДНК для выявления соматических и инфекционных заболеваний человека.

Раскрытие сущности изобретения

Традиционный метод биочипов (microarray) включает в себя три основных процесса: ПЦР амплификация ДНК с ведением флуоресцентной метки, в пробирке на термоциклере; гибридизация продуктов ПЦР с матрицей ДНК зондов в ячейках биочипа; регистрация флуоресцентных сигналов в ячейках биочипа методом цифровой флуоресцентной микроскопии. В ходе проведения анализа, за счет многочисленных манипуляций в открытой системе, есть вероятность контаминации образца. В связи с этим, следующим этапом развития технологии биологических микрочипов стало развитие систем микроанализа нуклеиновых кислот на микроустройствах, сочетающих несколько операций без контакта с внешней средой. Направление получило название «лаборатория на чипе» (lab- on- chip). Система амплификации входящая в микросистемы полного анализа ДНК должна быть закрытой и одноразовой.

Данное изобретение представляет собой способ получения гидрогеля с термоотщепляемыми нуклеиновыми кислотами. Для воплощения данного способа используется метод получения кросс-сшитых агарозных ячеек, связанных ковалентными связями с полимерной подложкой и содержащих иммобилизованные термоотщепляемые от агарозы олигонуклеотиды, которые после термоотщепления могут участвовать в ПЦР в качестве праймеров. Техническим результатом данного изобретения, является разработка более эффективного способа изготовления полимерной подложки с фотоактивной поверхностью и введения в природный полимер, агарозу, химических групп, придающих агарозе новые дополнительные свойства, с сохранением способности к термозависимому фазовому переходу плавления-гелеобразования. Добавление хаотропных реагентов позволяет солюбилизировать агарозу и получать раствор при комнатной температуре. Модифицированная агароза приобретает способность при УФ-облучении образовывать термически стойкие ячейки, прочно связываясь с подложкой, ковалентно связывать олигонуклеотиды, которые могут быть отщеплены от агарозы по команде, подаваемой путем нагрева. Модификация агарозы позволяет получить «умный» гель, который выполняет подаваемую с помощью нагрева команду и отщепляет присоединенные к гелю целевые фрагменты ДНК с сохранением их функциональных свойств - они могут использоваться в ПЦР в качестве праймеров.

Для воплощения изобретения решались следующие задачи:

а) изготовление полимерной подложки с фотоактивной поверхностью;

б) получение карбоксиметилированной агарозы с последующим введением в нее фрагментов метакриловой кислоты;

в) модификация метакрилаткарбоксиметилагарозы с образованием полигликолевого линкера, несущего концевую карбоксильную группу;

г) получение кросс-сшитых агарозных ячеек, связанных ковалентными связями с полимерной подложкой;

д) иммобилизация в агарозные ячейки красителя NH₂-Cy5, несущего первичную аминогруппу на гексаметиленовом линкере, или пары олигонуклеотидов, несущих на 5'-конце первичную аминогруппу;

е) изготовления неразборного пленочного чипа с агарозными ячейками;

ж) проведение ПЦР с использованием пленочного чипа, содержащего олигонуклеотиды, ковалентно связанные с агарозными ячейками, которые после нагревания отщепляются и используются в качестве праймеров в реакции амплификации.

Краткое описание схем и фигур

Фигура 1. Получение карбоксиметилагарозы (II), метакрилкарбоксиметилагарозы (III) и метакрилкарбоксиполигликольагарозы (IV).

Фигура 2. Кросс-сшивание и контроль метакрилкарбоксиполигликольагарозы (IV) по термоотщеплению красителя NH₂-Cy5.

Фигура 3. Кросс-сшивание и присоединение олигонуклеотида, содержащего аминолинкер. Фигура 4. Схема конструкции пленочного чипа.

Фигура 5. Изображение чипа с агарозными ячейками с иммобилизованным красителем NH₂-Cy5 в свете флуоресценции красителя (возбуждение 650 нм, регистрация 716 нм), полученное на флуоресцентном анализаторе биочипов. (Т-) - ячейки без термоотщепляемого линкера, (Т+) - ячейки с термоотщепляемыми линкерами до прогрева и после прогрева в течение 5 мин при 95°С в ТЕ-буфере (рН 8.0), по два ряда в четырех повторах.

