СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТЕФАРИНА СУЛЬФАТА В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК РАСТЕНИЯ СТЕФАНИЯ ГЛАДКАЯ Российский патент 2010 года по МПК C12N5/04 A01H4/00 

Описание патента на изобретение RU2399665C1

Изобретение относится к биотехнологической промышленности и касается получения субстанции медицинского препарата - стефаглабрина сульфата из культуры клеток растения стефания гладкая.

Стефарина сульфат - сульфат изохинолинового проапорфинового алкалоида стефарина, выделенного из стефании гладкой [Stephania glabra (Roxb.) Miers, сем. лукосемянниковых (Menispermaceae)] - многолетнего тропического травянистого растения. Это растение произрастает в субтропических и тропических горных районах Южного Китая, Японии, Бирмы, Вьетнама, Индии. В СССР были предприняты попытки интродукции данного растения в субтропиках Закавказья, однако они успеха не имели.

Стефарина сульфат имеет формулу (C18H19NO3)2·H2SO4

Представляет собой белый кристаллический порошок, с температурой плавления (247-252)°С с разложением, растворим в воде и водном спирте. Является субстанцией лекарственного средства, названного стефаглабрина сульфатом (Stephaglabrini sulfas).

Известно использование стефаглабрина сульфата (0,25% водный раствор) в медицинской практике в качестве антихолиноэстеразного средства (авторское свидетельство СССР №315388, 1963 г.).

Известно, что стефаглабрин сульфат обладает специфической ингибирующей активностью на развитие соединительной ткани, предотвращая образование рубца при повреждении нерва, и может быть применен в качестве средства для лечения травматических и послеоперационных повреждений периферической нервной системы (патент СССР №1713151, 1985 г.).

В мире многие лекарственные средства, ароматические вещества, пищевые добавки и другие ценные вещества получают из природного растительного сырья. Около 30% всех применяемых лекарств содержат вещества специализированного обмена растений - вторичные метаболиты.

Их получают обычно экстракцией из растений, большинство которых относятся к экзотическим и исчезающим видам, произрастающим в труднодоступных районах с нерегулируемой климатической, экологической и даже политической обстановкой, не гарантирующей стабильной поставки и качества сырья. Плантационный способ выращивания растений, очевидно, не устраняет некоторых природных неблагоприятных условий и вместе с тем требует больших земельных площадей особого характера с возможным альтернативным использованием. В результате этот способ часто оказывается нерентабельным, а получаемое сырье, как правило, содержит ряд вредных примесей - гербицидов, пестицидов, радионуклеидов и других загрязнителей.

Так, известен способ получения стефаглабрина из растительного сырья, включающий экстракцию корневищ растения стефания гладкая ксилолом в щелочной среде, дальнейшую обработку серной кислотой, растворение осадка в спирте, добавление соляной кислоты, извлечение целевого продукта хлороформом с последующим добавлением серной кислоты и кристаллизацией (авторское свидетельство СССР №315387, 1977 г.). Один из основных недостатков этого способа состоит в дефиците исходного сырья.

Недостатки известных способов получения биологически активных соединений экстракцией из растительного сырья устраняются при получении их из биомассы клеток растений путем выращивания клеток растений в культуре.

В культуру вводят клетки из различных органов растения: корня, листа, черенка, стебля, цветоноса и т.д. Доказана способность культур растительных клеток к синтезу веществ, присущих интактному растению, при этом некоторые растительные клетки продуцируют их в количествах даже больших, чем материнское растение. Поэтому культуры клеток растений представляют интерес как источник получения различных веществ для фармацевтической, парфюмерно-косметической, пищевой и химической промышленностей. Этот альтернативный способ получения ценных веществ растительного происхождения имеет следующие преимущества:

- гарантированное получение растительной биомассы в требуемом количестве с заданными характеристиками независимо от сезона, климатических и погодных условий;

- практически абсолютная экологическая чистота производства биомассы культуры клеток и отсутствие в ней поллютантов;

- более короткие сроки накопления биомассы, которые в культуре составляют несколько недель, а в природе - до 10 лет, при этом содержание целевых веществ в культуре клеток может быть не ниже, чем в растении;

- возможность синтеза в культуре клеток новых веществ, не образуемых в растениях в природных условиях;

- возможность использования для получения биомассы клеток индустриальных биотехнологических приемов и оборудования.

Известен способ получения стефарина сульфата при глубинном культивировании с использованием культивируемых клеток растения стефания гладкая (патент РФ №2089610, 1997 г.).

