СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОГО АНТИГЕНА ЦЕСТОД Российский патент 2003 года по МПК G01N33/531 A61K39/00 

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к иммунологической диагностике ларвальных цестодозов, а именно эхинококкозов. Может быть использовано для той же цели в медицине при эхинококкозе человека.

Цель изобретения сводится к использованию биотехнологического метода получения антигенов цестод.

Известны способы получения антигенов эхинококков с использованием традиционных физико-химических методов, включающих приобретение источника антигенного материала (цистная жидкость, половозрелая или личиночная формы паразита), экстрагирование антигена из гельминтного материала и его очистка от белков хозяина и неспецифических белковых примесей, снижающих специфичность диагностических антигенов, путем молекулярной фильтрации с последующей гель-фильтрацией на сефарозе 4В и выделением фракции с молекулярной массой 600 кДа (Баллад Н.Е. и др. "Способ диагностики альвеококкоза" АС 766583, 1980). Проводят также комбинацию гель-фильтрации на сефадексе (от Г-50 до Г-200) и ион-обменной хроматографии на ДЕАЕ-сефадексе А-50, позволяющей максимально очистить антигенный материал от белков хозяина и неспецифических примесей и значительно повысить специфичность диагностического антигена (Клименко В.В. и др., АС 1363564 от 1.IX-1987).

Недостатком этих способов является то, что каждый раз для приготовления диагностического антигена необходимо иметь большое количество исходного гельминтного материала, получение которого сопряжено с большими трудностями, поскольку требует наличия большого числа зараженных животных. Существенным недостатком при использовании в качестве источника антигена цистной жидкости является также то, что она содержит в своем составе белки хозяина, присутствие которых отрицательно сказывается на специфичности антигенных препаратов, поэтому требуется дополнительная очистка его от этих белков и других неспецифических примесей.

Наиболее близким к заявляемому техническим решением является получение экскреторно-секреторного антигена эхинококков, представляющего трехдневные продукты метаболизма протосколексов паразитов, помещенных в искусственную питательную среду (Worbes Н., 1989; Worbes H. et al., 1989).

К недостаткам этого способа так же, как и в первом случае, относится сложность получения большого количества жизнеспособных протосколексов паразита (связано с необходимостью наличия зараженных животных), а также их кратковременной жизнеспособностью в искусственных питательных средах (не более 3-5 дней).

Предлагаемый способ получения антигенов эхинококков основан на использовании клеточной технологии; антиген представляет собой диагностически активные метаболиты клеток протосколексов, культивируемых в искусственных питательных средах с добавлением необходимых факторов роста для активной пролиферации клеток в культуре. Способ включает следующие этапы:
1) приготовление первичной клеточной культуры протосколексов;
2) культивирование клеток протосколексов;
3) получение перевиваемой клеточной культуры;
4) отбор диагностически активных серий клеточных метаболитов ("клеточного" антигена).

Предварительную подготовку необходимой стеклянной посуды, инструментов, растворов и их стерилизацию проводили, согласно методик, применяющихся в вирусологии при работе с культурами клеток и тканей животных ("Методы культивирования клеток" под редакцией Г.П. Пинаева, 1988; "Биотехнология клеток животных" под редакцией Спиера и др., 1989; учебно-методическое пособие "Культура клеток и тканей животных". А. П. Дьяконов и др., 1978, 1980; "Биология клетки в культуре" под редакцией чл.-корр. АНСССР А.С. Трошина, 1984). Непосредственно для культивирования клеток использовали ассортимент пластиковой посуды одноразового использования (фирма "Flow"- Бельгия, "Costar" - США). Культивирование проводили в искусственных питательных средах RPMI-1640, DMEM, ИГЛА-МЕМ.

1. Приготовление первичной клеточной культуры.