Фигура 6. Средние значения флуоресцентных сигналов агарозных ячеек с иммобилизованным красителем NH₂-Cy5 в свете флуоресценции красителя. (Т-) - ячейки без терморасщепляемого линкера, (Т+) - ячейки с терморасщепляемыми линкерами до и после прогрева в течение 5 мин при 95°С в ТЕ-буфере (рН 8.0).

Фигура 7. Электрофореграмма продуктов амплификации 7-го экзона гена АВО человека в 2%-ном агарозном геле, окрашенном SYBR Green. Длина целевого продукта - 124 п. н; 1 -Маркер длин фрагментов ДНК (pUC19/Msp I; Sileks, Россия); 2 - продукт ПЦР, полученный в камере чипа с ячейками, содержащими праймеры на терморасщепляемых линкерах; 3 -продукты ПЦР, полученные в камере чипа с ячейками, которые не активировали; 4 -продукты ПЦР, полученные в камере чипа в присутствии праймеров в растворе (положительный контроль); 5 - продукты ПЦР, полученные в камере чипа с праймерами, которые термически не отщепляются; 6 - продукты ПЦР, полученные в камере чипа без добавления матрицы (отрицательный контроль); 7 - продукты ПЦР, полученные в камере чипа без добавления ДНК-полимеразы (отрицательный контроль).

Осуществление изобретения

Полимерную подложку, используемую как основу для ячеек из модифицированной агарозы, изготавливали путем нанесения тонкого слоя раствора циклоолефинового сополимера (ЦОС) на пленочный полиэтилентерефталат (ПЭТ) центрифугированием (spin coating) с последующим высушиванием и "свариванием" при температуре >150°С. Слой ЦОС прочно держится на поверхности ПЭТ, не отслаивается в условиях термоциклической ПЦР.

Карбоксиметилированную агарозу получали реакцией агарозы (I) с хлоруксусной кислотой, для этого агарозу (I) в смеси с i-PrOH и 4М NaOH в соотношении 3:1 суспендировали на встряхивателе Vortex Genie 2Т (Scientific Industries, США) в течение 1 ч при комнатной температуре, затем добавляли раствор эквимолярного количества хлоруксусной кислоты в i-PrOH и прогревали при 60°С 15 мин при перемешивании на термошейкере TS-100C (Biosan, Латвия) (Фигура 1). Реакционную массу охлаждали до комнатной температуры, нейтрализовывали ледяной уксусной кислотой, промывали 0.1М HCl, далее последовательно промывали 50, 75 и 87.5%-ым раствором i-PrOH в воде и 100%-ым i-PrOH, сушили в вакууме. Затем по сохранившимся гидроксильным группам вводили фрагменты метакриловой кислоты, для этого к раствору полученной карбоксиметилагарозы (II) в DMF при 4°С и перемешивании добавляли DIPEA и ангидрид метакриловой кислоты. Смесь перемешивали 3 ч при 4°С и дополнительно 3 ч при 25°С. Полученную таким образом метакрилаткарбоксиметилагарозу (III) осаждали ацетоном, промывали 96%-ным EtOH, сушили в вакууме.

На следующей стадии модификации к раствору метакрилаткарбоксиметилагарозы (III) в DMF при перемешивании добавляли триэтиламин, через 30 минут обрабатывали бромуксусной кислотой и дополнительной порцией триэтиламина, что приводило к образованию связанного с агарозой полигликолевого линкера с концевой карбоксильной группой по методу, описанному в работе (Pinkus A.G. J. Polymer Sci.: Polymer Chem. Ed. 1984. V. 22. P. 1131-1140) (Фигура 1). Условия модификации агарозы оптимизировали с контролем степени модификации агарозных звеньев углеводного полимера. Агароза после модификации сохраняет способность к термозависимому фазовому переходу плавление -гелеобразование, а добавление хаотропных реагентов позволяет регулировать температурные границы этих переходов, солюбилизировать агарозу и получать раствор при комнатной температуре.