Согласно указанному способу клетки выращивают на питательной среде в темноте, при температуре 26°С, влажности 70% в конических или плоскодонных колбах Эрленмейера на качалке со следующими техническими данными: эллипсоидная траектория движения платформы, амплитуда колебаний 5-7 мм, число оборотов в минуту 100.

Продолжительность цикла выращивания составляет 14 суток. В этот срок, соответствующий началу стационарной фазы, отделяют выращенную биомассу клеток от культуральной жидкости фильтрацией и высушивают, а затем выделяют стефарин из биомассы клеток.

Однако известный способ не применим в промышленных масштабах. Для того чтобы получать большие количества клеток с наименьшими затратами в условиях крупномасштабного производства, необходимо использовать метод глубинного культивирования растительных клеток с перемешиванием и аэрацией.

Однако особенностью морфологии клеток растений являются их большие размеры. Бактерии имеют размер в среднем 1-5 мкм, клетки животных - 20 мкм, растений - 20-60 мкм. Клетки растений в суспензии образуют агрегаты, состоящие от нескольких до сотен клеток, величина агрегатов может доходить до 1 см. Из-за крупных размеров и особых свойств своих оболочек суспензионные культуры клеток растений подвержены травмированию от сдвигового стресса, что является особенностью культивирования и создает трудности при реализации процесса.

Сдвиговый стресс, часто называемый также турбулентным или гидродинамическим стрессом, вызывает смещение параллельных слоев жидкости относительно друг друга. Сдвиг образуется от движения как лопастей мешалки в биореакторе, так и пузырьков газа. Клетки по-разному реагируют на сдвиг. Многие крайне чувствительны к нему, другие довольно толерантны, что позволяет культивировать последние в биореакторах с мешалкой. Но и в этом случае с увеличением сдвига (например, числа оборотов мешалки и/или ее размера) распадаются агрегаты клеток, снижается биосинтетическая и пролиферативная активность клеток, часто происходит их деформация и/или разрыв мембраны клеток, что в конце концов ведет к их гибели.

Сдвиг в биореакторах вызывается также аэрирующим воздухом, однако, значительно меньше, чем мешалкой.

Мощности, вводимые в биореактор для культивирования других микроорганизмов, создают такой уровень сдвигового стресса, который не выдерживают клетки растений. Для их культивирования уровень стресса в биореакторе должен быть ниже.

Понизить вводимую мощность можно, базируясь на меньшей потребности культур клеток растений в кислороде. Показателем обеспечения культуры кислородом служит так называемый общий объемный коэффициент массопередачи кислорода из газа в жидкость.

Таким образом, чтобы добиться максимального выхода целевого продукта, что составляет суть проблемы оптимизации технологического процесса культивирования клеток как в одном отдельно взятом биореакторе, так и при масштабном переходе от лабораторных до промышленных биореакторов при культивировании клеток растений, необходимо создать в биореакторе такие условия аэрации и перемешивания, при которых клетки будут находиться во взвешенном состоянии, не будут травмироваться и при этом будет обеспечен требуемый коэффициент массопередачи кислорода.

Наиболее близким к предлагаемому является способ культивирования стефании гладкой, описанный в работе: Т.А.Савина и др. «Опыт масштабирования от колб к лабораторным ферментаторам процесса выращивания клеток - продуцентов алкалоида стефарина». Тез. докл. III межд. конф. «Биология культивируемых клеток растений и биотехнология». Алматы, 1983, с.193. Согласно этому способу осуществляли глубинное культивирование клеток на питательной среде в биореакторе при перемешивании и аэрации культуральной суспензии путем подачи воздуха в биореактор через барботер.

Клетки культивировали в стандартном лабораторном биореакторе АНКУМ-2М вместимостью 14 л, оснащенном механической мешалкой и барботером для воздуха.

Однако и в данном способе имеет место наличие механического и гидродинамического стресса на клетки от мешалки, отрицательное влияние которого на ростовую и биосинтетическую активность клеток возрастает с увеличением масштаба биореактора. Даже в аппарате такой малой емкости, как 14 л, выход сухой биомассы клеток по сравнению с колбами снизился на величину до 30%.

Постоянное поддержание оптимального значения коэффициента массопередачи по расчету на конечную максимальную концентрацию клеток в известном способе требует больших расходов воздуха, вызывающих недопустимое пенообразование, с которым трудно или даже невозможно бороться.

Величина коэффициента массопередачи зависит, кроме свойств жидкости, более всего от конфигурации биореактора и гидродинамического режима в нем. В конкретном биореакторе при определенном объеме заполнения эта величина определяется двумя параметрами его работы, которыми можно управлять: числом оборотов мешалки и расходом воздуха.