Пример 1
Материалом для приготовления первичной клеточной культуры служили протосколексы Echinococcus granulosus, полученные из эхинококковых цист от зараженных овец в стерильном боксе. Гельминтный материал помещали в чашку Петри и отмывали физраствором с антибиотиками из расчета 180-200 ЕД/мл пенициллина и 0,8-1,0 мг/мл стрептомицина не менее 3-5 раз и дважды стерильным физраствором. Отмытый материал измельчали ножницами, фильтровали через мельничный газ (диаметр ячеек 1 мм) и подвергали нежной гомогенизации в течение 5-7 мин в ручном гомогенизаторе с добавлением 0,5-1,0 мл стерильного раствора Хенкса до получения однородной массы. Полученную гомогенную массу пропускали через фильтры с диаметром ячеек 220, 110 и 50 мкм. Процесс гомогенизации и выделения клеток повторяли 3-5 раз. Качество гомогенизации и определение жизнеспособности выделенных клеток проводили в камере Горяева после окрашивания 0,4% раствором трипанового синего при увеличении микроскопа 20Х10.

Полученную суспензию клеток помещали в стерильные центрифужные пробирки, добавляли физраствор с антибиотиками (по 500-1000 ЕД/мл пенициллина и 0,2-0,5 мг/мл стрептомицина) и центрифугировали при 1000-1200 об/мин в течение 5-7 мин. Процедуру отмывания клеток центрифугированием повторяли не менее 5-7 раз. Выход клеток после всех методических процедур проводили из расчета, что из 1 г сырого гельминтного материала получается не менее 38•10⁶ клеток. Подсчет жизнеспособных клеток проводили в камере Горяева по формуле:

После подсчета доводили их концентрацию в суспензии до 600-800 тыс./мл и вносили в ростовую среду.

2. Культивирование клеток протосколексов
Культивирование клеток протосколексов проводили в ростовой среде, представляющей смесь синтетической питательной среды RPMI-1640, 7-10% эмбриональной сыворотки телят крупного рогатого скота или сыворотки лошади, 2 мл альфа-глутамина, 50 мкл меркаптоэтанола и 8 мг гентамицина на 100 мл среды. Клеточную культуру помещали в СО₂-инкубатор с заданными параметрами температуры (35-37^oС) и поступления газов (СО₂ - 5%; O₂ - 95%) при 70% влажности в камере для культивирования.

3. Получение перевиваемой клеточной культуры
При соблюдении всей процедуры обработки гельминтного материала и получения жизнеспособных клеток на 7-10 день культивирования при активной пролиферации клеток в культуре наблюдали образование монослоя клеток. В этот период производили отбор продуктов жизнедеятельности (метаболитов) клеток и пересевали клетки в свежую порцию ростовой среды. Оставшиеся после пересева клетки подвергали криоконсервации в жидком азоте. При необходимости порцию замороженных клеток размораживали, проверяли их жизнеспособность и использовали для культивирования и получения "клеточного" антигена.

4. Отбор диагностически активных серий клеточных метаболитов ("клеточного" антигена)
Отбор активных в иммунодиагностических реакциях клеточных метаболитов протосколексов E. granulosus проводили с использованием активных сывороток, полученных от животных или людей, больных эхинококкозом (положительный контроль), сывороток клинически здоровых животных или людей - доноров (отрицательный контроль). Анализ отобранных серий метаболитов клеток проводили иммуноферментным тестом. Оценку реакции проводили на автоматическом ридере, активность испытуемых серий клеточных метаболитов оценивали по оптической плотности. Серии клеточных метаболитов, в которых оптическая плотность с положительными контрольными сыворотками была в пределах 0,464 и выше, а с отрицательными 0,180-0,230, относили к антигеноактивным. Серии метаболитов с установленной антигенной активностью собирали и использовали в дальнейших исследованиях для определения их диагностической эффективности. Хранили отобранные активные серии метаболитов клеток ("клеточный" антиген) при -20^oС.

5. Пример 2
Этапы получения "клеточного" антигена такие же, как в примере 1, но в качестве гельминтного материала использовали вторичные ларвоцисты E.multilocularis, выделенные от экспериментально зараженных белых крыс или белых мышей. Заражение лабораторных животных проводили внутрибрюшинно с помощью инъекционной иглы диаметром 0,5-0,8 мм в дозе 400-600 ацефалоцист E.multilocularis для крысы и 200-250 - для мыши. От зараженных животных через 4-6 мес получали вторичные ларвоцисты, из которых в дальнейшем готовили первичную клеточную культуру, проводили культивирование, получали перевиваемую клеточную культуру и проводили отбор диагностически активных серий клеточных метаболитов ("клеточного" антигена), как описано в примере 1.