Раствор солюбилизированной модифицированной агарозы готовили путем добавления к высушенной метакрилатполигликолькарбоксиметилагарозе (IV) раствора смеси бензофенона (фотоинициатор) и N,N'-метилен-бисакриламида в DMF (Фигура 2).

Полученный раствор перемешивали 20 мин, после чего добавляли порцию воды и продолжали перемешивать, и наносили иглой робота-манипулятора (QArray, Genetix, Англия) в виде микрокапель на поверхность полимерной подложки при комнатной температуре (диаметр иглы 100 мкм, шаг 300 мкм).

Подложку с матрицей агарозных капель охлаждали при -18°С в течение 30 мин, раствор при этом переходит в состояние геля. Далее подложку с ячейками облучали УФ-светом с помощью люминесцентного осветителя ОИ-18А с кварцевой ртутной лампой сверхвысокого давления ДРК-120 в течение 12 мин, затем многократно промывали смесью диоксан/DMF (1:1).

При фотооблучении происходит кросс-сшивание агарозы с образованием плотных ячеек, связанных ковалентными связями с фотоактивной поверхностью подложки. Карбоксильные группы на полигликолевых линкерах при этом сохраняются. Связывание агарозных ячеек с поверхностью ПЭТ, не покрытого ЦОС, не происходит.

Активацию карбоксильных групп в ячейках проводили в сформированных на подложке разборных камерах объемом 25 мкл. В камеру вносили 0.1М раствор активатора TSTU и 0.1М раствор DIPEA в смеси диоксан/DMF (1:1), инкубировали 1 ч при комнатной температуре, раствор удаляли, промывали смесью диоксан/DMF (1:1) (Фигура 2).

После активации проводили стадию иммобилизации красителя NH₂-Су5, несущего первичную аминогруппу на гексаметиленовом линкере (Фигура 2), или пары олигонуклеотидов, несущих на 5'-конце первичную аминогруппу (Фигура 3). Для этого в камеру вносили раствор красителя NH₂-Cy5 или паре олигонуклеотидов SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, каждый в концентрации 1 мкМ в 0.1 М карбонатном буфере (рН 9.2), инкубировали при 4°С в течение ночи, удаляли раствор, многократно промывали 30%-ым ацетонитрилом в 0.1 М триэтиламмонийацетатном (ТЕАА) буфере (рН 7.0).

Подложку с агарозными ячейками использовали для изготовления неразборного пленочного чипа (Фигура 4). Чип изготавливали сборкой, путем склеивания между собой слоев ПЭТ-пленки. Чип содержит внутреннюю герметичную камеру (высота 200 мкм, объем 25 мкл), в которой находятся агарозные ячейки (Фигура 4). Подачу и удаление рабочих растворов производили через отверстия в крышке, и далее растворы по внутренним каналам поступали в камеру. Нагрев растворов в камере чипа осуществляли через подложку и крышку. Регистрацию флуоресцентных сигналов ячеек выполняли через крышку. ПЭТ не поглощает и не флуоресцирует в оптическом диапазоне флуоресценции красителя Су5 (Мифтахов Р.А., Лапа С.А., Шершов В.Е., Заседателева О.А., Гусейнов Т.О., Спицын М.А., Кузнецова В.Е., Мамаев Д.Д., Лысов Ю.П., Барский В.Е., Тимофеев Э.Н., Заседателев А.С., Чудинов А.В. Биофизика. 2018. Т. 63. С.661-668; Мифтахов Р.А., Лапа С.А., Кузнецова В.Е., Золотое A.M., Василисков В.А., Шершов В.Е., Суржиков С.А., Заседателев А.С., Чудинов А.В. Биоорг. химия. 2021. Т. 47. С.841-844). При нагревании при 95°С в ТЕ-буфере (рН 8.0) молекулы красителя, связанные с агарозными ячейками на терморасщепляемых линкерах, частично отщепляются (Фигура 2). За первые 5 мин степень отщепления составляет 42% (Фигура 5, Фигура 6). В контроле молекулы красителя, связанные с карбоксиметилированными агарозными ячейками, без специально получаемого полигликолевого линкера, в тех же условиях отщепляются меньше, степень отщепления составляет 11% (Фигура 5, Фигура 6). Олигонуклеотиды, связанные с агарозными ячейками, при нагревании также отщепляются и сохраняют специфические функции и используются в качестве праймеров в реакции амплификации участка последовательности 7-го экзона гена АВО человека, который детерминирует серологический фенотип группы крови АВО.