Технической задачей настоящего изобретения является создание способа получения стефарина сульфата в культуре клеток растения стефания гладкая, при котором наличие механического и гидродинамического стресса на клетки минимально, клетки находятся во взвешенном состоянии и не травмируются, что, в конечном счете, ведет к получению высокого выхода целевого продукта.

Для решения этой задачи в способе получения стефарина сульфата из культуры клеток растения стефания гладкая, включающем глубинное культивирование клеток на питательной среде в биореакторе при перемешивании, аэрацию культуральной суспезии путем барботажа воздуха и накопление целевого продукта, контролируют изменение концентрации клеток в культуральной суспензии и устанавливают расход воздуха в соответствии с этой концентрацией.

При этом концентрацию клеток в культуральной суспензии определяют путем отбора проб. Величину расхода воздуха предпочтительно определять по уравнению обратной функции коэффициента массопередачи от расхода воздуха в данном аппарате. Требуемый коэффициент массопередачи при этом рассчитывают из отношения величины концентрации клеток, умноженной на их удельную дыхательную активность, к разности между равновесной и оптимальной концентрациями кислорода в данной культуре.

Расход воздуха V определяют по формуле:

где X - текущая концентрация клеток,

q - их удельная дыхательная активность,

Cpопт - разность между равновесной и оптимальной концентрациями кислорода в культуральной жидкости,

a, b - эмпирические параметры, которые определяются особенностями конструкции биореактора.

Наиболее оптимально вести процесс, осуществляя перемешивание в биореакторе путем вертикальной циркуляции, одним из известных и применимых в данном случае конструктивных приемов, например, с помощью вертикального цилиндра или диффузора.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

В биореакторе без мешалки, например стандартном биореакторе-ферментаторе бакового типа, осуществляют глубинное культивирование клеток растения стефания гладкая на питательной среде следующего состава, мг/л:

Макросоли: аммоний азотнокислый 1700 калий азотнокислый 1800 калий фосфорнокислый однозамещенный 234 кальций хлористый 64 магний сернокислый 7-водный 850 Микроэлементы: калий йодистый 0,83 кобальт двухлористый 6-водный 0,025 кислота борная 6,2 марганец сернокислый 4-водный 22,3 медь сернокислая 5-водная 0,025 натрий молибденовокислый 2-водный 0,25 цинк сернокислый 7-водный 8,5 Хелат железа: железо сернокислое 7-водное 27,8 этилендиаминтетраацетат натрия 3,?3 Регуляторы роста: кислота α-нафтилуксусная 0,5 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота 0,1 пантотенат кальция 2 тиамина хлорид 2 Источники углерода: пищевой сахар 50·103

В стерильный аппарат со стерильной средой, выведенный на заданный температурный режим (26±1)°С, вносят инокулят, в качестве которого используют клетки, выращиваемые в конических колбах при встряхивании на шейкере в темноте при (26±1)°С в течение 2-х недель. Объем инокулята - 20% клеточной суспензии (пополам со свежей питательной средой), что соответствует посевной дозе 30 г/л сырой биомассы.

Включают минимально необходимую подачу воздуха и начинают процесс культивирования с периодическим отбором проб для определения текущей концентрации клеток. По мере ее возрастания увеличивают подачу воздуха.

В ходе всего процесса культивирования необходимо постоянно контролировать скорость подачи воздуха в биореактор и увеличивать ее при необходимости до величины, обеспечивающей потребность растущей культуры в кислороде. Эту величину определяют расчетным путем, имея данные по удельной дыхательной активности, по концентрации клеток в контролируемый момент, а также зависимость в численном виде коэффициента массопередачи кислорода в данном биореакторе от интенсивности подачи воздуха.

Следующие примеры иллюстрируют предлагаемый способ, не ограничивая его.

Пример 1

Суспензию клеток растения стефания гладкая культивировали периодическим способом в биореакторе вместимостью 100 л, используя стандартный ферментатор БИОР-01 (производство ОКБ г.Кириши) без мешалки, но с направляющим цилиндром. В стерильный аппарат со стерильной средой (55 л) описанного выше состава, выведенный на заданный температурный режим (26±1)°C, вносили инокулят, в качестве которого использовали клетки, выращиваемые в конических колбах емкостью 750 мл (объем заполнения 200 мл) при встряхивании на шейкере (150 об/мин) в темноте при (26±1)°C в течение 2-х недель. Объем инокулята - 15 л клеточной суспензии (пополам со свежей питательной средой), что соответствует посевной дозе 30 г/л сырой биомассы.