Примеры конкретного исполнения
6. Пример 1. Диагностическую эффективность отобранных антигеноактивных серий клеточных метаболитов ("клеточного" антигена) протосколексов E.granulosus оценили с 114 пробами сывороток свиней, в том числе зараженных E. granulosus - 31 проба, тенуикольным цистицеркозом - 18, аскариозом - 15, трихинеллезом - 14 и клинически здоровых - 36. Результаты исследования представлены в таблице 1.

Пример 2. Диагностическую эффективность "клеточного" антигена протосколексов E. granulosus оценили с 125 сыворотками людей, в том числе зараженных E. granulosus - 43, T.canis "larva migrans" - 10, T.spiralis - 5, C. cellulosae - 2, сывороток доноров - 65. Результаты исследований представлены в таблице 2.

Анализ данных по оценке диагностической эффективности "клеточного" антигена протосколексов эхинококков (E.granulosus и E.multilocularis) в иммуноферментной реакции свидетельствует о достаточно высокой чувствительности и специфичности исследуемого антигена, что дает основание применять его в качестве универсального диагностикума при эхинококкозе любых животных и человека.

Источники информации
1. Баллад Н.Е. и др. "Способ диагностики альвеококкоза". АС 766583, кл. А 61 В 10/00, 1980.

2. Клименко В.В., Белозеров С.Н., Шеховцов Н.В. "Способ получения эхинококкового диагностического антигена для иммуноферментного анализа".

3. Методы культивирования клеток.(Сборник научных трудов), Ленинград, изд-во "Наука".-1988.- 320 с.

4. Спиер Р.Е., Адамс Г.Д., Гриффитс Дж.Б. Биотехнология клеток животных. Т2 (перевод с англ. В.М. Тарасенко, под редакцией Г.А. Сафонова).-1989.-520 с.

5. Биология клетки в культуре. Ленинград, изд-во "Наука".-1984.-274 с.

6. Дьяконов Л.П., Поздняков А.А., Панкова Г.Е. и др. "Методические рекомендации по получению, культивированию и использованию в производственных ветеринарных лабораториях первичных и диплоидных культур животного происхождения".- М., 1978.-8 с.

7. Дьяконов Л. П. , Поздняков А.А., Панкова Г.Е. и др. "Методические указания по криоконсервированию культур клеток животного происхлждения в жидком азоте".- М.,-1978.-9 с.

8. Дьяконов Л. П., Глухов В.Ф., Поздняков А.А. и др. Культура клеток и тканей животных: Учебно-методическое пособие./Ставрополь, 1980.-9 с.

9. Worbes H. Echinococcus granulosus control in Erfurt region (GDR) using ELISA to diagnose canine echinococcosis.//13^th Conf.WAAVP, August 7-11.-1989, Berlin, GDR. Progr. and Abstracts.-Berlin.-1989.

10. Worbes H., Thompson R.C.A., Eckert J. Occurence of the cattle strain Echinococcus granulosus in the German Democratic Republic.//Parasitology Research.-1989.-V.75.-N 6.-P.495-497.

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к иммунологической диагностике ларвальных цестодозов, а именно эхинококкозов. Предложенный способ предусматривает одномоментное приготовление первичной клеточной культуры из протосколексов цестод, культивирование клеток протосколексов. Далее проводят получение перевиваемой клеточной культуры и отбор диагностически активных серий клеточных метаболитов с использованием иммуноферментной реакции. Также способ предусматривает возможность криоконсервирования клеток перевиваемой культуры после стадии ее получения. Предложенный способ позволяет получать антиген с чувствительностью 87,09-95,30% и специфичностью 81,9-90,2%. Способ может быть использован в медицине для получения высокочувствительного и высокоспецифичного антигена для диагностики эхинококкозов. 2 табл.

Способ получения диагностического антигена цестод, предусматривающий одномоментное приготовление первичной клеточной культуры из протосколексов цестод, культивирование клеток протосколексов, получение перевиваемой клеточной культуры и отбор диагностически активных серий клеточных метаболитов с использованием иммуноферментной реакции и с возможностью криоконсервирования клеток перевиваемой культуры после стадии ее получения.