Камеру чипа через отверстия в крышке заполняли реакционной смесью, содержащей 1.5 ед. Taq-полимеразы (Thermo Scientific, США) в буфере той же фирмы, dNTP в концентрации 400 мкМ каждого и геномную ДНК человека в количестве 10 нг в качестве матрицы. Реакцию проводили на ДНК-амплификаторе TGradient (Biometra, США) для in situ ПЦР при следующих условиях: 95°С - 3 мин (начальная денатурация); 36 циклов: 95°С - 20 с, 60°С - 30 с, 72°С - 40 с; далее 72°С - 5 мин (завершающая инкубация). Реакционную смесь через отверстия в крышке извлекали из чипа, упаривали в вакууме досуха, растворяли в минимальном объеме деионизированной Н₂О и анализировали методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле с окрашиванием SYBR Green. Методом гель-электофореза в 2-% агарозном геле фиксировали продукт ПЦР соответствующей длины - 124 п. н. (Фигура 7), что свидетельствовало о сохранении специфических функций олигонуклеотидов после процедуры их иммобилизации в агарозных ячейках чипа с последующим термическим отщеплением от агарозного геля.

Далее изобретение будет проиллюстрировано примерами, которые предназначены для обеспечения лучшего понимания сущности заявленного изобретения, но не должны рассматриваться как ограничивающие данное изобретение.

Примеры соединений и их применение

Использовали образцы бесцветной пленки кристаллического полиэтилентерефталата ПЭТ Э (ГОСТ 24234-80, плотность 1.39 г/см3, молекулярная масса 20000-40000, размер 25 × 75 мм, толщина 200 мкм), циклоолефиновый сополимер СОС Topas 5013L-10 (Ticona GmbH, Германия), агарозу 162-0102 (Bio-Rad, США), флуоресцентный краситель SYBR Green ("Thermo Scientific", США), Taq-полимеразы (Thermo Scientific, США) с буферными растворами того же производителя, трифосфаты дезоксинуклеозидов производства "Fermentas" (США), а также геномную ДНК человека (здорового донора) из коллекции Института вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова (Москва).

В реакции амплификации использовали праймеры SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, сконструированные с помощью сетевого ресурса Primer-Blast (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast). Была использована последовательность 7-го экзона гена АВО человека (GenBank: NM 020469.3).

1 М Триэтиламмоний-ацетатный буферный раствор (ТЕАА) получают следующим образом. К смеси деионизованной воды (700 мл) и триэтиламина (139 мл, 1 моль) при охлаждении на льду и интенсивном перемешивании добавляют по каплям под слой жидкости уксусную кислоту (57 мл, 1 моль) (до рН 7.0) и объем раствора доводят до 1 л.

Электрофоретический анализ продуктов ПЦР осуществляют в 2%-ном агарозном геле.

Аминосодержащий индодикарбоцианиновый краситель синтезируют по схеме, представленной в публикации (Р.А. Мифтахов и др., Получение активных карбоксильных групп на поверхности полиэтилентерефталатной пленки и количественный анализ этих групп с помощью цифровой люминесцентной микроскопии, Биофизика. 2018, т.63, №4, с. 661-668).

Флуоресцентные сигналы регистрируют на специализированном флуоресцентном анализаторе биочипов (Lysov Yu., Barsky V., Urasov D., Urasov R., Cherepanov A., Mamaev D., Yegorov Ye., Chudinov A., Surzhikov S., Rubina A., Smoldovskaya O., Zasedatelev A. Biomed. Opt. Express. 2017. V. 8. P. 114798] разработки ИМБ РАН (Россия) при длине волны возбуждения, соответствующей Су5 (650 нм), и запирающем фильтре 716 нм.