Включали минимально необходимую подачу воздуха и начинали процесс культивирования с периодическим отбором проб для определения текущей концентрации клеток. По мере ее возрастания увеличивали подачу воздуха. При общей продолжительности культивирования клеток до 14 суток расход воздуха увеличивали практически линейно от 60 л/ч до 1,3 м3/ч в конце цикла.

Требуемый расход воздуха рассчитывали по уравнению:

.

где X - текущая концентрация клеток, q - их удельная дыхательная активность, Cp и Сопт - равновесная и оптимальная концентрации кислорода в культуральной жидкости соответственно, a, b - эмпирические параметры, которые определяются особенностями конструкции аппарата.

В данном аппарате проведено более 10 процессов культивирования с выходом клеток по сырой биомассе до 300 г/л, по сухой биомассе - до 20 г/л при доле живых клеток до 90%. Содержание алкалоида в клетках составляло в среднем 0,25% от сухой биомассы. Эти показатели достоверно не отличаются от тех, которые наблюдаются при культивировании клеток в шейкерных колбах, что доказано методами математической статистики. Чрезмерного пенообразования и травмирования клеток в опыте не наблюдали.

Пример 2

Аналогично описанному в предыдущем примере провели культивирование суспензии клеток стефании гладкой в ферментаторе БИОР 01 (ОКБ г.Кириши), оснащенном штатной турбинной мешалкой с числом оборотов 150 мин-1. Объем среды, инокулята, температура, профиль подачи воздуха были одинаковы, как в аппарате без мешалки. За 12 суток культивирования в ферментаторе с мешалкой роста клеток не наблюдалось, а доля живых клеток снизилась до 10%. Условия культивирования признаны непригодными.

Опыт повторили в ферментаторе того же типа вместимостью 250 л (БИОР025) с мешалкой 100 об/мин. Уже к концу 5-х суток культивирования биомасса клеток уменьшилась по отношению к исходной в 1,7 раза, а доля живых клеток - в 1,5 раза.

Пример 3

Результаты нескольких опытов по культивированию клеток стефании гладкой в барботажном биореакторе емкостью 20 л без мешалки с переменным расходом аэрирующего воздуха от 1,5 до 15 л/мин при остальных условиях культивирования (культура клеток, питательная среда, температура, освещенность, длительность культивирования) тех же, что и в примере 1, показали, что выход биомассы на единицу объема культуры был в 1,3 раза ниже, а содержание в ней стефарина - в 1,6 раза меньше, чем в шейкерных колбах. Кроме того, в опытах с барботажем культуры клеток стефании гладкой отмечено, что клетки в большой массе оседают у дна биореактора, что, возможно, разрушает их структуру и ухудшает процессы массопередачи кислорода и питательных веществ между клетками и культуральной жидкостью.