Остальные реактивы и растворители марок "ОСЧ", "ХЧ" или "ЧДА" фирм Aldrich, Alfa Aesar, Fluka и Химмед. Воду для приготовления растворов получают на установке Milli-Q (EMD Millipore, США).

Пример 1. Получение карбоксиметилагарозы.

Агарозу (20 мг, 65.8 мкмоль мономерных звеньев) в смеси с i-PrOH (300 мкл) и 4М NaOH (100 мкл) суспендируют на встряхивателе Vortex Genie 2Т (Scientific Industries, США) в течение 1 ч при комнатной температуре, затем добавляют раствор хлоруксусной кислоты (6.2 мг, 65.8 мкмоль) в i-PrOH (100 мкл) и прогревают при 60°С 15 мин при перемешивании на термошейкере TS-100C (Biosan, Латвия). Охлаждают до комнатной температуры, нейтрализуют ледяной уксусной кислотой, промывают 0.1М HCl, далее последовательно промывают 50, 75 и 87.5%-ым раствором i-PrOH в воде и 100%-ым i-PrOH и высушивают в вакууме.

Пример 2. Получение метакрилаткарбоксиметилагарозы.

К раствору, полученной в Примере 1, карбоксиметилагарозы в DMF (500 мкл) при 4°С и перемешивании добавляют DIPEA (1.4 мкл, 8 мкмоль) и ангидрид метакриловой кислоты (1.2 мкл, 8.2 мкмоль). Смесь перемешивают 3 ч при 4°С и дополнительно 3 ч при 25°С. Продукт осаждают ацетоном, промывают 96%-ым EtOH и высушивают в вакууме.

Пример 3. Получение метакрилатполигликолькарбоксиметилагарозы.

К раствору, полученной в Примере 2, метакрилаткарбоксиметилагарозы в DMF (500 мкл) при перемешивании добавляют Et₃N (10 мкл), через 30 мин добавляют бромуксусную кислоту (15 мг, 108.6 мкмоль), Et₃N (5 мкл) и дополнительно перемешивают 1 ч при 25°С. Продукт осаждают и многократно промывают 50%-ым EtOH, затем последовательно промывают 50, 75 и 87.5%-ым раствором EtOH в воде и 96%-ным EtOH, высушивают в вакууме.

Пример 4. Получение матрицы ячеек кросс-сшитой модифицированной агарозы.

К полученной в Примере 3 метакрилатполигликолькарбоксиметилагарозе добавляют раствор бензофенона (2.5 мг, 0.35 мкмоль) и N,N'-метилен-бисакриламида (5 мг, 32.4 мкмоль) в DMF (250 мкл), перемешивают 20 мин, добавляют воду (250 мкл) и снова перемешивают. Полученный раствор модифицированной агарозы используют для капельного нанесения иглой робота-манипулятора (QArray, Genetix, Англия) на подготовленную полимерную подложку. Подложку с матрицей агарозных капель охлаждают при -18°С в течение 30 мин. Затем подложку с ячейками облучают УФ-светом с помощью осветителя люминесцентного ОИ-18А с кварцевой ртутной лампой сверхвысокого давления ДРК-120 в течение 12 мин, после чего многократно промывают смесью диоксан/DMF (1:1).

Пример 5. Активация карбоксильных групп в агарозных ячейках.

Над ячейками на подложке формируют разборную камеру объемом 25 мкл. В камеру вносят 0.1М раствор активатора TSTU и 0.1М раствор диизопропилэтиламина (DIPEA) в 25 мкл смеси диоксан/DMF (1:1), инкубируют 1 ч при комнатной температуре, раствор удаляют, промывают смесью диоксан/DMF (1:1).

Пример 6. Иммобилизация красителя и олигонуклеотидов.

В камеру вносят 25 мкл раствора красителя NH₂-Cy5 или пары олигонуклеотидов SEQ ID NO; 1 и SEQ ID NO:2, каждый в концентрации 1 мкМ в 0.1 М карбонатном буфере (рН 9.2), инкубируют при 4°С в течение ночи, удаляют раствор, многократно промывают 30%-ным ацетонитрилом в 0.1 М триэтиламмонийацетатном (ТЕАА) буфере (рН 7.0).

Пример 7. Отщепление красителя от агарозных ячеек.