Похожие патенты RU2399665C1

название год авторы номер документа
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТЕФАРИНА СУЛЬФАТА В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК РАСТЕНИЯ СТЕФАНИЯ ГЛАДКАЯ 2009
  • Башашкина Елена Валерьевна
  • Дудник Наталья Викторовна
  • Зайцева Галина Васильевна
  • Мошкин Андрей Германович
  • Строгов Семен Ефимович
  • Туркин Владимир Васильевич
  • Лапшова Екатерина Ивановна
  • Воробьев Сергей Викторович
RU2399666C1
ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК РАСТЕНИЯ СТЕФАНИЯ ГЛАДКАЯ (Stephania glabra (Roxb) Miers) ИФР Sg 113 - ПРОДУЦЕНТ СТЕФАРИНА И СПОСОБ ЕГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ В БИОРЕАКТОРЕ 2008
  • Осипова Елена Александровна
  • Носов Александр Михайлович
  • Решетняк Оксана Владимировна
  • Титова Мария Владимировна
  • Шумило Николай Анатольевич
RU2377296C1
ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК РАСТЕНИЙЙ STEPHANIA GLABRA (ROXB) MIERS - ПРОДУЦЕНТ СТЕФАРИНА 1994
RU2089610C1
ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК РАСТЕНИЯ СТЕФАНИЯ ГЛАДКАЯ ИФР Sg 26127 (STEPHANIA GLABRA (ROXB.) MIERS) В УСЛОВИЯХ IN VITRO - ПРОДУЦЕНТ СТЕФАРИНА 2011
  • Осипова Елена Александровна
  • Носов Александр Михайлович
  • Решетняк Оксана Владимировна
  • Титова Мария Владимировна
  • Шумило Николай Анатольевич
RU2453598C1
Способ получения биологически активных веществ в клеточной культуре Conium maculatum L. (болиголова пятнистого) 2015
  • Филонова Мария Васильевна
  • Шилова Инесса Владимировна
  • Медведева Юлия Валериевна
  • Карначук Ольга Викторовна
  • Чурин Алексей Александрович
  • Суслов Николай Иннокентьевич
RU2619182C1
ФЕРМЕНТАЦИОННАЯ УСТАНОВКА ДЛЯ МЕТАНАССИМИЛИРУЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ 2015
  • Лалова Маргарита Витальевна
  • Миркин Михаил Григорьевич
  • Найдин Анатолий Владимирович
  • Сафонов Александр Иванович
  • Бабурченкова Ольга Александровна
RU2580646C1
Биореактор для выращивания метанутилизирующих микроорганизмов 2016
RU2607782C1
Способ получения микрорастений лекарственного растения Stephania glabra (Roxb.) Miers 2021
  • Горпенченко Татьяна Юрьевна
  • Верещагина Юлия Витальевна
  • Чернодед Галина Кирилловна
RU2757318C1
Способ получения @ -лизина 1976
  • Руклиша М.П.
  • Саксе А.К.
  • Виеструр У.Э.
  • Хелманис Р.А.
  • Селга С.Э.
  • Лаукевиц Я.Я.
  • Седвалдс А.К.
  • Лиепа Я.Б.
  • Рейнбаха Е.Ф.
  • Удровский Г.А.
  • Богданович В.М.
  • Лацарс А.А.
  • Датава И.У.
SU666874A1
АППАРАТ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МЕТАНОКИСЛЯЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ 2015
  • Кочетков Владимир Михайлович
  • Кустов Александр Васильевич
  • Лалова Маргарита Витальевна
  • Миркин Михаил Григорьевич
  • Найдин Анатолий Владимирович
  • Потапов Сергей Сергеевич
RU2585666C1

Реферат патента 2010 года СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТЕФАРИНА СУЛЬФАТА В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК РАСТЕНИЯ СТЕФАНИЯ ГЛАДКАЯ

Клетки растения стефания гладкая культивируют в биореакторе при перемешивании и аэрации культуральной суспензии путем подачи воздуха через барботер. Контроль изменения концентрации клеток в суспензии и подача воздуха в соответствии с этой концентрацией позволяют минимизировать влияние механического и гидродинамического стресса на клетки, что приводит к увеличению выхода из культуры стефарина сульфата. 3 з.п. ф-лы.

Формула изобретения RU 2 399 665 C1

1. Способ получения стефарина сульфата из культуры клеток растения стефания гладкая, включающий глубинное культивирование клеток на питательной среде в биореакторе при перемешивании и аэрации культуральной суспензии путем подачи воздуха через барботер в биореактор, и накопление целевого продукта, отличающийся тем, что в процессе культивирования контролируют изменение концентрации клеток в культуральной суспензии и устанавливают расход воздуха в соответствии с этой концентрацией.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что расход воздуха определяют по формуле:
,
где V - расход воздуха
Х - текущая концентрация клеток
q - удельная дыхательная активность клеток
Сропт - разность между равновесной и оптимальной концентрациями кислорода в культуральной суспензии
a, b - эмпирические параметры, которые определяются особенностями конструкции биореактора.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрацию клеток в культуральной суспензии определяют путем систематического отбора проб.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что перемешивание в биореакторе осуществляют путем организации вертикальной циркуляции культуральной суспензии с помощью направляющего цилиндра.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2010 года RU2399665C1

ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК РАСТЕНИЙЙ STEPHANIA GLABRA (ROXB) MIERS - ПРОДУЦЕНТ СТЕФАРИНА 1994
RU2089610C1
Способ получения стефаглабрина 1963
  • Бережинская В.В.
  • Ильинская Т.Н.
  • Кибальчич П.Н.
  • Кузовков А.Д.
  • Рабинович И.М.
  • Трутнева Е.А.
  • Щелкова И.И.
SU315387A1
KR 960015968 B1, 25.11.1996
Очаг для массовой варки пищи, выпечки хлеба и кипячения воды 1921
  • Богач Б.И.
SU4A1
Аппарат для очищения воды при помощи химических реактивов 1917
  • Гордон И.Д.
SU2A1

RU 2 399 665 C1

Авторы

Башашкина Елена Валерьевна

Дудник Наталья Викторовна

Зайцева Галина Васильевна

Мошкин Андрей Германович

Строгов Семен Ефимович

Туркин Владимир Васильевич

Лапшова Екатерина Ивановна

Воробьев Сергей Викторович

Даты

2010-09-20Публикация

2009-03-10Подача