Подложку с агарозными ячейками, в которых иммобилизован краситель Су5, используют для изготовления неразборного пленочного чипа. Через отверстие в крышке в камеру подают ТЕ-буфер (рН 8.0), прогревают при 95°С. Флуоресцентные сигналы ячеек до и после прогрева регистрируют через крышку и слой жидкости при комнатной температуре на специализированном анализаторе биочипов (Мифтахов Р.А., Лапа С.А., Шершов В.Е., Заседателева О.А., Гусейнов Т.О., Спицын М.А., Кузнецова В.Е., Мамаев Д.Д., Лысов Ю.П., Барский В.Е., Тимофеев Э.Н., Заседателев А.С., Чудинов А.В. Биофизика. 2018. Т. 63. С.661-668) разработки ИМБ РАН (Россия) при длине волны возбуждения, соответствующей Су5 (650 нм), и запирающем фильтре 716 нм (Фигура 6).

Пример 8. Проведение ПЦР с олигонуклеотидами, отщепившимися от агарозных ячеек.

Для изготовления пленочного чипа используют подложку с иммобилизованными в агарозных ячейках олигонуклеотидами. Камеру чипа через отверстия в крышке заполняют реакционной смесью (30 мкл), которая содержит 1.5 ед. Taq-полимеразы (Thermo Scientific, США) в буфере той же фирмы, dNTP в концентрации 400 мкМ каждого и геномную ДНК человека в количестве 10 нг в качестве матрицы. Реакцию проводят на ДНК-амплификаторе TGradient (Biometra, США) для in situ ПЦР при следующих условиях: 95°С - 3 мин (начальная денатурация); 36 циклов: 95°С - 20 с, 60°С - 30 с, 72°С - 40 с; далее 72°С - 5 мин (завершающая инкубация). Реакционную смесь через отверстия в крышке извлекают из чипа, упаривают в вакууме досуха, растворяют в минимальном объеме деионизированной H₂O и анализируют методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле с окрашиванием SYBR Green.

Настоящее изобретение относится к способу получения гидрогеля с иммобилизованными нуклеиновыми кислотами, включающему: а) изготовление твердой полимерной подложки из полиэтилентерефталата с фотоактивной поверхностью; б) получение ячеек кросс-сшитой модифицированной агарозы: гидрогелиевых ячеек, связанных ковалентными связями с полимерной подложкой, где модификацию агарозы проводят хлоруксусной кислотой в щелочных условиях с последующим введением фрагмента метакриловой кислоты с помощью ангидрида метакриловой кислоты, а затем проводят обработку бромуксусной кислотой и триэтиламином с последующим образованием связанного с агарозой полигликолевого линкера с концевой карбоксильной группой; в) иммобилизация в гидрогелиевые ячейки нуклеиновых кислот. Настоящее изобретение обеспечивает разработку более эффективного способа изготовления полимерной подложки с фотоактивной поверхностью и введения в природный полимер, агарозу, химических групп, придающих агарозе новые дополнительные свойства, с сохранением способности к термозависимому фазовому переходу плавления-гелеобразования. 2 з.п. ф-лы, 7 ил., 8 пр.

1. Способ получения гидрогеля с иммобилизованными нуклеиновыми кислотами, включающий:

а) изготовление твердой полимерной подложки из полиэтилентерефтолата с фотоактивной поверхностью;

б) получение ячеек кросс-сшитой модифицированной агарозы: гидрогелиевых ячеек, связанных ковалентными связями с полимерной подложкой, где модификацию агарозы проводят хлоруксусной кислотой в щелочных условиях с последующим введением фрагмента метакриловой кислоты с помощью ангидрида метакриловой кислоты, а затем проводят обработку бромуксусной кислотой и триэтиламином с последующим образованием связанного с агарозой полигликолевого линкера с концевой карбоксильной группой;

в) иммобилизация в гидрогелиевые ячейки нуклеиновых кислот.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве нуклеиновых кислот используются олигонуклеотидные праймеры, содержащие аминолинкер.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что олигонуклеотидные праймеры являются термоотщепляемыми и могут участвовать в ПЦР в качестве праймеров.